一个基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮红/绿色泽的SNP 标记及其应用

摘要

本发明公开一个基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮红/绿色泽的SNP标记及其应用。一个基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮红/绿色泽的SNP标记p2_he_5060，该SNP标记的正向引物序列F1如SEQ ID NO.1所示，反向引物R1如SEQ ID NO.2所示，通过Kosambi函数计算该SNP标记与梨红/绿皮性状基因连锁距离为4.2cM。利用该SNP标记引物，对26个绿皮梨品种的皮色进行验证，92.3%梨品种的绿皮性状得到了验证，对12个红皮梨品种进行验证，其中83.3%红皮梨性状得到准确验证。所获得的该SNP标记，极大地推动梨遗传育种的研究，也加速品种改良进程，提高育种效率具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，涉及一个基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果皮 红/绿色泽的SNP标记及其应用。

背景技术

果皮的色泽是果实外观品质的核心指标，也是影响其商品价值的重要因素。 目前世界上主要梨栽培种中只有西洋梨具有较多的红皮品种，而我国栽培的梨品 种主要归属于白梨、砂梨、秋子梨和新疆梨四大栽培种，这些品种果皮多为绿色、 黄色和褐色，而外观品质佳的红梨品种较少。为了满足消费市场的需求，我国引 进了部分红色西洋梨品种，由于气候和西洋梨自身的生态适应性等原因，其栽培 范围受到极大的限制，目前尚不能解决国内市场对红皮梨需求旺盛的矛盾。因此， 开展适合我国种植、品质优良的红梨品种成为我国育种工作者的重要目标之一。

随着模式植物全基因组测序的完成，特别是大量SNP(单碱基扩增多态性)标 记的开发以及生物信息学的迅猛发展，应用关联分析方法发掘植物数量性状基因 已成为植物基因组学研究的热点之一。特别是梨全基因组测序的完成，以及大量 SNP标记的开发，通过全基因组范围的关联分析法，发掘梨数量性状基因成为基 因组学研究的必然趋势，通过对目标性状QTL范围内的SNP标记研究成为定位 目标性状基因的重要手段。近年来兴起的一种检测基因SNP的新技术——高分 辨率溶解曲线（HRM）技术，是在PCR反应的基础上，通过检测DNA双链熔解 过程中与其结合的饱和荧光染料的荧光信号值的变化所生成的不同形状的熔解 曲线来揭示核酸片段中的单碱基突变。利用HRM技术方法，开发可对目标基因 进行快速分型的SNP标记，为该基因的遗传和定位研究提供有效工具。

目前有关梨果实品质数量性状的定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是 针对抗病性，对梨果实红皮性状的SNP标记研究尚没有开展。因此，进行梨果 皮红色性状的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系， 对于梨果皮色泽的遗传改良，缩短育种进程、节约生产成本具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个基于高分辨率溶解曲线 （HRM）鉴定梨果皮红/绿色泽的SNP标记。

本发明的另一目的是提供该SNP标记的引物对。

本发明的又一目的是提供该SNP标记及其引物对的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一个基于高分辨率溶解曲线（HRM）鉴定梨果皮红/绿色泽的SNP标记 p2_he_5060，该SNP标记的正向引物序列F1如SEQ ID NO.1所示，反向引物 R1如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的SNP标记p2_he_5060在鉴定梨果皮红/绿色泽性状中的应用。

本发明所述的SNP标记p2_he_5060在梨分子育种中的应用。

本发明所述的SNP标记p2_he_5060的引物对，该SNP标记的正向引物序 列F1如SEQ ID NO.1所示，反向引物R1如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的SNP标记p2_he_5060的引物对在鉴定梨果皮红/绿色泽性状中 的应用。

本发明所述的SNP标记p2_he_5060的引物对在梨分子育种中的应用。

一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨品种果皮红/绿色泽的方法，采用SNP标 记p2_he_5060的正向引物F1及反向引物R1对红皮和绿皮对照梨品种以及待鉴 定梨品种进行高分辨率溶解曲线分析，通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线 与红皮和绿皮对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较，鉴定该梨品种含有红皮基 因型还是绿皮基因型。

