一种同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉源性的荧光标记基因复合扩增方法

摘要

本发明提供了一种同时检测山羊、绵羊、猪和鸭肉等四种肉类源性的荧光标记基因复合扩增技术。本发明的方法是以上述四种动物的线粒体16S rRNA和Cyt b基因为目的基因，采用2对荧光标记的引物对4种动物的16S rRNA和Cyt b基因进行PCR复合扩增。PCR扩增产物经3730xl全自动基因分析仪检测，根据16S rRNA基因扩增片段长度多态性进行种属鉴定。本发明提供的方法弥补了上述4种肉类检测方法的空白。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种能同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉等4种肉类源性的荧光标记基因复合扩增方法。 

背景技术

民以食为天，食以安为先。肉类安全问题是关系民生的重大问题。羊肉中脂肪少，蛋白质丰富，含有较高的钙、钾和VB1等，胆固醇含量较低，具有较高的营养价值和食补价值，一直深受人们的青睐。近年来不断有报道发现不法分子将大量猪肉、鸭肉和鸡肉与少量牛羊脂肪、下脚料混合在一起作为羊肉出售，赚取高额利润。用猪肉、鸭肉加香精和色素制造羊肉串已经成为圈内“潜规则”。有关假羊肉的报道不断见诸报端，这不仅给消费者带来严重损失，也给羊肉产业的健康发展造成不良影响。因此，需要尽快建立快速、准确的检测方法，为食品安全提供技术支撑。 

肉类制品的鉴别方法主要从感官鉴别、蛋白水平到DNA水平三个层面展开。传统的感官检验的鉴别手段具有一定主观性，在实际应用中对于经过加工的肉制品，由于加入色素、食品添加剂、香料等物质，通过看、摸、闻等感官检验难以进行准确鉴别。以蛋白为基础的检测方法也因为缺乏灵敏度和可靠性以及仪器昂贵等限制难以被广泛应用。 

DNA是生物界中主要的遗传物质，其碱基序列承载着遗传信息所要表达的主要内容。DNA分子标记是一种以DNA多态性为基础的遗传标记，与其他遗传标记相比具有许多优点。基于DNA特异性的PCR技术在羊肉和鸭肉的源性成 分的检测上已得到应用，近年来陆续报道了肉制品真伪鉴定的多重PCR法，如猪、牛、山羊、绵羊等4个物种的检测等。但是在实际应用中，常规PCR检测手段都需要经过PCR扩增和凝胶电泳等多步实验，或者是多对混合引物同时扩增，因此耗时长，易污染，造成的结果也极易出现假阳性和假阴性，从而降低了反应的灵敏度及准确性。 

线粒体基因(mt DNA)在真核生物具有高保守性已成为了最常用的物种鉴定分子标记，使用最多的是12S rRNA基因，16S rRNA基因和细胞色素b基因(cytochrome b，cyt b)。在线粒体DNA中，165rRNA基因是线粒体基因组中研究较多的基因，该基因为生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可变序列，因此，可以在保守区设计通用引物，在通用引物的扩增区间的变异区筛选出特异探针，该基因适合于种属鉴定，遗传多样性和亲缘关系的研究，目前，16S rRNA基因序列已被广泛应用于动物源性成分鉴别检测中。也有许多学者对mtDNA cyt b基因进行序列分析，确定种属来源。随着掺假手段的提升，掺假种类组合越来越多样化，其中羊肉中掺入猪肉、鸭肉和鸡肉是最常见的，但是目前还没有同时检测山羊、绵羊、猪和鸭肉等四种肉类的方法，本发明以线粒体16S rRNA和cyt b基因为目的基因，使用两对引物对4种动物的mtDNA16S rRNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经3730xl全自动基因分析仪检测，以cyt b基因为内参，根据16S rRNA基因扩增片段长度多态性进行种属鉴定，弥补了上述4种肉类检测方法的空白。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉等4种肉类源性的荧光标记基因复合扩增方法。 

