WIF1基因作为猪产仔数性状的遗传标记

摘要

WIF1基因作为猪产仔数性状的遗传标记。本发明属于遗传标记技术领域。涉及猪基因WIF1编码基因第5内含子的单核苷酸多态性（SNP）检测技术领域。步骤包括：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，单核苷酸多态性检测，标记与产仔数性状间相关性分析。公开了猪基因WIF1第5内含子的DNA序列和SNP分型的检测与遗传标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示，在序列表SEQ ID NO：1-7序列的133位bp处存在一个等位基因突变。该突变导致Ase1－RFLP多态性。本发明还公开了该遗传标记的制备方法与应用。

说明书

技术领域

本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及一种WIF1基因作为猪产仔数性状的分子标记及应用， 它包括猪WIF1基因突变位点的检测方法与应用。

背景技术

母猪的繁殖性状是猪重要经济性状之一，但由于其遗传力低且为限性性状特点，导致了母猪繁殖性状 常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与标记辅助选择（MAS）相 结合的方法，可以有效地加快猪产仔数性状的选择进展。目前，分子标记鉴别的方法主要有基因组扫描法 和候选基因法。而差异表达基因如果满足以下标准可以作为候选基因进行研究：染色体定位区域包含可分 离的QTL；研究对象调控特定数量性状的重要性以及在特定的数量性状中是否存在差异表达。

在前期工作基础中，检测到WNT通路中关键基因WIF1在大白猪和中国太湖猪排卵前卵泡中差异表 达。WIF1最初是被作为表达序列标签形式而在人的视网膜上发现的（Hsieh et al..A new secreted protein that binds to Wnt proteins and inhibits their activities.Nature,1999,398(6726):431-436），这个基因定位在12q14.3 上，编码379个氨基酸，分子量约为42KDa，其中包含了一个N-末端信号序列、大约140个氨基酸的WIF 结构域，五个表皮生长因子样重复区域以及一个亲水性的C-末端，可能与中胚层的分节运动有关。在非洲 蟾蜍、老鼠以及斑马鱼上都分离得到高度保守的同源序列。在WIF1各个区域的功能研究中，普遍认为WIF 结构域是最主要的功能结构区，WIF1基因与Wnts结合抑制Wnt信号的功能主要是由WIF结构域完成的。 WIF结构域同样是受体酪氨酸激酶Ryk的胞外结构域的组成部分，这说明Ryk受体同样可以结合Wnts并 参与了Wnt信号通路。而在人类的卵巢中，如果Ryk过量表达，则会发生癌变，造成卵巢癌的发生（Katso et al.Overexpression of H-Ryk in epithelial ovarian cancer:prognostic significance of receptor expression.Clin Cancer Res,2000,6(8):3271-81）。

发明内容

本发明的目的在于获得一种猪产仔数性状的遗传标记，克隆猪WIF1基因序列，寻找突变位点以及基 因多态性的检测方法，为猪的标记辅助提供一种选择方法。

本发明的技术方案如下：

本发明获得了一种猪产仔数性状的遗传标记，它是大白猪、太湖猪WIF1基因的DNA序列，其核苷 酸序列如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示；通过上述序列进行ClustalW比对提供了位于该扩增片段133碱基处存在 1个G/A突变（如图1所示），导致PCR-AseI-RFLP多态性。

申请人设计了一种扩增猪WIF1基因DNA序列的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

申请人提供了一种筛选猪产仔数性状的遗传标记的方法，其按照以下步骤制备：

从猪血液中提取基因组DNA。登录Ensembl数据库中下载猪WIF1基因序列作为靶序列，设计特异引 物（该引物的序列如序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示）。以大白猪和太湖猪的DNA为模板进 行扩增（图1），对PCR产物回收和克隆测序，得到如序列表SEQ ID NO：1-7所示的基因片段；进而进行 序列Clustalw比对，筛查SNP（如图3方框中所示碱基），在序列SEQ ID NO：1-7的133碱基处（即，该 基因第5内含子115bp处）发现G/A等位基因突变，该突变表现了大白猪和太湖猪种间差异，并引起了 AseI酶切位点（ATT↓AAT）多态性，SNP位点检测如图3所示。

本发明提供了鉴定上述序列G/A变异的AseI－RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）基因型分 型方法。其引物序列分别如序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，在猪基因组DNA中进行PCR 扩增，PCR扩增片段AseI酶切分型及检测。

进一步，本发明提供了利用AseI－RFLP方法确定猪不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析的应 用。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1：是扩增的中国血缘猪种“太湖猪个体1”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2：是扩增的中国血缘猪种“太湖猪个体2”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3：是扩增的中国血缘猪种“太湖猪个体3”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4：是扩增的国外血缘猪种“大白猪个体1”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5：是扩增的国外血缘猪种“大白猪个体2”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：6：是扩增的国外血缘猪种“大白猪个体3”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：7：是扩增的国外血缘猪种“大白猪个体4”的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：8：是制备SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7特异基因片段所用的正向引物，也 是实施猪WIF1基因第9内含子G/A变异AseI－RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）基因型分型 方法的正向引物。

序列表SEQ ID NO：9：是制备SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7特异基因片段所用的反向引物，也 是实施猪WIF1基因第9内含子G/A变异AseI-RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）基因型分型 方法的反向引物。

