一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法

摘要

本发明公开一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：（1）制备壳聚糖溶液；（2）向壳聚糖溶液加入过氧化氢溶液保温；（3）在超声波-微波联合作用条件下进行降解反应，超声功率为10～100W，微波功率为160～640W，联合作用时间为1～10min；（4）降解反应后的溶液用碱溶液调节pH至中性，经分离、干燥后即得到低聚壳聚糖。本发明通过利用微波-超声波联合与过氧化氢氧化交替作用于壳聚糖制备水溶性低聚壳聚糖，具有快速制备、易分离纯化、工艺过程环保、产品相对分子质量分布均匀等优点。

说明书

技术领域

本发明属于水溶性低聚壳聚糖的方法，尤其涉及一种利用微波-超声波联合与过氧化氢氧化交替作用，快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法。

背景技术

甲壳素是自然界除蛋白质外数量最大的含氮天然有机高分子化合物，每年由生物合成的甲壳素大约100亿吨，仅次于纤维素，是地球上第二大可再生资源。壳聚糖由甲壳素经部分或完全脱乙酰基得到，化学名为（1,4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，分子之间以β-（1,4）糖苷键连接。甲壳素和壳聚糖由于其分子结构中内外氢键的相互作用，形成了有序的大分子结构，相对分子质量通常在几十万至几百万，不溶于水等一般溶剂，应用受到极大限制。

经过降解后达到较小分子量（800-10000）范围的低聚壳聚糖与未降解壳聚糖相比，它的分子量降低，破坏了一些分子的网状结构，使得其晶体结构的紧密性显著降低，溶解性大大增强，生物活性、配位能力明显提高，不仅保持了未降解壳聚糖的所具有的某些功能性质，如降低胆固醇、降血压血脂、防治糖尿病、强化肝脏机能、治疗烧、烫伤等等，而且不同分子量范围的低聚壳聚糖还具有许多未降解壳聚糖所不具备的生理活性和功能性质，如保湿型、免疫调节、防癌、调节肠道菌群、功能性甜味剂、作为营养强化剂载体、排除体内有毒有害物质、抗菌防腐、诱导植物产生抗毒素等等许多作用。因此，低聚壳聚糖的制备与应用已成为国内外研究的热点。

目前，低聚壳聚糖的制备主要有三种方法：化学降解法、酶降解法和物理降解法。复合降解法，目前是一个较新的研究领域。

一、化学降解法：是指通过化学反应使壳聚糖降解，有酸降解法和氧化降解法，其中H₂O₂氧化法已有大量文献报道，并已用于生产。与化学降解法相关的公开文献如下：

1.申请号：201010178792.3，发明名称：一种低聚壳聚糖的制备方法，摘要：一种低聚壳聚糖的制备方法，通过壳聚糖溶液本身水力空化效应对壳聚糖进行降解来制造低聚壳聚糖，包括：壳聚糖溶解、水力空化降解、向降解完成后的壳聚糖溶液中加入碱溶液调节pH以及沉淀物洗涤和真空干燥等步骤；所述水力空化降解的工艺流程是：将壳聚糖溶液放在贮罐中，并通过循环水箱进行恒温，壳聚糖溶液通过泵输送到空化器进行空化降解，通过阀门V1，V2，V3，V4调节上游进口压力、下游恢复压力和流量，并通过压力表和流量计监控压力和流量，经空化降解后的溶液回流到贮罐中、通过循环水箱将温度控制在25-80℃、在水力空化器中进行循环处理0.5h-20h直至达到所需相对分子质量要求为准，该方法具有简便易行、能耗低、效率高等特点。但是该法产品得率较低、水解产物复杂、分离困难，且对环境污染严重。

