重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp、家蚕杆状重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

摘要

本发明涉及利用杆状病毒重组系统在家蚕细胞及家蚕体内融合表达大肠杆菌天冬酰胺酶的方法。本发明将da26和Asp以相同酶切位点的核苷酸连接构建成融合基因，将其克隆至含有双启动子的pFastdual载体，同时将polh克隆至多角体启动子下形成新的重组质粒。通过转移载体同源重组，形成含有da26和Asp融合表达的重组Bacmid，通过转染家蚕细胞后获得重组病毒。da26表达的BV/ODV-E26是来源于BmNPV的一种包膜蛋白，可以与外源基因表达的蛋白紧密结合，通过超声裂解和差速离心法将外源蛋白分离纯化。这种表达系统不仅可以获得更多的Asp，而且由于BV/ODV-E26可以吸附在BmNPV形成的多角体颗粒的表面，通过离心纯化多角体后，就可以获得融合表达产物da26-Asp，再通过洗脱，把融合蛋白洗脱下来，简化了纯化的流程。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及到利用杆状病毒重组系统在家蚕细胞及家蚕体内融合表达大肠杆菌天冬酰胺酶的方法。

背景技术

L-天冬酰胺酶Ⅱ( L-AsparaginaseⅡ , EC 3.5.1.1) 即L-天酰胺酰胺基水解酶, 能够专一性地催化L-天冬酞胺水解生成L-天冬氨酸和氨，是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物。在临床上主要广泛用于淋巴瘤和儿童急性淋巴细胞白血病(ALL )的治疗, 还可用于黑素肉瘤、霍金森病、胰腺癌等疾病的治疗。

目前, L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产大多采用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌,在生产上存在着发酵水平低和分离纯化步骤繁多两方面问题。

专利号为201110027008.3的中国发明专利，公开了一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法。该方法首次实现了以家蚕为宿主进行L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产。该方法不仅提高了生产效率、简化了纯化程序、提高了纯化水平，而且由于蚕体中有天然的蛋白质保护剂，对表达产物具有保护作用。该方法是本单位的研究成果，发明人不满足于现状，在该技术领域继续做了深入研究，进一步提高L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性，进一步简化了L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯化。

发明内容

本发明的目的是为了提高L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性，为了简化L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯化，提供一种重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp。利用该质粒可以制取家蚕杆状重组病毒，而该家蚕杆状重组病毒则能够高效地生产L-天冬酰胺酶Ⅱ，并且通过该方法制备的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有活性高，纯化简单的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp，其特征在于它是通过以下方法制备的：

（1）以家蚕杆状病毒DNA为模板，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物da26；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物Asp；

（2）扩增产物da26及Asp琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后用XbaⅠ做单酶切，然后将da26、asp酶切产物纯化并连接，得到da26-Asp连接产物；

（3）以da26-Asp连接产物为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.4分别为上游引物进行PCR扩增，得扩增产物da26-Asp；

（4）扩增产物da26-Asp与质粒pMD??18-T做连接，得到重组质粒pMD??18-T-da26-Asp；

（5）以BmNPV DNA为模板，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为上下游引物，通过扩增BmNPV 多角体基因的读码框，扩增的片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，克隆至杆状病毒的p-polh、p-10双启动子转移载体pFastdual质粒的多角体启动子p-polh下，得到重组质粒pFastdual-polh；

（6）测序正确的重组质粒pMD??18-T-da26-Asp 以SmaⅠ和SphⅠ双酶切，克隆至重组质粒pFastdual-polh的p-p10启动子下，得到重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp；

各引物序列如下：

SEQ ID No.1：TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG；

SEQ ID No.2：GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG；

SEQ ID No.3：GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC；

SEQ ID No.4：ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；

SEQ ID No.5：GCGGATCC ATGCCGAATT ATTCATACA；

SEQ ID No.6：ACATGAATTC TTAATACGCCGGACCAGT。

本发明的另一个目的是提供家蚕杆状重组病毒。

家蚕杆状重组病毒，它是通过以下方法制备的：

将所述重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp在含BmNPV基因组的大肠杆菌Bm DH10Bac中转化,并在含有抗生素的培养板上培养，通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组；将此质粒DNA转染家蚕细胞，分离培养基上清液，获得含有da26与Asp融合表达的重组病毒。

本发明的还有一个目的是提供生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法。

生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，用所述病毒感染家蚕，120小时后在该家蚕的BmN细胞中，分离得到紧密吸附在多角体蛋白颗粒表面的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过洗脱，将L-天冬酰胺酶Ⅱ洗脱下来，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。

本发明将da26和Asp以相同酶切位点的核苷酸连接构建成融合基因，将其克隆至含有双启动子pFastdual载体的p10启动子后面，同时将polh克隆至多角体启动子下形成新的重组质粒。通过转移载体含在大肠杆菌Bm DH10Bac中同源重组，形成含有da26和Asp融合表达的重组Bacmid，通过转染家蚕细胞BmN后获得的重组病毒。da26表达的BV/ODV-E26是来源于BmNPV的一种包膜蛋白，可以与外源基因表达的蛋白紧密结合，通过超声裂解和差速离心法将外源蛋白分离纯化。这种表达系统不仅可以获得更多的Asp，而且由于BV/ODV-E26可以吸附在BmNPV形成的多角体颗粒的表面，通过离心纯化多角体后，就可以获得融合表达产物da26-Asp，再通过洗脱，把融合蛋白洗脱下来，简化了纯化的流程。利用本发明提供的含有da26和Asp的重组杆状病毒可以把家蚕作为生物反应器，大量地生产Asp。

