一种促进乙酸分泌的溶磷基因

摘要

本发明提供了一种溶磷基因psa A，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因，高效产生乙酸，具有使难溶磷转化为有效磷的作用，为利用分子生物学手段提高磷肥的利用率提供基本材料。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种促进乙酸分泌的 溶磷基因。

背景技术

产生有机酸是溶磷微生物释放土壤难溶磷的一种主要的方式，有 机酸与土壤中铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷， 提高磷肥利用率。溶磷微生物产生比较常见的有机酸有琥珀酸、柠檬 酸、α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富 马酸和草酸。而溶磷微生物的应用受到如菌株的退化、作物种类、土 壤特性、气候条件、溶磷菌与其它微生物间的交互作用等影响而效果 不稳定。高效利用溶磷微生物产生有机酸或者通过异源表达克隆到的 溶磷相关基因产生有机酸是提高土壤磷素利用率最有效的一种方式， 而其关键是溶磷相关基因的获得。

关于溶磷相关基因研究以细菌为主，其主要机制是将葡萄糖直接 氧化产生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶 (GDH)和协同因子吡咯喹啉奎宁（PQQ）完成（Goldstein AH，1999， FEMS Microbiology Ecology,30(4):295-300.）。目前关于真菌溶磷相关 基因的克隆也有报道，主要是以黑曲霉和草酸青霉为主，但其数量非 常少，主要机制也不是很明确，也有报道从草酸青霉中克隆到的基因 编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中表达，分泌苹果酸、乳酸、醋酸、 柠檬酸、草酸等有机酸从而使难溶磷溶解（LüJ2011,Annals of  Microbiology,1-8）。

目前，在ncbi数据库中发布了真菌Aspergillus niger CBS513.88 （XM_001398218.2）和Aspergillus niger contig An17c0020 （AM270384.1）的全基因组序列，与本发明序列同源性都为98%， 但未对基因的功能进行预测与分析。与其他序列与本发明同源性较 低，可能不为同一类。

在ncbi数据库中，Mikael R.Andersen等发布了Aspergillus niger  ATCC1015的全基因组序列（2011，Genome Res.21(6):885–897.）， 与本发明基因编码的蛋白同源性为99%，对其功能也未进行预测。 Futagami,T等报道从Aspergillus kawachii IFO4308克隆到的基因编码 蛋白与本发明的蛋白同源性为99%，其为ubiquitin conjugating enzyme  （泛素结合酶），但未报到其具有产生乙酸的功能。其它报道的都为 假定蛋白，没有进行功能分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶磷基因，促进乙酸分泌，具有将难溶 磷转化为有效磷提高磷肥利用率的效果。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种溶磷基因psa A，所 述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种由所述溶磷基因psa A编码的蛋白，其氨基 酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有所述溶磷基因的载体。

作为优选，所述载体为表达载体pGEX-6P。

本发明还提供了含有所述溶磷基因的工程菌。

作为优选，所述工程菌为E.coli HST08。

本发明还提供了用于扩增溶磷基因psa A的开放阅读框序列的引 物对，包括正向引物F：5'-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGA GCAAG-3'和反向引物R：5'-CAAGTACTCGAGCTACGGCTCGCC GAGGAGCCG-3'；

其中，溶磷基因psa A的开放阅读框序列为：

SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了溶磷基因psa A在促进乙酸分泌中的应用。

本发明从黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)基因组中克隆获得， 其氨基酸序列通过DNAMAN分析后获得。

具体地，本发明利用SMART技术构建黑曲霉H1的初级cDNA文 库，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子，对筛选出的转 化子进行测序分析，获得其cDNA序列。利用软件DNAMAN对cDNA 序列结构进行分析，获得其开放阅读框，其序列如序列表SEQ ID NO.3 所示，根据序列，设计并合成上下游寡核苷酸引物，以筛选的转化子 携带的质粒为模板，进行扩增，将开放阅读框部分序列连接到pGEX 载体上，导入大肠杆菌，在大肠杆菌中表达，分泌乙酸。

本发明还提供了溶磷基因psa A在溶解无机难溶磷中的应用。

本发明从黑曲霉H1中克隆溶磷基因，其编码的蛋白导入大肠杆 菌中，在难溶磷无机盐培养基中培养36h时，促进大肠杆菌分泌乙酸， 含量分别为445～544μg/m，溶液中pH值从6.18降到4.12～3.52，释放的 可溶磷含量为0.10～0.12mg/mL。

本发明的有益效果在于：

1、本发明首先提供了溶磷基因psa A的核苷酸序列；

2、本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因，利用大肠杆菌高效 产生乙酸；

3、本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因具有将难溶磷转化为 有效磷的效果。

附图说明

图1为本发明黑曲霉菌H1在难溶磷无机盐培养基上培养3d的形 态。

图2为本发明文库的插入片段电泳检测。

图3为本发明文库中携带溶磷基因的克隆子二次转接。

图4为本发明质粒酶切位点图。

图5为本发明pGEX-6P表达载体图谱。

图6为本发明构建表达载体后的阳性克隆筛选。

图7为本发明表达载体上目的片段扩增。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1黑曲霉菌的cDNA全长文库构建