2.申请号：201110125040.5，发明名称：一种低聚壳聚糖的生产方法，摘要：一种低聚壳聚糖的生产方法，属于精细化工技术领域；其特征是涉及到用过氧化氢作为氧化剂氧化壳聚糖生产低聚壳聚糖(壳寡糖)的方法。其壳聚糖质量分数为5％～35％，达到反应终点时，n(过氧化氢)∶n(壳聚糖)＝1.3～5.5，反应温度为50℃～90℃。反应液降温至0℃～10℃，用-30℃～0℃体积分数为95％乙醇析出，w(乙醇)∶w(反应液)＝1～4。滤饼用-30℃～10℃体积分数为99％乙醇洗涤1～5次，然后40℃～60℃烘干2h～8h。本发明的效果和益处是低聚壳聚糖分子量低，且溶解度高达80g/100g水。降解在中性介质中进行，产品不含无机盐类。反应液中添加还原物质，可完全消除残存的过氧化物。生产无三废，产品收率高，生物活性高，色泽改善，经毒理学试验属无毒物。在中性条件下采用H₂O₂溶液对壳聚糖进行氧化降解，但是受到不同的过氧化氢浓度、配比、温度和反应时间对降解反应的影响，制备过程复杂，反应时间过长，过程难以控制，大大影响了生产效率。

二、酶降解法：是利用酶催化水解，分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法。酶降解法具有反应条件温和、整个降解过程无其他反应试剂加入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、低聚壳聚糖得率高、不造成环境污染等优点。与酶降解法相关的公开文献如下：

1.申请号：03128199.0，发明名称：壳聚糖酶生产菌及低聚壳聚糖的生产方法，摘要：本发明公开了一种用微生物培养得到壳聚糖酶和生产低聚壳聚糖(或称氨基寡糖素、壳寡聚糖)的方法，所述的微生物是从海滩上获得的芽孢杆菌，获得菌种后诱导产酶发酵的方法是加入适量壳聚糖和氮源、无机营养盐的溶液中，在常温下培养30－40小时即可得到具有高活性的壳聚糖酶制剂，酶解产糖的方法是将酶液与壳聚糖溶液按一定比例混匀，在十分温和的条件下进行酶解反应，短时间内(4－12小时)即可将壳聚糖转化为低聚壳聚糖，浓缩或干燥得到产品。该方法的菌种遗传性稳定，产酶率高，发酵及酶解条件常规化、速度快，产品质量好。但是酶法使用的酶成本较高。

2.申请号：200810056488.4，发明名称：一种复合酶降解制备低聚壳聚糖的工艺方法，摘要：本发明公开了一种复合酶降解制备低聚壳聚糖的工艺方法；利用不同种类的非专一性酶即α-淀粉酶和菠萝蛋白酶，或纤维素酶，在降解壳聚糖过程中产生的协同作用提高降解效率，在5.0h内使产物的平均分子量降解达到1500Da左右。最后降解产物经过微滤和纳滤纯化、浓缩和喷雾干燥，可得到高品质的低聚壳聚糖产品。与传统的制备工艺相比，该工艺不但产品活性高、质量优良，操作方便，而且改善了生产环境，有利于实现工业化。但是该法也存在酶成本高的问题。

三、物理法：主要为超声波、微波、电磁波辐射降解法。具有操作简单，速度快，无副产物，无环境污染等优点，与物理法相关的公开文献如下：

1.申请号：200810156803.0，发明名称：低聚壳聚糖的制备方法，摘要：本发明公开了一种低聚壳聚糖的制备方法，大分子壳聚糖原料→加入降解敏化剂混匀→辐照→喷雾干燥→水剂产品→浓缩→喷雾干燥→粉体产品，具有快速、简便、高收率、低成本、有效产物含量高、不对环境造成污染等优点，十分有利于大规模工业化生产。

2.李军立，张波，马力.壳聚糖的超声波降解及最佳工艺研究.西华大学学报（自然科学版）.2011,30（5）：100-103.是以天然大分子量壳聚糖为原料，利用单一超声波降解法制备低聚壳聚糖，具有操作简单，成本低廉，产物简单，无污染，容易提取回收等优点。

但是这两种方法存在低聚壳聚糖降解过程控制和分子量分布等问题，其相对分子质量偏高。

四、复合降解法：即以上各降解方法的组合使用，目前是一个较新的研究领域。我们查到以下相关文献：

1.申请号：200610113614.6，发明名称：一种低聚壳聚糖的工业化制备工艺方法，摘要：本发明公开了一种低聚壳聚糖的工业化的生产工艺；采用纤维素酶结合过氧化氢的方法对高聚合度的壳聚糖进行降解。在纤维素酶降解中，壳聚糖(g)∶纤维素酶A(g)＝10∶1～0.8；纤维素酶的反应温度为55～60℃；反应时间为1.5～2.0h。在过氧化氢氧化降解中，过氧化氢用量为：壳聚糖(g)∶30％过氧化氢(mL)＝1∶1.0～0.8，过氧化氢的浓度为质量百分比；过氧化氢反应温度为75～80℃；反应时间为1～2.5h。再经过微滤、纳滤和干燥后，所得低聚壳聚糖产品的分子量低，分布单一。该工艺简单、运行方便，适合于大规模生产。