本发明需要解决的问题是：建立一种用于山羊、绵羊、猪和鸭肉等4种肉类源性鉴定的FAM荧光标记的线粒体DNA16S rRNA基因和细胞色素b基因复合扩增检测体系。首先，通过比对上述4种肉类线粒体DNA全序列，发现它们16S rRNA基因的一段序列存在长度差异，至少相差1bp，以这段序列为核心片段设计了1对通用引物；同时加入cyt b基因通用引物做内参，构建复合扩增体系。其次，扩增产物经ABI3730xl进行毛细管电泳，根据特异峰的位置进行种属鉴定。通过优化反应体系，提高检测灵敏度，最后，应用此方法对肉类盲样进行检测以验证其重复性和实用价值。 

本发明中，基于动物线粒体16S rRNA基因的差异性位点，设计1条通用引物引物，用FAM荧光标记，其中山羊的目的片段为232bp、绵羊的目的片段为230bp、猪的目的产物片段235bp，鸭的目的片段为分别为244bp；利用cyt b基因共用序列为内参，引物用FAM荧光标记；建立并优化荧光标记基因复合扩增反应体系，通过毛细管电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别。 

本发明的创新点：本发明是目前应用荧光标记基因复合扩增检测方法实现山羊、绵羊、猪和鸭肉四种肉类成分同时检测的首次探索，最大限度地避免引物数量过多造成的交叉干扰，检测灵敏度达到皮克级。与已报道方法相比具有很大优势：首先，本发明首次实现应用一对引物在一个反应体系里对4种肉类成分的同时快速鉴别，极大提高了检测通量；其次，本发明首次将FAM荧光标记的16S rRNA基因和cyt b基因复合扩增方法方法应用于多种肉类肉源性的检测，该方法较PCR更高效、安全和稳定。总之，与其相比本发明提高了检测效率、检测通量及检测稳定性，弥补了利用基因复合扩增检测技术同时快速检测多种肉类成分的技术空白，为肉类成分源性鉴定探索了新的途径。 

本发明的技术方案主要包括： 

1)根据4个目标物种线粒体16S rRNA基因的多态性位点，设计并合成1对通用引物，其中山羊、绵羊、猪和鸭的产物片段分别为232bp、230bp、235bp、和244bp。 

2)根据cyt b基因序列设计通用引物做内参。 

3)对每对引物的正向引物5’端添加6-FAM荧光标记，构建PCR复合扩增体系。 

4)扩增产物经ABI3730xl全自动基因分析仪毛细管电泳，根据特异峰的位置即片段大小确定肉类源性。 

5)考察该方法中所用引物的特异性与检测灵敏度。 

6)对大量肉类盲样进行检测。 

1.材料与试剂 

新鲜山羊、绵羊、猪和鸭肉等分别源自市场采样与本实验室冷冻保存的检测样品。血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒Qiagen公司；Ex Taq DNA聚合酶及反应缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA分子量Marker DL1000、电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂宝生物工程(大连)有限公司；电泳级琼脂糖济南鲁生生物科技有限公司；引物合成和DNA测序山东省农科院测序中心。 

2.仪器与设备 

全自动基因分析仪3730xl美国ABI公司；PCR仪Verite96-well日本Takara公司；核酸电泳仪Power PAC200美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统Universal HoodII美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机5415R德国Eppendorf公司。 

3.肉制品中总DNA提取 

使用OMEGA公司动物组织DNA提取试剂盒分别提取生鲜的山羊、绵羊、猪和鸭肉中的总DNA。100mg样品的总DNA均溶解于100μLTE缓冲液中，测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度。 

