水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法

摘要

本发明涉及一种水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法，属于环境质量安全检测技术领域。本发明将水体经预处理后利用多壁碳纳米管固相萃取柱富集净化，液相色谱—串联质谱仪进行定性定量分析。本发明方法操作方便，重现性较好，定性准确且回收率较高，能够快速分析水产养殖环境水体中的孔雀石绿及其代谢物含量。

说明书

技术领域

本发明属于环境质量安全检测技术领域，涉及一种水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量检测方法。

背景技术

孔雀石绿属于一种工业染料，在水产养殖中经常用来治疗水霉病、腮霉病以及环境的消毒等。研究表明孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿在动物体内消除缓慢，残留时间长，且具有致癌、致畸和致突变作用，欧美很多国家以及我国农业部公告第235号文件都将孔雀石绿列为禁止使用药物，规定在动物源性食品中不得检出。目前水产养殖中违规使用孔雀石绿的现象已得到各级政府部门的有效控制，但仍有少数渔民在使用孔雀石绿，再加上曾经孔雀石绿被广泛应用，对部分水产养殖环境已造成了污染，导致部分养殖环境水体中会残存孔雀石绿类药物，为后续的水产养殖带来安全隐患。此外，在部分水产品的市场流通环节中也会因为鱼体保活需要，一些非法分子在暂养水体中加入孔雀石绿。实际检测工作中也经常发现未使用孔雀石绿类药物进行疾病治疗的水产品也能检出孔雀石绿及其代谢物的存在。以上情况的存在一定程度上给水产品质量安全问题溯源工作带来麻烦。因此监测水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物含量水平对了解养殖环境安全状况、排查水产品中孔雀石绿污染来源和水产品质量安全监管工作具有积极意义。目前针对水产养殖环境水体中的痕量孔雀石绿及其代谢物检测方法的研究较少。如何通过有效地样品前处理技术和仪器分析技术，建立一种样品富集程度高、回收率高、重现性好和精确度高的水产养殖环境水体中孔雀石绿类残留检测方法成为研究的关键。

碳纳米管（Carbon nanotubes, CNTS）作为新型的功能性材料，在物理、化学和生物等领域得到了广泛应用。CNTS具有很强的吸附能力，可通过π—π作用力、范德华力和疏水相互作用等非共价作用力与目标物分子结合，具有高比表面积、良好的化学、机械稳定性和热稳定性等优点，可作为优良的气相色谱、毛细管电泳及高效液相色谱柱填充材料，也可作为吸附材料用于富集有机污染物、金属离子和生物大分子。由于CNTS材料具有的良好性能和低廉的价格优势，目前已有文献报道CNTS中的多壁碳纳米管（MWCNTS）用于水体中有机磷、有机氯、农药等样品的前处理和净化中。将多壁碳纳米管材料更多地用于兽药残留检测工作中对于拓展兽药残留前处理技术也具有积极的意义。孔雀石绿的检测技术有液相色谱和液相色谱-质谱联用。通过丙磺酸阳离子交换固相萃取柱或氧化铝固相萃取柱净化后，实现液相色谱—荧光检测、液相色谱—紫外检测和液相色谱—质谱联用分析检测。液相色谱法前处理复杂、耗时、检出限高和不利于准确定量和定性分析。水产养殖环境水体基质成分复杂，且污染物含量较低，若样品前处理过程中杂质去除不好，直接会干扰仪器的测定结果，因此将高效且成本低廉的碳纳米材料用于样品前处理技术是本发明的目的。

发明内容

本发明的目的是克服现有分析方法的不足，能找到一种快速、准确且成本低廉的养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物的测定方法，以实现水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物的定量及定性分析测定。

本发明方法包括以下步骤：⑴样品预处理、⑵固相萃取富集净化、⑶液相色谱—质谱检测，各步骤的操作方法如下：

⑴样品预处理：准确移取经过滤后的水样20～50mL，加入10ng氘代孔雀石绿和10ng氘代隐色孔雀石绿，加入色谱纯甲酸使其体积分数为0.04～0.10%。

⑵固相萃取富集净化：在3mL聚乙烯固相萃取小柱（SPE专用空柱）底部先放置一层孔径20μm石英砂滤芯筛板，加入20～60mg多壁碳纳米管材料（直径40～60nm，长度5～15μm，纯度＞95%，灰分≤2%，比表面积为40～300m²/g），上面再放置一层20μm滤芯筛板，通过调节上层滤芯筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.5～0.6cm；制作完成的多壁碳纳米管固相萃取柱先用5mL甲醇和5mL纯水润洗活化，然后将预处理后的水样全部转移至固相萃取柱中，控制流速在1.0mL/min；再向固相萃取柱中加入5mL纯水淋洗，弃去以上全部流出液；最后向固相萃取柱中加入5%甲酸乙腈4～6mL进行洗脱，收集洗脱液于10mL试管中。