2.申请号：200810218806.2，发明名称：在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，摘要：本发明公开了在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法，该方法包括：壳聚糖乙酸溶液的配制；磁性壳聚糖微球的制备；磁性固定化纤维素酶的制备；低聚壳聚糖的制备；本发明不但可以提高高分子物质的降解率，而且为实现连续化生产提供理论依据，同时能够便于酶的回收、提高固定化酶的利用率，降低成本。

3.王科军，杨立强，薛珺，李凤仪，胡珊玲.微波辐射与稀土配位控制组合技术制备低聚壳聚糖.南昌大学学报（理科版）.2006,30（6）：556-559.以工业品高分子量壳聚糖为原料，采用微波辐射和稀土配位控制组合技术制备了低聚壳聚糖，所得产品的相对分子质量分布更均匀，降解的速率显著提高。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术过程可控性差、耗时、耗能、产物后续处理复杂、产品相对分子质量分布不均等问题，提供一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，通过利用微波-超声波联合与过氧化氢氧化交替作用于壳聚糖制备水溶性低聚壳聚糖，具有快速制备、易分离纯化、工艺过程环保、产品相对分子质量分布均匀等优点。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）制备壳聚糖溶液；

（2）向壳聚糖溶液加入过氧化氢溶液保温；

（3）在超声波-微波联合作用条件下进行降解反应，超声功率为10～100W，微波功率为160～640W，联合作用时间为1～10min；

（4）降解反应后的溶液用碱溶液调节pH至中性，经分离、干燥后即得到低聚壳聚糖，所得低聚壳聚糖的分子量为800～8000。

作为进一步的说明，以上所述过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶1～10ml的比例加入。

作为进一步的说明，以上所述保温温度为30～70℃，保温时间1～60min。

作为进一步的说明，以上所述过氧化氢溶液的质量浓度为0.5～15%。

作为进一步的说明，以上所述壳聚糖溶液的浓度为10～50g/L，是将壳聚糖与水混合后再加入醋酸溶解。

作为进一步的说明，以上所述碱溶液为NaOH、氨水或KOH。

作为进一步的说明，以上所述分离、干燥的操作步骤：是将调中性后的反应溶液进行离心分离，其分离液加入乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于-50～20℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖。

作为进一步的说明，以上所述乙醇溶液纯度为50～100%。

在本发明中，壳聚糖的脱乙酰度大于95%。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）物理与化学方法相结合，采用超声-微波联合与H₂O₂交替作用于高脱乙酰的壳聚糖，利用大分子壳聚糖不溶于中性或碱性水溶液的原理使大分子析出，离心去除，对产物进行真空冷冻干燥得到成品，本发明的材料廉价易得，生产过程操作简单，生产工艺可行性高，得到的产品质量良好，相对分子质量分布均匀，完全水溶，溶解度为100%，后续处理简单，具有一定的应用和推广价值。

（2）采用超声波-微波联合作用，相对于单一超声波或单一微波，具有更好的协同增效作用，大大减少了反应时间，分离纯化工艺简单，产物水溶性高。

附图说明

图1为原料壳聚糖①与产品低聚壳聚糖②的红外光谱图。

由图1可知，壳聚糖骨架的峰型基本不变，3367cm^-1～3381^-1处显示壳聚糖骨架上羟基因为氢键作用而产生的伸缩振动吸收峰以及N-H伸缩振动；1642～1650cm^-1范围内出现较强的氨基吸收峰；1384cm^-1处为C-CH₃处的变形振动峰；1255cm^-1处为C-H振动峰；1078cm^-1为C-O吸收峰，1154cm^-1为C-O-C伸缩振动吸收峰，897cm^-1～890cm^-1的吸收峰由呋喃糖环振动引起的，是壳聚糖骨架中β(1→4)糖苷键的特征吸收峰。