4.引物设计和荧光标记 

根据GenBank中已发表的山羊(登录号M55541.1)、绵羊(登录号NC_001941.1)、鸭(登录号X60825.1)和猪(登录号AY920914.1)线粒体16s rRNA基因序列，设计一对通用引物，在线粒体基因组中的结合位置见图1。根据上述物种的cyt b序列，设计一对通用引物做为阳性对照。然后对每对引物中正向引物的5’端标记6-FAM荧光分子，即16S rRNA的正向引物SIM-F：5’-FAM-AAGACGAGAAGACCCTTGGAC TTTA-3’，16S rRNA的反向引物SIM-R：5’-GATTGCGCTGTTATCC CTAGGGTA-3’；cyt b基因的正向引物mcb-F：5’-FAM-TACCATGAG GACAAATATCATTCTG-3’，cyt b的反向引物mcb-R：5’-CCTCCTA GTTTGTTAGGGATTGATCG-3’； 

5.荧光引物PCR复合扩增和检测 

在25μL的PCR复合扩增体系中进行山羊、绵羊、猪和鸭等4种肉类的鉴别，反应体系包含：反应缓冲液(5×)2.5μL，dNTP(2.5mmol／L)3μL，Taq酶0.4μL，线粒体16S rRNA通用引物(10μmol／L)各1μL，cyt Byingg通用引物(10μmol／L)各1μL，DNA模板3μL。PCR反应条件为：94℃3min，30个循环的94℃30s、55℃30s、72℃45s，72℃20min。PCR复合扩增产物通过ABI3730xl全自动基因分析仪进行毛细管电泳，Collection收集软件收集电泳信息，然后用基因扫描软GeneMapper3.2分析扩增片段的大小。 

6.引物特异性验证 

按照本发明扩增体系，分别使用4种目标肉类DNA及其两两等比例混合物对引物的检测特异性进行验证与比较。 

7.引物灵敏度试验 

将100ng／μL的4种目标肉类DNA10倍梯度稀释，分别针对山羊、绵羊、猪和鸭等4种肉类考察荧光标记基因复合扩增体系的灵敏度。 

8.检测灵敏度试验 

将山羊与鸭肉混合，分别设置掺入鸭肉百分比为1％、2％、5％，考察本发明技术体系检出掺假肉类的灵敏度。 

9.PCR产物测序 

使用16S rRNA通用引物分别扩增山羊、绵羊、猪和鸭等4种目标肉类DNA，PCR产物电泳后割胶回收纯化，参照《分子克隆》第三版对纯化产物进行T载体连接、转化、克隆筛选及鉴定，并委托山东农业科学院测序中心测序。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。 

本发明的优点和效果： 

1)引物特异性强：本发明使用1对通用引物同时检测4种肉类源性，避免了多对引物间的交叉反应，产量高、成本低；同时建立了阳性对照体系，而且所用仪器规格都一致，保证结果的稳定性和可靠度。 

2)目标肉类检测灵敏度高：本发明对于目标物种的检测灵敏度达到1pg/反应。较多重PCR法高2个数量级，较市售试剂盒和标准中提供的实时荧光PCR法提高了1-2个数量级。本方法对更易于降解的DNA模板分析更有优势。 

3)掺假肉类检测灵敏度高：利用本发明能检测出掺假比例为1％的肉类，检测灵敏度高，更低的掺假比例是不符合利益需求的，所以本发明检测灵敏度已经足够用于市场肉类掺假样本的检测。 

