转录因子基因RrMYB11在调控玫瑰花型中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰DNA片段的分离、克隆和功能验证及应用。所述的DNA片段包含玫瑰转录因子基因RrMYB11，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。该基因片段能够改变植物的花型。将该基因片段直接转化植物，使转基因植物的花型发生了改变。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰基因片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物花瓣发育有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的花瓣发育和花型发生变化。 

背景技术

转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录(张椿雨，龙艳，冯吉，孟金陵植物基因在转录水平上的调控及其生物学意义.遗传.2007，29(7)793-799)。 

MYB基因家族是最大的植物转录因子基因家族之一，它们都具有高度保守的DNA结合域-MYB结构域。每个MYB结构域由约52个氨基酸残基和间隔序列组成，每隔18-19个氨基酸间隔一个色氨酸残基，这些在空间上规则排列的氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-转角一螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构，MYB蛋白借助此结构插入靶DNA分子大沟与目的DNA结合(Frampton J，eds.Myb transcription factors：their role in growth，differentiation and disease，Kluwer academic publishers，Springer，Netherlands，pp.6-8，2004)。根据所含MYB结构域的数目，可将植物中的MYB转录因子简单分成单一MYB结构域蛋白(R1/2，R3)，2RMYB蛋白(R2R3)，3RMYB蛋白(R1R2R3)和4RMYB(R1R2R3R4)(Stracke R，Werber M，and Weisshaar B.The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.Curr.Opin.Plant Biol，2001，4：447-456)。植物体中大多数MYB蛋白具有2个重复的MYB结构域(R2R3)。 

在植物中，早在1987年，Paz-Ares便从玉米中成功发现与色素合成相关的MYBC1基因(Paz-Ares et al.，1987)。随后，在多种植物如金鱼草(Waites et al.，1998)、矮牵牛(Walker et al1999)、大豆(Miyake et al.，2003)、拟南芥(Chen et al.，2006)、葡萄(Deluc et al.，2006)和苹果(Takos et al.，2006)等中也分离鉴定出功能各异的MYB蛋白。 

MYB类转录因子几乎参与了植物发育和代谢的各个方面。他们可以与其它转录因子家族 成员转录因子相互作用，通过组合调控的方式调节植物细胞的形成与模式建成、调节植物次生代谢特别是苯丙氨酸代谢，并对外界环境、激素及病虫害等做出应笞。 

玫瑰是我国重要的经济植物，也是世界上重要的观赏与生产两型花卉之一。到目前为止，在玫瑰中还没有关于MYB转录因子的报道。 

发明内容

本发明的目的提供一种分离的转录因子基因RrMYB11在调控玫瑰花型中的应用，该基因与花瓣的形状的形成相关。 

本发明提供了玫瑰中表达的MYB家族转录因子RrMYB11的基因编码序列及其功能，具体包括：RrMYB11基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，以及转化此基因与烟草内，进行分子鉴定和表型观察。 

本发明首先从玫瑰中克隆出一种新的MYB家族转录因子基因，将其命名为RrMYB11。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框为669bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 

本发明还提供了这种玫瑰RrMYB11蛋白编码序列，它有222个氨基酸残基，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

本发明还提供了用于调取获得玫瑰样品中基因RrMYB11的一对核苷酸引物。该引物根据基因RrMYB11设计，使用该对引物对玫瑰花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得727bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示： 

P1正向引物：5’GCAAGAAATCACTGAGGAATAGGG3’(见序列表SEQ ID NO：3) 

P2反向引物：5’GCTTTAACTACAAACTGAAACGAGGC3’(见序列表SEQ ID NO：4) 

本发明还提供了一对检测玫瑰RrMYB11基因在转基因烟草中表达的核苷酸引物。该引物根据基因RrMYB11设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得564bp的基因片段。该引物对的DNA序列为： 

P3正向引物：5’CAAAGCAGGTCTAAACCGATGTGG3’(见序列表SEQ ID NO：5) 

P4反向引物：5’GCTTTAACTACAAACTGAAACGAGGC3’(见序列表SEQ ID NO：6) 