但降解后，壳聚糖分子中的特征吸收峰变化有如下特点，在3367cm^-1～3381^-1范围内的羟基因氢键作用其伸缩振动吸收峰强度改变，说明H₂O₂裂解出的·OH也可把一部分羟基氧化成羰基。1642cm^-1～1650cm^-1游离氨基吸收峰增强，说明降解过程中伴随着脱乙酰化反应；1384cm-1处的C-CH₃处的变形振动峰和1255cm^-1处的C-H振动峰没有发生明显变化，说明超声波-微波协同5％H₂O₂降解下不会引起壳聚糖的开环反应。897cm^-1～890cm^-1处的β(1→4)糖苷键的特征吸收峰强度发生改变，说明降解引起了β(1→4)糖苷键的断裂。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）先将大分子壳聚糖与水混合后再加入2%醋酸溶液溶解，得到浓度为10g/L的壳聚糖溶液；

（2）向溶解后的壳聚糖溶液加入10%过氧化氢溶液保温，保温温度为30℃，保温时间5min，过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶1ml的比例加入；

（3）在超声波-微波联合条件下进行降解反应，超声功率为10W，微波功率为160W，超声波-微波联合作用时间为1min。

（4）将降解反应后的溶液用质量浓度为4%NaOH溶液调节pH至中性，离心分离，其分离液加入纯度为50%乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于20℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖，其分子量为8963.2。

实施例2：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）先将大分子壳聚糖与水混合后再加入2%醋酸溶液溶解，得到浓度为50g/L的壳聚糖溶液；

（2）向溶解后的壳聚糖溶液加入2%过氧化氢溶液保温，保温温度为70℃，保温时间60min，过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶10ml的比例加入；

（3）在超声波-微波联合条件下进行降解反应，超声功率为50W，微波功率为640W，超声波-微波联合作用时间为10min。

（4）将降解反应后的溶液用质量浓度为4%NaOH溶液调节pH至中性，离心分离，其分离液加入纯度为100%乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于-50℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖，其分子量为1368.4。

实施例3：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）先将大分子壳聚糖与水混合后再加入2%醋酸溶液溶解，得到浓度为20g/L的壳聚糖溶液；

（2）向溶解后的壳聚糖溶液加入5%过氧化氢溶液保温，保温温度为60℃，保温时间5min，过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶5ml的比例加入；

（3）在超声波-微波联合条件下进行降解反应，超声功率为50W，微波功率为450W，超声波-微波联合作用时间为8min。

（4）将步骤（3）降解反应后的溶液用质量浓度为4%NaOH溶液调节pH至中性，离心分离，其分离液加入纯度为95%乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于-20℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖，其分子量为5912.9。

实施例4：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）先将大分子壳聚糖与水混合后再加入1%醋酸溶液溶解，得到浓度为30g/L的壳聚糖溶液；

（2）向溶解后的壳聚糖溶液加入8%过氧化氢溶液保温，保温温度为40℃，保温时间30min，过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶2ml的比例加入；

（3）在超声波-微波联合条件下进行降解反应，超声功率为50W，微波功率为360W，超声波-微波联合作用时间为2min。

（4）将步骤（3）降解反应后的溶液用质量浓度为4%NaOH溶液调节pH至中性，离心分离，其分离液加入纯度为85%乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于0℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖，其分子量为6249.6。

实施例5：

一种快速降解制备水溶性低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：

（1）先将大分子壳聚糖与水混合后再加入1%醋酸溶液溶解，得到浓度为40g/L的壳聚糖溶液；

（2）向溶解后的壳聚糖溶液加入15%过氧化氢溶液保温，保温温度为70℃，保温时间1min，过氧化氢溶液按壳聚糖∶过氧化氢溶液=1g∶8ml的比例加入；

（3）在超声波-微波联合条件下进行降解反应，超声功率为100W，微波功率为530W，超声波-微波联合作用时间为3min。

（4）将降解反应后的溶液用质量浓度为4%KOH溶液调节pH至中性，离心分离，其分离液加入纯度为100%乙醇溶液沉淀，再离心分离，分离后的沉淀于0℃下真空干燥，即得到低聚壳聚糖，其分子量为2637.6。

以实施例5的方法制备水溶性低聚糖，并用逐级沉淀的方法对产物进行分离检测，得到低聚壳聚糖产物分子量及分布的关系，如表1：

                表1

由表1可知，经过一定时间，反应液经离心分离干燥处理后，称重，第四级分子量分布比例为89.71%，平均均分子量在2350左右。