一种用超高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中酚酸类成分含量的方法

摘要

本发明涉及一种用超高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中4种酚酸类成分含量的方法，该方法包括以下步骤：步骤1、对照品溶液的制备；步骤2、养血清脑颗粒制剂供试品溶液的制备；步骤3、将对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；步骤4、根据色谱图计算供试品溶液中4种酚酸类成分含量。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种药物成分的分析检测方法，特别涉及一种用超高效液相色谱法测定养血清 脑颗粒中4种酚酸类成分含量的方法。

背景技术：

养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司研制的现代中药制剂，并于1996年获得国 家新药证书，并于1999年被列入国家基本药物目录，2000年被列入国家医保药品目录。养血 清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、鸡血藤、决明子、延胡索等11味中药组成，并经现代高科 技手段提取后，加入适当辅料，经混合制粒等制剂过程制成的一种颗粒剂。该制剂具有有效成 分溶出快，生物利用度高等优点。养血清脑颗粒具有养血平肝，活血通络的功效，可用于血虚 肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症，在临床上具有显著的疗效。

养血清脑颗粒中的君药当归及主要成分川芎、白芍中均含有酚酸成分。近年来的研究表明 酚酸类化合物不仅具有显著的抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化以及预防心血管疾 病的作用,而且具有抗癌、抗炎症和血小板凝聚等功能,在医药方面有广泛的用途。如研究表明 绿原酸、阿魏酸、咖啡酸和迷迭香酸在心血管保护、抗诱变抗癌、抗血栓、抗炎、抗菌、 抗病毒、利胆止血及抗氧化等方面都有明显作用，对于酚酸类化合物的检测方法主要有分 光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法以及高效液相色谱法,文献报道，养血清脑颗粒中酚酸 类化合物的检测方法可以采用高效液相色谱电化学检测(HPLC一ECD)法,该方法可以对养血清 脑颗粒中没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸和阿魏酸同时进行测定。但检测方法操作复杂，精度不 高，实际操作过程中容易出现差错。目前对养血清脑颗粒中酚酸类有效成分的常规的检测方 法为高效液相色谱分析法（参见：任树林，养血清脑颗粒中4种酚酸的高效液相色谱分析；药 物分析杂志，2006,26（8）：1145）。但是，采用此方法分析时间较长，例如咖啡酸和阿魏酸保 留时间分别约为13min和20min，不利于工业化大生产过程中对产品的快速检测，因此不利于 实际生产中对养血清脑颗粒的质量评价和控制。

因此，需要提供一种养血清脑颗粒中酚酸类物质的检测方法，以加强对养血清脑颗粒的质 量控制。

发明内容：

本发明涉及一种用超高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中酚酸类成分含量的方法，该方法 包括以下步骤：

步骤1、对照品溶液的制备；

步骤2、养血清脑颗粒制剂供试品溶液的制备；

步骤3、将对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图；

步骤4、根据色谱图计算供试品溶液中4种酚酸类成分含量，

其中，检测样品采用50~100%的甲醇提取，色谱条件为采用C18色谱柱，流动相为甲酸乙 腈-甲酸水溶液，检测器为二极管阵列检测器。

本发明所述的4种酚酸类成分是咖啡酸、阿魏酸、绿原酸和迷迭香酸，这些酸都是已知成 分，记载在有关的药物手册中，本发明是对这4种酚酸类成分同时进行检测，以利于准确把握 养血清脑颗粒的有效成分的含量。

本发明的方法，其中，步骤1对照品溶液的制备是将咖啡酸、阿魏酸、绿原酸和迷迭香酸 这四种已知产品的标准对照品配制成溶液以便用于超高效液相色谱仪。

本发明所述对照品溶液的制备方法是：称取咖啡酸、阿魏酸、绿原酸和迷迭香酸这四种已 知产品的标准对照品，分别用70-80%甲醇配制成200-250μg/mL的咖啡酸溶液，200-250 μg/mL的阿魏酸溶液，250-300μg/mL的绿原酸溶液，200-250μg/mL的迷迭香酸溶液。

优选的配制方法是：准确称定咖啡酸、阿魏酸、绿原酸和迷迭香酸这四种已知产品的标准 对照品置于10mL容量瓶中以75%甲醇定容至刻度。分别得220μg/mL咖啡酸，232μg/mL 阿魏酸，271μg/mL绿原酸，219μg/mL迷迭香酸溶液，置于4℃冰箱待用。

其中步骤2、养血清脑颗粒制剂供试品溶液的制备是将养血清脑颗粒制剂配制成溶液以便 用于超高效液相色谱仪。

本发明所述供试品溶液的制备方法是：称量约0.25-0.75g养血清脑颗粒制剂，用70-80% 甲醇提取，提取液过滤，滤液配制成10ml的溶液。

优选的配制方法是：分别称量约0.5g各不同批次养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶 中，加75%甲醇溶液定容，超声提取15min，放至室温后，以75%甲醇补足至刻度，用0.45 微孔滤膜滤过，弃去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