可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RrMYB11的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或 者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育不同花型的植物种类。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的包含有RrMYB11基因编码区的DNA片段(其中63-731bp为CDS)。序列全长为721bp，编码222个氨基酸。 

序列表SEQ ID NO：2是上述RrMYB11转录因子基因片段对应的蛋白质的氨基酸序列。 

序列表SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4是扩增上述玫瑰花瓣样品cDNA的引物对的DNA序列。 

序列表SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6是检测转基因烟草中表达基因片段(564b)引物对的DNA序列。 

图1：是已有的植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图。 

图2：是本发明构建的重组质粒pCAMBIA2300s-RrMYB11结构示意图。 

图3：对照野生型烟草(非转基因)与转化RrMYB11基因的烟草(转基因)的花型比较图。图中：图3A是对照未转基因的植物(烟草)的花型；图3B是本发明转基因植物(烟草)的花型。 

图4：RrMYB11基因在转基因植株中的表达量情况图。图中：P为阳性对照，Water为双蒸水对照，CK为野生烟草(非转基因，作为转基因烟草的对照，其余为转基因独立转基因植株。 

具体实施方式

实施例1：分离克隆RrMYB11基因 

本发明的前期对丰花玫瑰(又称“平阴一号”，http://tc.cctv.com/20100412/103621.shtml，丰花玫瑰的选育文献已经公开发表，见：吕传润(平阴玫瑰研究所)，玫瑰新品种-丰花玫瑰及栽培技术，山东林业科技，2007，5：77；华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学花卉实践教学基地从山东省平阴县平阴玫瑰研究所引种)不同时期的花朵进行了转录组测序(转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成)，在转录组测序结果中得到了RrMYB11基因的全长序列(见GenBank登录号：FR828544.1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FR828544.1)。根据转录测序RrMYB11基因的已知序列全长，设计特异引物P1(见序列表SEQ ID NO：3) 正向引物5’GCAAGAAATCACTGAGGAATAGGG3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)反向引物5’GCTTTAACTACAAACTGAAACGAGGC3’，将测序序列的31-757bp从玫瑰品种‘丰花’(即丰花玫瑰)花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如下所示：GCAAGAAATCACTGAGGAATAGGGAAGTGGCAATGGTGCCATTAAGCACTAGAAGTTACAAGAACAAGGAAGTAAACAGAGGGTCTTGGACAGCAGAAGAAGATCAGAGACTGGCTCAAGTTATTGAAGTCCATGGCCCAAGAAAGTGGAAGTCTGTTGCAACCAAAGCAGGTCTAAACCGATGTGGGAAGAGTTGCAGACTGAGATGGATGAACTATCTTAGACCAAATATTAAGAGAGGCAATATATCAGACCAAGAAGAGGACTTGATACTCAGGCTTCATAAACTCCTTGGAAACAGGTGGTCATTGATTGCCGGAAGACTGCCTGGTCGAACAGACAACGAGATTAAGAATTACTGGAACTCTCATTTGAGCAAGAAGATCAAGCATAACGAGAGATCACAAAAACAAAACAGACTACTTTCTGCATCATCAAATCCAGCAGCACAAGAGTTGTCCTCCTCGTCCGAGCCTCAGAATGTTGAGTTAATGGAGAACCATGCTGTACCAATTGGAATAGAAGATGACAGCTCGAAACGCGAGGAGAACTACTTCTTCAAGTCCATGAGCTATAATGGATCATCTGGAGATGAGTTCTTGTTTGATGGCTCAACTGCTGACGAGGGGCCTTTGAATTTGGAGTGGATGAATAGATTTCTAGAAATGGATGAGAGTTGGTTCACTCTGCATGACATTTGAGCCTCGTTTCAGTTTGTAGTTAAAGC 

扩增产物中的32bp-701bp就是本发明的序列。具体步骤为： 

1、采用常用的CTAB法(参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编)从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA，具体步骤如下： 

1)向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(W/V)CTAB，NaCl1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·Cl 100mmol/L，2％(W/V)pvp)和10％的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。 

2)将玫瑰花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟 

3)加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃下12000g离心10min 

4)取上清，重复步骤3) 