图1：分别是本发明扩增的太湖猪1（方框中序列R为碱基G）、太湖猪2（方框中序列R为碱基G）、 太湖猪3（方框中序列R为碱基G）、大白猪1（方框中序列R为碱基G）、大白猪2（方框中序列R为碱 基G）、大白猪3（方框中序列R为碱基A）和大白猪4（方框中序列R为碱基G）的核苷酸序列，图中方 框中序列R为突变碱基，导致Ase Ⅰ－RFLP多态性。

图2：是包括猪WIF1基因序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％；图中：M泳道为 DNAMarker DL2,000；泳道1-7为序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示引物在大白猪和太湖猪种 中的扩增片段，片段大小为592bp。

图3：是大白猪和太湖猪WIF1基因序列片段比对结果和SNP位点。是序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为592bp。图3方框中的碱基为突变碱基。

图4：是猪WIF1基因片段AseI-RFLP检测结果。琼脂糖胶浓度为2.0％；图中：泳道M为DL 2000Markers； 1、74泳道为AG基因型，片段大小分别为592bp，458bp，134bp；2、3、4、6泳道为AA基因型，片段大 小为458bp，134bp；5泳道为GG基因型，片段大小为592bp。

根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有 利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。

具体实施方式

实施例1：猪WIF1基因片段的获得及多态性检测方法的建立

登录Ensembl数据库中下载猪WIF1基因序列作为靶序列，利用Primer2软件在线设计引物。引物序 列如序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，具体如下：正向引物WIF1-F:GAG ACC TCT GTT CAA AGC GTAA,WIF1-R:ATT TGT TGG GTT CGT GGC。扩增区域包括猪WIF1基因第5内含子的592bp 的基因组核苷酸序列，如图1所示。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为 200μmol/L，每条引物浓度为0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶（Biostar International,Canada），加去离 子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性4min；然后94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经纯化（UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上 海生工生物工程技术有限公司），克隆后，进行序列测定，序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完 成。不同猪种的PCR产物序列经ClustalW软件进行序列比对，序列间比对结果见图2。上述扩增片段大 小为592bp，位于该片段133bp处（即，位于该基因第5内含子的第115个碱基）G/A突变，引起了AseI 酶切位点（ATT↓AAT）多态性。

PCR扩增，取8.5μl PCR产物加入0.5μl（10U/μl）限制性内切酶和1μl 10×buffer（含10×BSA），37℃ AseI酶切4h，取5μl酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果，如图3所示： 此扩增片段大小为592bp，在133bp处有AseI酶切位点，若该处碱基为G，则不存在AseI酶切位点，用 AseI酶切检测结果有134bp一条片段（G等位基因），当该位点为A时，结果导致一个AseI酶切位点的 产生，酶切得到两个片段，长度分别为134bp和458bp（A等位基因）。

实施例2：本发明制备的遗传标记在不同猪群中的多态性分布

猪基因组DNA的提取（样本见表1所示）方法参照熊远著《猪生化及分子遗传实验导论》中国农业 出版社，1999介绍的方法进行。

在3个群体猪，其中2个国外血缘猪群和1个合成系中国瘦肉猪新品系DIV系中检测猪WIF1基因 PCR-AseI-RFLP多态性，检测结果如表1所示。结果表明：在大白猪、湖北白猪DIV中存在3种基因型； 在所有检测的3个群体中，A等位基因频率为0.70-1.00，A等位基因为优势等位基因（见表1）。

表1猪WIF1基因PCR-AseI-RFLP在不同猪种中的分布结果

表1说明：上述群体材料均为中国公开推广的品种。其中：大白猪群体1、大白猪群体2为国外血缘 品种，分别来自于华中农业大学精品猪场、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场。DIV系全称为中 国瘦肉猪新品系DIV系，为中国地方猪与国外血缘猪杂交后培育的新品系，为中国公开推广应用的猪品系。

实施例3：本发明制备的遗传标记与产仔数性状的关联分析

为了确定猪WIF1基因PCR-AseI-RFLP与猪产仔数差异是否相关，选择本申请人的农业部猪遗传育种 重点实验室组建的110头中国瘦肉猪新品系DIV系和湖北省农业科学院畜牧兽医研究所的162头大白猪群 为试验材料，采用实施例2建立的AseI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪AseI-RFLP不同基因型与猪 产仔数性状的相关关系。采用SAS统计软件（SAS Institute Inc,Version 8.0）GLM程序进行单标记方差分 析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ijk=μ+G_i+Y_i+P_k+e_ijk

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应（包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0 和-1分别代表AA、AG和GG基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AG和GG基因型）；Y_j、P_k为固定效应，分别为年度和胎次效应；e_ijk为残差效应。

在中国瘦肉猪新品系DIV系和大白猪中进行了不同基因型与产仔数性状间关联分析，统计分析结果总 结于表2。

由表2可以看出，在大白猪中，GG和AA基因型总胎次活仔数显著比AG基因型高（P<0.05），GG 基因型总胎次产仔数显著比AG基因型高（P<0.05），显性效应为显著（P<0.1）。在中国瘦肉猪新品系DIV 系中，总胎次活仔数和总胎次产仔数都是GG高，但是三种基因型之间差异不显著。

表2猪WIF1基因PCR-AseI-RFLP基因型产仔数性状的统计分析表

注：

1、中国瘦肉猪新品系DIV系是中国普遍推广瘦肉型猪新品系。

2、以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示建议水平差异显著， 大写字母表示差异显著；加性效应正值表示A等位基因增加性状表型值。^*表示P<0.05,^#表示p<0.1。