4)分辨率高：本发明能够区分目的片段间单个碱基的差异，结果简单易读。 

5)效率高：本方法操作快速简便，效率高，6小时内能完成4种肉类源性的检测。 

附图说明

图1：四种肉类线粒体16S rRNA基因中的引物结合序列。SIM-F：正向通用引物；SIM-R：反向通用引物。灰色阴影部分为引物结合位置。 

图2：山羊肉的荧光标记复合扩增结果。SY.山羊。 

图3：绵羊肉的荧光标记复合扩增结果。MY.绵羊。 

图4：猪肉的荧光标记复合扩增结果。Z.猪。 

图5：鸭肉的荧光标记复合扩增结果。Y.鸭。 

图6：4种肉类的荧光标记复合扩增结果。SY.山羊；MY.绵羊；Z.猪；Y.鸭。 

图7：盲样检测：山羊肉中掺假鸭肉的荧光标记复合扩增结果。SY.山羊；Y.鸭。 

具体实施方式

引物设计和荧光标记：根据GenBank中已发表的山羊(登录号M55541.1)、绵羊(登录号NC_001941.1HM236185.1)、鸭(登录号X60825.1)和猪(登录号AY920914.1)线粒体16s rRNA基因序列，设计一对通用引物，引物在线粒体基 因组中的结合位置见图1；根据上述物种的cyt b序列，设计一对通用引物做为内参。然后对每对引物中正向引物的5’端标记6-FAM荧光分子，即16S rRNA的正向引物SIM-F：5’-FAM-AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3’，16S rRNA的反向引物SIM-R：5’-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3’；cyt b基因的正向引物mcb-F：5’-FAM-TACCATGAGGACAAATATCATTC TG-3’，cyt b的反向引物mcb—R：5’-CCTCCTAGTTTGTTAGGGAT TGATCG-3’。 

线粒体16s rRNA和cyt b基因FAM荧光标记通用引物序列和扩增目的片段大小见表1。 

表1.FAM荧光标记通用引物序列 

PCR反应体系：PCR反应体系为25μl，反应体系包含： 

试剂 使用量 5×PCR Buffer缓冲液 2.5μl dNTP1mmol／L 3μl DNA模板 3μl 10μmol／L16SrRNA-F 1μl

[0054] 

10μmol／L16SrRNA-R 1μl 10μmol／L mcb-F 1μl 10μmol／L mcb-R 1μl Taq聚合酶 0.4μl RNase Free的H2O Up to25μl

扩增循环条件为： 

扩增产物检测：PCR扩增产物通过ABI3730xl全自动基因分析仪进行毛细管电泳，用Collection收集软件收集电泳信息，然后用基因扫描软件GeneMapper3.2分析扩增片段的大小。将4种肉类扩增产物混合构建动物分型标准物。 

引物特异性验证：用上述荧光标记的基因复合扩增技术对4种目标肉类的单独DNA为模板进行检测，以确定该方法对单一模板的特异性；并分别以山羊、绵羊、猪和鸭的DNA二联混合物为模板，以山羊、绵羊、猪和鸭的DNA三联混合物模板进行检测，确定当样品中存在2种以上动物源性成分时该方法的特异性。毛细管电泳分型结果见图2。由图可见，对4种目标肉类DNA和目标肉类两两以及三三混合的DNA，均在设计目的位置观察到特异性峰，未见明显非特异性扩增。 

扩增产物测序验证：将4种目标肉类的PCR扩增特异性产物回收纯化，纯化产物连接入T载体并委托测序，将测序结果与GenBank中的已知序列进行比对。比对结果显示5种肉类的测序结果与各自已发表序列的同源性均在99%以上，与预期基本一致。 

此外，还对本实验室制取的4种肉类的熟制品检测，特异性试验结果相同。同时，检测人为制成的生鲜肉两两混合物提取的DNA，与DNA两两混合物PCR结果相同。 

灵敏度检测：分别将山羊肉和鸭肉的DNA用分光光度计检测浓度定量到1ng，按照表2方式进行混匀，对上表掺假肉类分别进行检测以考察荧光标记基因复合扩增技术的灵敏度，发现掺入1％鸭肉即可观察到明显的目标峰，对于4种目标肉类DNA两两混合物、三三混合物模板的检测及熟制品检测，灵敏度试验结果相同。因此，掺假检测的灵敏度可达1％。 

表2.山羊肉和鸭肉混合比例表 

盲样检测：使用上述荧光标记基因复合扩增方法对市售的56份肉类样本进行了鉴定。发现2例羊肉卷中掺杂鸭肉，结果见图3。