⑶液相色谱—质谱检测：洗脱液经45～55℃下氮气吹干后，用2mL初始组成流动相充分溶解；取1mL样液，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱—质谱条件下进行检测，进行定性定量分析。色谱条件：C₁₈色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm），柱温40℃，进样量10μL，流动相组成为用甲酸调pH至4.5的5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液和乙腈，流速0.3 mL/min，梯度洗脱条件，0～3.0min，50%～5%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变），3.0～5.0min，5%～50%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变）；质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI⁺），毛细管电压3.50 kv，离子源温度120℃，脱溶剂气温度380℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h，多反应监测（MRM）扫描模式；绘制标准工作曲线，以内标法定量计算孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。

本发明的有益效果：本发明建立了水产养殖环境水体中孔雀石绿及其代谢物的检测方法；采用价格低廉的多壁碳纳米管材料作为固相萃取柱填料进行样品富集净化，净化效果好，有效地降低了杂质对测定过程的干扰；采用液相色谱—质谱法进行多反应离子监测，具有较高的灵敏度和精确度；与已有的测试技术相比，本发明在检测孔雀石绿及其代谢物过程中不需要价格较昂贵的商品化PRS阳离子交换或氧化铝固相萃取柱，方法可同时进行定性及定量测定，操作简单易行，消耗成本低，能够快速分析水产养殖环境水体中的孔雀石绿及其代谢物含量。

附图说明

附图1为1.00μg/L的标准品溶液色谱图；

附图2为孔雀石绿的子离子扫描图；

附图3为隐色孔雀石绿的子离子扫描图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例1 水产养殖池塘水体中孔雀石绿的液相色谱—质谱检测

⑴样品预处理：准确移取经过滤后的水样20mL，加入100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿混合内标溶液100μL，加入色谱纯甲酸使其体积分数为0.04%。

⑵固相萃取富集净化：在3mL聚乙烯固相萃取小柱（SPE专用空柱）底部先放置一层孔径20μm石英砂滤芯筛板，加入20mg多壁碳纳米管材料（直径40～60nm，长度5～15μm，纯度＞95%，灰分≤2%，比表面积为40～300m²/g），上面再放置一层20μm滤芯筛板，通过调节上层滤芯筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.5cm；制作完成的多壁碳纳米管固相萃取柱先用5mL甲醇和5mL纯水润洗活化，然后将预处理后的水样全部转移至固相萃取柱中，控制流速在1.0mL/min；再向固相萃取柱中加入5mL纯水淋洗，弃去以上全部流出液；最后向固相萃取柱中加入5%甲酸乙腈4mL进行洗脱，收集洗脱液于10mL试管中。

⑶液相色谱—质谱检测：洗脱液经45℃下氮气吹干后，用2mL乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）充分溶解；取1mL样液，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱—质谱条件下进行检测，进行定性定量分析。色谱条件：C₁₈色谱柱（50mm×2.1 mm，1.7μm），柱温40℃，进样量10μL，流动相组成为5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液和乙腈，流速0.3mL/min，梯度洗脱条件，0～3.0min，50%～5%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变），3.0～5.0min，5%～50%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变），获得出峰时间适中、峰形尖锐、分离度好的色谱图，出峰时间孔雀石绿1.06min，隐色孔雀石绿3.01min（见附图1）；质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI⁺），毛细管电压3.50 kv，离子源温度120℃，脱溶剂气温度380℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50L/h，多反应监测（MRM）扫描模式；孔雀石绿定量离子对329.3/313.2, 定性离子对329.3/208.1（见附图2），隐色孔雀石绿定量离子对331.2/316.2, 定性离子对331.2/239.2（见附图3）；绘制标准工作曲线，以内标法定量计算孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。

⑷标准曲线绘制

用乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）配制浓度分别为0.02μg/L、0.05μg/L、0.10μg/L、0.25μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L和5.00μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准溶液，内标物氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿浓度均为5.00μg/L，然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据内标法要求绘制标准曲线。

⑸方法回收率的测定

分别按0.002μg/L、0.005μg/L、0.010μg/L、0.10μg/L和0.20μg/L的浓度在池塘水体中添加孔雀石绿和隐色孔雀石绿的混合标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴～⑷进行液相色谱—质谱检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的浓度。方法回收率在84～112%，RSD＜15%。

实施例2 水产养殖池塘水体中孔雀石绿的液相色谱—质谱检测

⑴样品预处理：准确移取经过滤后的水样40mL，加入100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿混合内标溶液100μL，加入色谱纯甲酸使其体积分数为0.08%。