其中，步骤3、将对照品溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，是将上 述配制好的溶液用针样注射器注入超高效液相色谱仪，样品经过仪器的测量，分别得到对照品 溶液和供试品溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：采用ACQUITY UPLC HSS T₃（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱柱，流动相为0.01%甲酸乙腈溶液（A）-0.01%甲酸水溶液（B）， 梯度洗脱（0~2min，10%A;2~10min，10%A→25%A;10~12min，25%A;12~15min， 25%A~90%A;15~17min，90%A~10%A;17~20min，10%A），体积流量0.4mL/min，柱温25～35℃， 进样量1.5～2.5μL，检测波长300～350nm。

在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.2~2.8min、 3.1~3.7min、6.5~7.1min和9.5~10.1min，4种酚酸能够得到有效分离，分离度均大于1.5， 以阿魏酸为指标理论塔板数大于80000，色谱图见图1。

所述步骤4、根据色谱图计算供试品溶液中4种酚酸类成分含量，是根据色谱图上有关峰 的峰高或峰面积按照计算公式进行对照计算，最后得到养血清脑颗粒制剂供试品中相应的4 种酚酸类成分含量数值，计算方法属于现有技术。

本发明优选的使用的仪器如下：Waters Acquity超高效液相色谱仪，二极管阵列（PDA） 检测器。Mettler Toledo XS105分析天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型数控 超声波清洗器（昆山，昆山市超声仪器有限公司）。

本发明优选的使用的试剂如下：

甲醇（色谱纯，美国Merk公司）；乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；甲酸（色谱纯，瑞士 Fluka公司）；怡宝纯净水（深圳，华润怡宝食品饮料有限公司）

咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102），阿魏酸对照品（中国 药品生物制品检定所，批号：110773-201012），绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批 号：110753-200413），迷迭香酸对照品（天津一方科技有限公司，含量＞98%），水杨酸（内标） 对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100126-200303）

养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司）批号100121～100132），

本发明优选的色谱条件和方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：

方法学考察和样品测定

线性关系考察

准确吸取配制的各标准品溶液，分别以75%甲醇稀释得标准曲线测试系列溶液:咖啡酸 0.5，1，2.5，5，10，25ng/mL;阿魏酸1，2，5，10，20，50ng/mL；绿原酸1，2，5，10， 20，50ng/mL；迷迭香酸2，5，10，20，40，100ng/mL.分别吸取2μL进样分析，每个浓 度进样3次。以质量浓度（C，ng/ml）为横坐标，以3次平均峰面积（A）为纵坐标进行线性 回归。线性回归方程分别为：咖啡酸y＝1.6438x-0.3949r＝0.9999;阿魏酸y＝1.6322x-0.719 r＝0.9995;绿原酸y＝0.96054x-0.5899r＝0.9994;迷迭香酸y＝0.67722x-0.8283r＝0.9996。 结果表明，咖啡酸、阿魏酸、绿原酸和迷迭香酸在上述浓度范围内均有良好的线性响应。

精密度

取批次为100127养血清脑颗粒，制备供试品溶液，进样2μL，连续进样6次，分别记 录峰面积并计算精密度。结果绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的峰面积RSD分别为1.1%、 2.0%、1.8%、1.5%，说明方法精密度良好。

稳定性

取批次为100127养血清脑颗粒，制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12h分别进样2μL， 分别记录峰面积并计算稳定性。结果绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的峰面积RSD分别为 2.2%、2.9%、3.1%、2.1%，说明4种成分稳定性良好。

重复性

取批次为100127养血清脑颗粒，制备6份供试品溶液，进样2μL，分别记录峰面积并 计算重复性。结果绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的峰面积RSD分别为1.2%、1.2%、1.6%、 2.0%，表明方法重复性良好。

加样回收率

取批次为100127养血清脑颗粒，精密称取0.25g样品置于10mL容量瓶中，精密移取各 对照品溶液绿原酸300μL、咖啡酸100μL、阿魏酸250μL、迷迭香酸600μL，其余按供 试品溶液方法处理，平行6份。结果见表1

表1酚酸回收率测定结果

Tab 2results of recoveries for for phenolic acid

样品测定

取各批次养血清脑颗粒（100121～100132）样品共12批，制备供试品溶液，平行3份， 进样2μL。通过各成分峰峰面积按外标法求算得各批次养血清脑颗粒中所含绿原酸、咖啡酸、 阿魏酸和迷迭香酸含量，见表2。由12批样品的检测结果得出养血清脑颗粒中绿原酸、咖啡 酸、阿魏酸和迷迭香酸的平均含量分别为396μg/g、82μg/g、251μg/g和582μg/g.