本发明所实现的技术效果如下：

（1）家蚕生物反应器有以下几个优点：①高效表达：多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，可以达到细胞总蛋白的25%左右，家蚕幼虫体内表达外源基因，表达效率可高于培养细胞10－100倍，每头蚕的表达量可达毫克级；②表达产物稳定：蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；③安全性好：杆状病毒仅是昆虫或节肢动物的病毒，对人畜无毒无害；

（2）采用本发明方法制备的L-天冬酰胺酶Ⅱ，具有活性高的优点，经测试活性可达到6040U/mg；

（3）本发明方法具有分离纯化简单的优点，纯化多角体就可实现纯化L-天冬酰胺酶Ⅱ，而多角体与L-天冬酰胺酶Ⅱ是物理性的吸附，只要通过洗脱的方法就能将L-天冬酰胺酶Ⅱ分离下来，显著地简化了分离纯化的流程。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

1. 引物设计

扩增da26

引物设计如下：

上游引物da26-F: TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG (下划线表示SmaⅠ酶切位点) SEQ ID No.1；  

下游引物da26-R: GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG (下划线表示XbaⅠ酶切位点) SEQ ID No.2。

扩增大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因成熟区片段

引物设计如下

上游引物asp-F: GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC (下划线表示XbaⅠ酶切位点) SEQ ID No.3；

下游引物asp-R: ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT (下划线表示SphⅠ酶切位点) SEQ ID No.4。

扩增多角体基因读码框片段

引物设计如下

上游引物polh-F: GCGGATCC ATGCCGAATT ATTCATACA (下划线表示BamHⅠ酶切位点) SEQ ID No.5；

下游引物asp-R: ACATGAATTC TTAATACGCCGGACCAGT (下划线表示EcoRⅠ酶切位点) SEQ ID No.6。

2. PCR扩增

以家蚕杆状病毒DNA为模板，扩增da26的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃复性40s，72℃延伸 1min，30个循环。

以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，扩增asp的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃复性40s，72℃延伸 1min，30个循环。 

以重组片段da26-Asp为模板，扩增da26-Asp的PCR反应参数设计为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃复性45s，72℃延伸 2min，30个循环。

待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，同时切胶回收目的片段。

3. 构建重组转移载体pFastdual-polh-Da26-Asp

将扩增产物da26、AspXbaⅠ单酶切做连接，将da26-Asp扩增产物克隆至pMD??18-T Vector测序。将实验室现有的pFastbac1-polh用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆至pFastdual质粒得到重组质粒pFastdual-polh。将测序正确的重组质粒pMD??18-T-da26-aspSmaⅠ和SphⅠ双酶切克隆至pFastdual-polh重组质粒，得到重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp。

4. 含多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因家蚕重组杆状病毒的获得

  将重组转移载体pFastdual-polh-da26-Asp转化Bm DH10Bac,在含有卡那霉素50μg/mL，庆大霉素7μg/mL，四环素10μg/mL，IPTG  40μg/mL，X一gal 100μg/mL的培养板上培养过夜，翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提杆粒DNA，该杆粒DNA即为重组病毒的基因组。将此DNA转染家蚕细胞BmN。准备杆粒DNA/脂质体复合物，溶液A:取重组Bacmid(5-10μg)，加入无血清Bm细胞培养基补充体积至100μL;溶液B:取脂质体8μL，加入92μL无血清Bm细胞培养基。将溶液A和溶液B混匀，室温静置15min。取生长良好的BmN细胞，用无血清昆虫Bm培养基培养基洗2一3次，加入800μL无血清的Bm细胞培养基培养基后，再加入准备好的质粒DNA/脂质体复合物200μL。28℃继续培养4h后，加1mL含有20%血清的Bm细胞培养基继续培养。28℃继续培养120小时后，在光学显微镜下观察多角体的形成。分离培养基上清液，获得含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒。将获得的重组病毒感染BmN细胞，72小时后收集感染的细胞，用于下一步的大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析。

5.大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析

L-天冬酰胺酶Ⅱ一个单位的酶活性定义为能使底物每分钟释放切1μmol氨的酶量。

相关蛋白质浓度的测定方法采用BCA法。

使用奈氏试剂(the Nessler reagent)来检测L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性。标准浓度样品为己知浓度的硫酸铵。为排除杆状病毒自身的影响，以BmNPV为对照。具体步骤如下:将上述收集的细胞悬浮在2mL PBS中，与冰上超声波破碎。破碎条件为：强度70，每超声15s，于冰中静置15s，如此反复20次。超声完毕后于4℃条件下，12000rpm，离心15min，收集上清于冰上备用。将100μL的上清与终浓度为0.25%的底物L-Asn(溶于100mM PBS，PH 8.0)混合，在37℃的水浴中孵育15min，立即用终浓度5%的三氯醋酸溶液终止反应。加入奈氏试剂，室温反应15min后于450nm波长下读取吸收值以检测酶反应释放出的氨。经计算在家蚕细胞BmN中表达的重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ活性为6040U/mg。这比在大肠杆菌中的表达量高。由于家蚕幼虫体内表达外源基因表达效率可高于培养细胞10－100倍，每头蚕的表达量可达毫克级，因此若将此重组杆状病毒感染家蚕会得到更高的表达量，且更加方便纯化，为它在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。

Organization Applicant

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      Street : 吴兴区东门外毗山湖州市农业科学园研究院

      City : 湖州市

      State : 浙江省

      Country : 中国

      PostalCode : 313000

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<110> OrganizationName : 湖州市农业科学研究院

 

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       L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

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