一种提高灵敏度和特异性的定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种提高灵敏度和特异性的定量PCR方法，在PCR反应体系中加入荧光染料GelgreenI和热启动hTaq酶，所述的荧光染料GelgreenI能特异性地结合DNA双链而发出荧光信号。本发明提供的灵敏度高、特异性好的定量PCR方法，使用热启动hTaq酶，合适的镁离子浓度，能很好地抑制非特异性扩增，避免假阳性和高背景的结果，溶解曲线能获得单一峰；荧光染料GelgreenI价格低廉，使用方便，通用性好，灵敏度非常高，适用于qPCR技术；本发明为分子生物学研究提供了一种新的定量PCR方法。

说明书

技术领域

本发明涉及定量PCR技术领域，具体地说，是一种提高灵敏度和特异性的定量PCR方法。

背景技术

实时定量PCR（qPCR）就是在PCR扩增过程中，通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性分析的一种技术。qPCR技术与普通PCR技术的不同主要在于：普通的PCR人工参与的更多，数据可能不是特别准确，PCR结束后还需琼脂糖电泳检测；而qPCR是实时监控检测，无需后期电泳，因此qPCR具有检测时间短、操作简便、特异性高、重复性好、灵敏度高、分辨率高、检测范围较广、定量精确等优点。由于qPCR技术具备较多优点，现在已经应用到生命科学研究的各个领域，例如基因的差异表达分析、SNP检测、等位基因的检测、药物开发、临床诊断、转基因研究等。

qPCR的定量原理涉及到几个重要的参数：Ct值，阙值，基线。一般来说，第3～15个循环的荧光值就是基线。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。由于在PCR扩增的指数时期，DNA模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系（线性方程为Ct=-KlogN₀ +B，其中N₀是模板起始拷贝数），所以成为定量的依据。qPCR的定量又分为：绝对定量和相对定量。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

qPCR有两步法、三步法等多种方法，经典的三步法是变性、退火、延伸三步。两步法是将退火与延伸采用同一个温度将二者合并为一步，缩短实验时间，该方法对酶的要求较高，三步法得到的数据相对更准确。具体用哪一种方法，要结合引物退火温度、酶的特性、具体试验方案进行选择。

不管是绝对定量还是相对定量，用三步法还是两步法，qPCR技术的核心是扩增过程中有荧光发出，常用荧光染料有SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM或GeneFinder^TM，只有保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，才能确保检测灵敏度高，检测结果准确。在qPCR检测过程中经常碰到非特异性扩增问题，非特异性扩增就是扩增出了目的条带以外的条带，出现假阳性和高背景的结果。

因此，需要一种灵敏度高、特异性好的定量PCR方法，关于本发明的定量PCR方法，目前还未见有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提高灵敏度和特异性的定量PCR方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种提高灵敏度和特异性的定量PCR方法，在PCR反应体系中加入荧光染料Gelgreen I和热启动hTaq酶，所述的荧光染料Gelgreen I能特异性地结合DNA双链而发出荧光信号，而不结合DNA链的Gelgreen I 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

所述的荧光染料Gelgreen I的工作浓度为0.5×～1×，所述热启动hTaq酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL。

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、镁离子和无菌双蒸水。

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、正向引物、反向引物、dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、镁离子和无菌双蒸水。

所述的dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液或dCTP溶液的工作浓度为100～200μmol/L。

所述的PCR保护剂是小牛血清白蛋白、明胶、Tween 20或二硫苏糖醇。

所述的PCR保护剂更优选为小牛血清白蛋白。

本发明PCR反应体系中DNA模板量为：以25μL反应体系计，基因组10～1000ng，或者质粒1～30ng，或者RT-PCR反应后的cDNA 1～2μL；镁离子浓度为1.5～2.0mmol/L。

本发明优点在于：

本发明提供的灵敏度高、特异性好的定量PCR方法，使用热启动hTaq酶，合适的镁离子浓度，能很好地抑制非特异性扩增，避免假阳性和高背景的结果，溶解曲线能获得单一峰；荧光染料Gelgreen I 价格低廉，使用方便，通用性好，灵敏度非常高，适用于qPCR技术；本发明为分子生物学研究提供了一种新的定量PCR方法。