⑵固相萃取富集净化：在3mL聚乙烯固相萃取小柱（SPE专用空柱）底部先放置一层孔径20μm石英砂滤芯筛板，加入40mg多壁碳纳米管材料（直径40～60nm，长度5～15μm，纯度＞95%，灰分≤2%，比表面积为40～300m²/g），上面再放置一层20μm滤芯筛板，通过调节上层滤芯筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.55cm；制作完成的多壁碳纳米管固相萃取柱先用5mL甲醇和5mL纯水润洗活化，然后将预处理后的水样全部转移至固相萃取柱中，控制流速在1.0mL/min；再向固相萃取柱中加入5mL纯水淋洗，弃去以上全部流出液；最后向固相萃取柱中加入5%甲酸乙腈5mL进行洗脱，收集洗脱液于10mL试管中。

⑶液相色谱—质谱检测：洗脱液经50℃下氮气吹干后，用2mL乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）充分溶解；取1mL样液，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱—质谱条件下进行检测，进行定性定量分析。色谱条件：C₁₈色谱柱（50mm×2.1 mm，1.7μm），柱温40℃，进样量10μL，流动相组成为5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液和乙腈，流速0.3mL/min，梯度洗脱条件，0～3.0min，50%～5%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变），3.0～5.0min，5%～50%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变）；质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI⁺），毛细管电压3.50 kv，离子源温度120℃，脱溶剂气温度380℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h，多反应监测（MRM）扫描模式；孔雀石绿定量离子对329.3/313.2, 定性离子对329.3/208.1，隐色孔雀石绿定量离子对331.2/316.2, 定性离子对331.2/239.2；绘制标准工作曲线，以内标法定量计算孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。

⑷标准曲线绘制

用乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）配制浓度分别为0.02μg/L、0.05μg/L、0.10μg/L、0.25μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L和5.00μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准溶液，内标物氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿浓度均为5.00μg/L，然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据内标法要求绘制标准曲线。

⑸方法回收率的测定

 分别按0.002μg/L、0.005μg/L、0.010μg/L、0.10μg/L和0.20μg/L的浓度在池塘水体中添加孔雀石绿和隐色孔雀石绿的混合标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴～⑷进行液相色谱—质谱检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的浓度。方法回收率在78～103%，RSD＜15%。

实施例3 水产养殖池塘水体中孔雀石绿的液相色谱—质谱检测

⑴样品预处理：准确移取经过滤后的水样50mL，加入100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿混合内标溶液100μL，加入色谱纯甲酸使其体积分数为0.10%。

⑵固相萃取富集净化：在3mL聚乙烯固相萃取小柱（SPE专用空柱）底部先放置一层孔径20μm石英砂滤芯筛板，加入60mg多壁碳纳米管材料（直径40～60nm，长度5～15μm，纯度＞95%，灰分≤2%，比表面积为40～300m²/g），上面再放置一层20μm滤芯筛板，通过调节上层滤芯筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.6cm；制作完成的多壁碳纳米管固相萃取柱先用5mL甲醇和5mL纯水润洗活化，然后将预处理后的水样全部转移至固相萃取柱中，控制流速在1.0mL/min；再向固相萃取柱中加入5mL纯水淋洗，弃去以上全部流出液；最后向固相萃取柱中加入5%甲酸乙腈6mL进行洗脱，收集洗脱液于10mL试管中。

⑶液相色谱—质谱检测：洗脱液经55℃下氮气吹干后，用2mL乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）充分溶解；取1mL样液，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱—质谱条件下进行检测，进行定性定量分析。色谱条件：C₁₈色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm），柱温40℃，进样量10μL，流动相组成为5mmol/L乙酸铵缓冲溶液和乙腈，流速0.3mL/min，梯度洗脱条件，0～3.0min，50%～5%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变），3.0～5.0min，5%～50%（乙酸铵缓冲溶液，线性改变）；质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI⁺），毛细管电压3.50 kv，离子源温度120℃，脱溶剂气温度380℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h，多反应监测（MRM）扫描模式；孔雀石绿定量离子对329.3/313.2, 定性离子对329.3/208.1，隐色孔雀石绿定量离子对331.2/316.2, 定性离子对331.2/239.2；绘制标准工作曲线，以内标法定量计算孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。

⑷标准曲线绘制

用乙腈－5mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1，v/v）配制浓度分别为0.02μg/L、0.05μg/L、0.10μg/L、0.25μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L和5.00μg/L的孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准溶液，内标物氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿浓度均为5.00μg/L，然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据内标法要求绘制标准曲线。

⑸方法回收率的测定

分别按0.002μg/L、0.005μg/L、0.010μg/L、0.10μg/L和0.20μg/L的浓度在池塘水体中添加孔雀石绿和隐色孔雀石绿的混合标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴—⑷进行液相色谱—质谱检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的浓度。方法回收率在81—114%，RSD＜15%。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变化后的方案均属于本发明的保护范围。