实验所用菌株黑曲霉菌株H1为中国农业科学院农业资源与农业 区划研究所农业菌种保藏中心从土壤样品中筛选，在难溶磷无机盐培 养基上培养3d，取0.2g左右新鲜菌丝（如图1），液氮研磨，利用RNAiso plus试剂盒提取总RNA，取1μg RNA作为合成cDNA第一链的模板， 在3’SMART CDS Primer IIA和SMARTer IIA寡核苷酸引物的引导下， 通过SMARTscriptTM逆转录酶70℃2min逆转录合成第一链 cDNA；以2μL第一链cDNA产物为模板，通过LD-PCR合成双链 cDNA。利用CHROMA SPIN+TE-1000纯化cDNA，去除小于500bp 的片段，沉淀回收cDNA片段。用T4DNA聚合酶补平cDNA的末端后， 在其两端连接EcoRI/XhoI定向接头，并用EcoRI/XhoI对接头进行酶 切，得到5’端为EcoRI、3’端为HindIII酶切位点的双黏性末端cDNA。 纯化后的cDNA片段通过T4DNA连接酶连接到经过EcoRI/XhoI双酶 切的pBluescript SK(+)载体上，将连接产物电转化到宿主菌E.coli HST08。随机挑取转化后的克隆子，在LB培养液中培养过夜，提取质 粒，将质粒用EcoR I和Xho I酶切质粒，检测连接片段的大小，结果显 示插入大小为600bp～3kb（图2）。将转化后的宿主菌接种在2mL LB 液体培养基中37℃温浴2h，得到初级cDNA文库，4℃保存备用。

实施例2溶磷基因的筛选及生物信息学分析

将含有文库细菌的培养液稀释涂布到含有氨苄青霉素（100μ g/mL）难溶磷培养基上，37℃培养3-4d，观察是否有溶磷透明圈产生， 将产生透明圈的转化子转接培养，如图3所示，筛选的克隆子转接后 仍能在难溶磷无机培养基上产生透明圈，说明其功能稳定，将功能稳 定的菌落提质粒测序得到DNA的序列，在NCBI上通过Blast进行比对 分析，并利用DNAMAN6.0进行开放阅读框分析，并将翻译蛋白在 PDB数据库上比对分析。

实施例3表达载体的构建、转化宿主、阳性克隆鉴定

引物设计（Forward：5’ -TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3’；Reverse：5’ -CAAGTACTCGAGCTACGGCTCGCCGAGGAGCCG-3’），采用高 保真Taq酶扩增上述基因的ORF，反应条件：94℃5min；94℃1 min，60℃1min，72℃1min循环35次72℃10min，4℃ forever。用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI双酶切后，连接到表达载 体pGEX-6p上，酶切位点序列和表达载体pGEX-6p图谱如图4、图5所 示，通过电击法转化E.coli HST08，在难溶磷无机盐培养基上筛选能 产生透明圈的克隆子（图6），并通过PCR鉴定挑选出转化阳性的克隆 的片段大小，扩增结果如图7所示，其大小与目的基因大小一致，进 一步通过测序比对，其序列与目的基因序列完全一致，说明其为阳性 克隆。测序引物采用载体自身引物用T3 (5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’)和T7 (5’-AGCGGATAATTTCACACAGG-3’)进行PCR扩增。

实施例4溶磷基因psa A对难溶磷无机盐培养液pH及可溶磷含量的 影响

将上述筛选出的含有编码蛋白序列阳性克隆分别扩大培养，在 150mL的三角瓶中装入50mL带抗性的难溶磷无机盐培养液，培养基 配方为：葡萄糖或蔗糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl0.3g，KCl0.3 g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g， Ca₃(PO₄)₂10.0g，蒸馏水1000mL。接种含有基因的转化子1mL，37 ℃，200r/min培养，同时以不含有该基因的菌作为对照，设置三个重 复，分别在12h、16h、20h、24h、36h和40h测定溶液的pH值，并 将溶液离心取上清，105～110℃干燥后的磷酸二氢钾作为标样，用钒 钼黄比色法测定可溶磷含量。随着时间的延长，接种转化子的溶液pH 值逐渐降低，在36h时，降到最低值达到3.52，溶液中可溶磷含量升 到最高，达到0.11mg/mL，而不携带基因的大肠杆菌溶液pH最终降到 5.6左右时不再变化，可溶磷含量没有变化。

实施例5溶磷基因psa A对大肠杆菌产酸的影响

实验设计如同实施例4，在36h取出溶液上清，20000rpm离心， 离子色谱Na柱过滤，通过美国戴安公司ICS-3000离子色谱仪分析溶液 中有机酸的种类和含量。保护住为IonPac AG11-HC（4×50mm），色 谱柱为IonPac AS11-HC（4×250mm），淋洗液梯度洗脱程序为 0～5min，1.0mmol/L KOH；5～45min，36.00mmol/L KOH；45～50， 1.0mmol/L KOH。培养36h后，不含psa A的E.coli HST08只产生少量 乙酸，含量分别为18.5μg/mL，而含psa A的E.coli HST08分泌大量乙 酸，含量为445～544μg/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。