其中，所述的红皮对照梨品种为‘八月红’，所述的绿皮对照梨品种为‘砀山 酥梨’。

梨果皮红/绿色性状鉴定的SNP分子标记的获得方法，包含下列步骤：

a）以果皮为红色的‘八月红’×果皮为绿色的‘砀山酥梨’F1代果皮色泽表现分 离的群体为试材，通过检测亲本及后代的SNP标记，利用Joinmap3.0作图软件 构建SNP标记遗传图谱，在此基础上利用色泽性状表型数据的关联分析，将控 制梨果皮红/绿色性状的主效位点定位到第5连锁群上；

b）在第5连锁群上选取与红色性状位点紧密连锁的1个SNP标记，利用 primer5.0软件，设计1对SNP标记引物，并进行验证；

c）利用设计的1对SNP标记引物对‘八月红’ב砀山酥梨’的94个杂种群体 进行高分辨率溶解曲线分析，通过对梨果皮红/绿性状的表型测定结果与HRM的 分型结果比较分析，获得可对红/绿皮色泽性状进行良好分型的SNP标记 p2_he_5060，其正向引物序列F1如SEQ ID NO.1所示，反向引物R1如SEQ ID  NO.2所示，扩增片段大小为206bp，通过Kosambi函数计算出该标记与梨红/ 绿皮性状基因连锁距离为4.2cM；

d）利用SNP标记p2_he_5060的引物，对38个梨栽培品种进行高分辨率溶 解曲线分析，其中包含12个红皮梨、26个绿皮梨。10个梨品种的红皮色泽性状 得到了验证，鉴定的准确率为83.3%；24个梨品种的绿皮色泽性状得到了很好的 验证，鉴定的准确率为92.3%。选取‘八月红’、‘砀山酥梨’、‘火把梨’和‘京白梨’4 个梨品种进行测序分析，引物扩增序列中出现了4个单核苷酸的变化，其中3 处发生颠换C-G，A-T，T-G，1处发生转换C-T，证明该标记可以作为梨果皮红 /绿色泽性状基因的标记。

有益效果：

(1)本发明首次对梨果皮红/绿色性状进行了全基因组范围SNP标记关联分析 及QTL定位，这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础 和必要的前提。

(2)本发明中确定了与梨果皮红/绿色性状连锁的SNP标记，该标记与梨红/ 绿皮性状控制位点连锁距离为4.2cM。目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连 锁标记与目标性状的距离需≤5cM，因此该标记与目标位点表现为紧密连锁，这 对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。

(3)本发明中确定了SNP标记p2_he_5060可判断果皮红/绿色泽性状，鉴定 红皮色泽性状的准确性为83.3%，鉴定绿皮色泽性状的准确率为92.3%。该标记 具有良好的应用价值，能够有效的鉴定红皮和绿皮梨品种资源。

附图说明

图1为所开发的SNP标记p2_he_5060引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’ 及其94个后代中扩增的通道检测及熔解曲线。

通道检测中：H11为‘八月红’，H12为‘砀山酥梨’，其余94个通道为 ‘八月红’ב砀山酥梨’的F1杂交后代。熔解曲线：1，‘砀山酥梨’及部分 杂交后代，曲线呈蓝色；2，‘八月红’及部分杂交后代，曲线呈红色。

图2为所开发的SNP标记（p2_he_5060）引物在38个梨品种中扩增的通道 检测及熔解曲线。

通道检测中：其中，A1‐A12，B1，B3‐B6，B10‐B11，C2，C4，C6‐C7，C10‐C11， D2为绿皮梨，其余为红皮梨。熔解曲线：1：检测结果为绿皮梨，曲线呈蓝色； 2：检测结果为红皮梨，曲线呈红色。

图3为所开发的SNP标记p2_he_5060引物在4个梨品种上的扩增序列比对 结果，发现存在4处单核苷酸变化（用星号标注碱基位置），其中3处发生颠换 （C‐G第37bp，A‐T第38bp，T‐G第168bp），1处发生转换（C‐T第155bp）。