5)取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4℃离心15分钟，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。 

6)以从玫瑰品种‘丰花’(即丰花玫瑰)中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃ 5min，42 ℃ 50min，70℃ 10min。 

7)根据转录测序中的序列设计的特异引物P1(见序列表SEQ ID NO：3)5’GCAAGAAATCACTGAGGAATAGGG3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)5’GCTTTAACTACAAACTGAAACGAGGC3’，将RrMYB11从玫瑰品种‘丰花’花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。 

反应条件：94℃预变性4min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，37个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入 载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆被命名为 质粒。 

实施例2：RrMYB11基因超量表达载体的构建，转化 

MYB类转录因子几乎参与了植物发育和代谢的各个方面，为了能更好地阐明此基因的功能，申请入将其在烟草中超量表达，从转基因植株的表型来验证。具体步骤是：首先将实施例1中得到的阳性克隆 质粒用BamH I和Sal I双酶切，回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体来自湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含RrMYB11基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得重组质粒(或称转化载体)，将其命名为pCAMBIA2300s-RrMYB11(见图2)。 

通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到烟草中，经过侵染、共培养、筛选具有卡那霉素抗性的烟草转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得到转基因植株。 

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述： 

(1)试剂和溶液缩写 

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素) 

(2)用于烟草遗传转化的培养基配方 

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。 

表1 烟草转化培养基设计 

注：1/2MS，MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497报道的方法。 

表1中的Kan(Kanamycin，卡那霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan和Cef成分以外的培养基经常规121℃高压蒸汽灭菌20min后，待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入。 

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤 

1)农杆菌的培养 

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA10548小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L)中，于28℃ 200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。 

2)叶盘转化法 

a.剪取烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中； 

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min； 

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃； 

d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kam抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃； 

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如上所述的壮苗选择培养基上，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kam抗性苗的筛选，培养温度为28℃； 

f.将筛选得到的抗性苗转入如上所述的生根选择培养基上使其生根，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，培养温度为28℃。 

2)移栽 

洗掉转基因烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一个周内保持水分湿润。 

结果共获得20个株系的PCR检测结果为阳性的转入重组质粒pCAMBIA2300s-RrMYB11(参见图2)的T₀代转基因烟草。 

实施例3：RrMYB11基因转基因T₀代在田间的表型观测与RT-PCR检测 

转基因烟草植株下地移栽后，直至开花期，将转基因烟草的花型与未转化烟草的花型进行比较，发现转RrMYB11基因的烟草的花型发生改变：没有转化的烟草花冠为展开的五边形，未见实质性的裂开花瓣(图3A)；转RrMYB11基因的烟草花瓣内陷形成五角星型，出现明显深裂的5片花瓣轮廓，且花瓣尾尖呈心型(图3B)。 

为了验证转基因烟草花型的改变是否与转入的RrMYB11基因有关，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因烟草植株中RrMYB11基因表达进行了检测(结果见图3)。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因烟草1-6号株系中提取花的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。先用报道的看家基因eIF(登录号：X79009)对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因EIF的序列设计一对引物P5正向引物(5-GCAGCCGTGATCACACAGTATCT)和P6反向引物(5-ACACCCTTCCTTCCAAAACGT)，进行PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，28个循环；72℃延伸10min。试验结果如图3所示，看家基因EIF的在野生型烟草和转化烟草中均能扩出，并且亮度一致。然后，根据RrMYB11基因的序列，在靠近3’端设计一对引物P3(见序列表SEQ ID NO：3)正向引物(5-CAAAGCAGGTCTAAACCGATGTGG)和P4(见序列表SEQ ID NO：4)反向引物(5-GCTTTAACTACAAACTGAAACGAGGC)，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸 10min。试验结果表明，6株转基因烟草内均检测到有RrMYB11基因的表达，结果如图3所示。图3中显示：1：为质粒pCAMBIA2300s-RrMYB11的PCR扩增结果，2：为没有转化的野生型烟草的PCR扩增结果，3：为双蒸水对照，4-9：为转入重组质粒pCAMBIA2300s-RrMYB11的转基因烟草的PCR扩增结果。