附图说明

附图1是qPCR反应的程序设置图。

附图2是qPCR的扩增曲线

附图3是qPCR的融解曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明实施例中所用荧光染料Gelgreen I购自上海吉泰远成生物科技有限公司；热启动hTaq酶购自New England Biolabs(NEB)公司；PCR缓冲液、dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液均购自上海吉泰远成生物科技有限公司；正向引物、反向引物、PCR保护剂等均购自上海吉泰远成生物科技有限公司。本发明PCR反应体系中含热启动hTaq酶和染料GelgreenⅠ，能解决非特异性扩增这个难题，并且提供了一种新的性能较好的荧光物质Gelgreen I。

实施例1

一、本实施例的定量PCR反应体系的试剂如下：

10×Buffer（Mg²⁺ free）；

10×Gelgreen I；

10×PCR保护剂（小牛血清白蛋白）；

各10mmol/L的dATP、dUTP、dGTP和dCTP溶液；

25mmol/L的Mg²⁺；

5U/μL的hTaq酶；

无菌双蒸水。

二、本实施例定量PCR方法的应用

（1）制备待测DNA：按常规方法从小鼠血液中抽提DNA，扩增EGF基因。

（2）引物的合成。

正向引物：TATAGATATCATGAATAGTTATCCAGGATGCCCA  

反向引物：TATA GAATTCTCAACGCAGTTCCCACCATCGTAG。

（3）PCR反应体系的建立，反应体积共25μL，参照下表添加各试剂。

表1  PCR反应体系

。

（4）qPCR反应

采用三步法PCR反应程序，热启动hTaq酶需要热激活处理以恢复酶活，所以设置PCR反应预变性条件为95℃、10分钟，程序设置如图1所示。

Segment 1：PCR反应预变性阶段。

Segment 2：qPCR反应阶段。

Segment3：扩增产物融解曲线信息采集阶段。

（5）实验结果

qPCR的扩增曲线请见图2，从图中可以看出荧光信号的采集非常好，说明本发明所选用的荧光染料Gelgreen I用于qPCR非常合适，方便实用、灵敏性高且荧光染料成本低。

qPCR的融解曲线请见图3，图片上只有一个单一峰，说明使用的试剂盒扩增效果很好，因含有合适浓度热启动hTaq酶，很好地解决了qPCR技术中存在的非特异性扩增难题。

实施例2

本实施例的定量PCR反应体系的试剂如下：

10×Buffer（Mg²⁺ free）；

10×Gelgreen I；

10×PCR保护剂（Tween 20）；

各5mmol/L的dATP、dUTP、dGTP和dCTP溶液；

20mmol/L的Mg²⁺；

5U/μL的hTaq酶；

10μmol/L的正向引物；

10μmol/L的反向引物；

无菌双蒸水。

所述的荧光染料Gelgreen I的工作浓度为0.5×～1×。所述热启动hTaq酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL。所述的dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液或dCTP溶液的工作浓度为100～200μmol/L。

按常规方法制备待测DNA，建立PCR反应体系，进行qPCR反应。

实施例3

本实施例的定量PCR反应体系的试剂如下：

10×Buffer（Mg²⁺ free）；

10×Gelgreen I；

10×PCR保护剂（二硫苏糖醇）；

各10mmol/L的dATP、dUTP、dGTP和dCTP溶液；

30mmol/L的Mg²⁺；

5U/μL的hTaq酶；

10μmol/L的正向引物；

10μmol/L的反向引物；

无菌双蒸水。

所述的荧光染料Gelgreen I的工作浓度为0.5×～1×。所述热启动hTaq酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL。所述的dATP溶液、dUTP溶液、dGTP溶液或dCTP溶液的工作浓度为100～200μmol/L。

按常规方法制备待测DNA，建立PCR反应体系，进行qPCR反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。