具体实施方式

实施例1

a）利用梨品种‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交获得其94株F₁后代单株。

b）利用高通量测序方法，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行酶切位 点测序分析，并统计分析在亲本间具有多态性的SNP位点在后代群体中的遗传 类型。利用χ²测验分析各标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔分离比例，偏分 离的在标记末尾用“*”标注。

c）用Joinmap3.0分析软件构建梨的SNP分子遗传连锁图谱。

d）通过高密度SNP标记的关联分析，将控制梨果皮红色性状的主效QTL定 位到第5连锁群上。

e）在第5连锁群上选取与该QTL紧密连锁的1个SNP标记开发引物。

依据梨全基因组序列（http://peargenome.njau.edu.cn/）搜索到该SNP标记的序 列信息，选取其前后200bp的核苷酸序列，依据引物设计原则，应用Primer5.0 设计软件，设计了1对SNP标记的引物（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）。利用 设计的1对SNP标记引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’的基因组DNA上进行PCR扩 增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。因此，该引物可作为梨果皮红/ 绿色泽性状的SNP分子标记。

f）利用HRM技术鉴定与梨果皮红色性状紧密连锁的标记。

利用e）步骤中得到的SNP标记引物对‘八月红’ב砀山酥梨’的94个杂种群体 进行HRM分析（图1）。通过对梨果皮红/绿性状的表型测定结果与HRM分型结 果的比较分析，获得可对红皮性状进行良好分型的SNP标记p2_he_5060，其正 向引物：5'‐GTCGGCTAACCTAAAAAGCCC‐3'（SEQ ID NO.1），反向引物：5'‐ CCCTCAATAACACAGTTCTTTGCAT‐3'（SEQ ID NO.2），扩增片段大小为206bp。通 过Kosambi函数计算出该标记与梨红皮性状的遗传距离为4.2cM。

HRM反应体系按照480High Resolution Melting Master试剂盒 中的说明书进行，HRM分析是在480Ⅱ荧光定量PCR仪（Roche） 上进行。10μL反应体系中含有2ng·μL^‐1DNA模板、1×Master Mix、2.0mmol·L^‐1MgCl₂、0.2mmol·L^‐1引物。扩增程序采用降落式PCR（touchdown PCR）：95℃ 预变性10min，然后95℃变性10s、60～55℃（每循环下降0.5℃）退火15s、 72℃延伸12s的程序进行45个循环。PCR循环结束后立即进行熔解，其程序 为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再从65℃连续升温至95℃，每升 高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃。最后，在480Ⅱ的 Gene Scanning软件中（1.5version）自动生成扩增产物的熔解曲线。

实施例2

利用筛选到的与梨果实绿皮色泽性状相连锁的SNP标记对38个梨栽培品种 进行进一步的验证（12个红皮梨，26个绿皮梨），以检测该方法在梨果实红皮、 绿皮性状分子辅助选择中的实用价值。利用SNP标记（p2_he_5060）引物，对 38个梨栽培品种的基因组DNA进行HRM分析。通过各个梨品种果皮色泽的表 型与HRM分型结果的比较分析进一步确定该SNP标记与梨果实红皮/绿皮色泽性 状相连锁。

通过HRM分析（图2），12个红皮梨品种中10个梨品种表现为红色基因型， 2个梨品种表现为绿皮基因型，表明83.3%的红皮梨品种果皮红色性状得到了验 证。因此，该SNP标记对梨红皮性状有很好的预测效果。

通过HRM分析（图2），26个红皮梨品种的检测结果中24个梨品种表现为 绿色基因型，2个梨品种表现为红皮基因型，92.3%的梨品种的绿皮性状得到了 验证。因此，该SNP标记对梨绿皮性状有很好的预测效果。

实施例3

通过实施例1、2中在‘八月红’、‘砀山酥梨’及F1杂交后代的分型，以及另 外的12个红皮、26绿皮梨品种的分型，选取‘八月红’（红皮梨）、‘砀山酥梨’ （绿皮梨）、‘火把梨’（红皮梨）和‘京白梨’（绿皮梨）4个梨品种进行测序分 析，进一步确定该SNP标记在红皮梨上存在4个单核苷酸位点的突变（图3）。

测序结果显示，该SNP标记的引物扩增产物为一段206bp的序列，其中红 皮梨‘八月红’和‘火把梨’的碱基序列完全一致；与非红皮梨品种的碱基序列存在4 个单核苷酸突变，其中3处发生颠换（C‐G第37bp，A‐T第38bp，T‐G第168bp）， 1处发生转换（C‐T第155bp）。因此，该SNP标记可以作为梨红/绿皮性状鉴定 的SNP标记。