表2养血清脑颗粒中4种酚酸的测定

Tab 3determination of 4phenolic acid in Yangxue Qingnao particles(n=3)

由于酚酸类成分pH较低，且极性较大，最终选择采用封端技术和新型键和填料的Waters  HSS T₃柱作为分析柱,该色谱柱在高含水量、低pH值条件下能对极性大组分有较好的保留和分 离效果；本实验中考察了柱温（不控温、30℃、40℃）对分离效果的影响使用，结果表明30℃ 控温的情况下，制剂中待测组分峰行对称，分离度高且分析结果稳定；在以获得较高灵敏度以 及降低其他组分的干扰的前提下，选择327nm为4种酚酸的检测波长；实验考察了不同流动 相体系（甲醇-水、乙腈-水、含酸和不含酸）对实验的影响，结果表明含酸的乙腈-水体系下 能够得到更好的峰形与分离效果。

实验中样品的提取比较了不同提取溶剂（100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇）以及不同提取方 式（冷提、回流提取、超声提取）对提取结果的影响，结果显示以75%甲醇溶剂超声提取操作 简便省时且能够有效提取复杂中药制剂中的有效组分；由于阿魏酸光照条件下不稳定，易发生 变构，配制的样品需要避光保存。

本实验通过超高效液相（UPLC）建立分析养血清脑颗粒中4种酚酸含量的方法，相比传统 HPLC方法需要30min~60min，大大缩短了分析时间，且方法灵敏度、精密度高、重现性好， 能够在制剂的质量控制中发挥更好的作用。

提取溶剂的优化实验：

为了筛选最优提取溶剂，发明人在50%~100%的甲醇之间选取3个浓度，分别以100%甲 醇、75%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂，制备供试品溶液，分别测得4组分——绿原酸、阿魏 酸、咖啡酸和迷迭香酸——的目标峰面积，并将75%处理样品中各组分面积记为100%，得不同 提取溶剂提取率，结果如表3所示：

表3不同浓度甲醇对提取率的影响

从实验结果综合考虑，选择75%甲醇为最佳提取溶剂。

参考文献

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附图说明：

图1为混合对照品（A）和养血清脑颗粒制剂（B）的UPLC色谱图

其中1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.阿魏酸（ferulic acid）4.迷迭香酸 （rosmarinic acid）

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、检测方法

仪器与试药

Waters Acquity超高效液相色谱仪，二极管阵列（PDA）检测器。Mettler Toledo XS105分 析天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山，昆山市超声仪 器有限公司）。

甲醇（色谱纯，美国Merk公司）；乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；甲酸（色谱纯，瑞 士Fluka公司）；怡宝纯净水（深圳，华润怡宝食品饮料有限公司）

咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102），阿魏酸对照品（中国 药品生物制品检定所，批号：110773-201012），绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批 号：110753-200413），迷迭香酸对照品（天津一方科技有限公司，含量＞98%），水杨酸（内 标）对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100126-200303）

养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司）批号100121～100132），

溶液的配制

对照品溶液的制备

取对照品适量，准确称定置于10mL容量瓶中以75%甲醇定容至刻度。分别得220μg/mL 咖啡酸，232μg/mL阿魏酸，271μg/mL绿原酸，219μg/mL迷迭香酸溶液，置于4℃冰箱待用。

制剂供试品溶液的制备

分别称量约0.5g各不同批次养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加75%甲醇溶液 定容，超声提取15min，放至室温后，以75%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤过，弃去 初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性

采用ACQUITYUPLC HSS T₃（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱柱，流动相为0.01%甲酸乙腈 溶液（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min，10%A;2～10min，10%A→25%A;10～12min， 25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min，90%A～10%A;17~20min，10%A），体积流量0.4 mL/min，柱温30℃，进样量2μL，检测波长325nm。在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿 魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.5min、3.4min、6.8min和9.8min，4种酚酸能够得到有效 分离。

实施例2、检测方法

仪器与试药

Waters Acquity超高效液相色谱仪，二极管阵列（PDA）检测器。Mettler Toledo XS105 分析天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山，昆山市超声 仪器有限公司）。

甲醇（色谱纯，美国Merk公司）；乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；甲酸（色谱纯，瑞 士Fluka公司）；怡宝纯净水（深圳，华润怡宝食品饮料有限公司）

咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102），阿魏酸对照品（中国 药品生物制品检定所，批号：110773-201012），绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批 号：110753-200413），迷迭香酸对照品（天津一方科技有限公司，含量＞98%），水杨酸（内 标）对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100126-200303）

养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司）批号100121～100132），

溶液的配制

对照品溶液的制备

取对照品适量，准确称定置于10mL容量瓶中以70%甲醇定容至刻度。分别得200μg/mL 咖啡酸，200μg/mL阿魏酸，250μg/mL绿原酸，200μg/mL迷迭香酸溶液，置于4℃冰箱待用。

制剂供试品溶液的制备

分别称量约0.25g各不同批次养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加70%甲醇溶 液定容，超声提取10min，放至室温后，以70%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤过，弃 去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性

采用ACQUITYUPLC HSS T₃（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱柱，流动相为0.01%甲酸乙腈 溶液（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min，10%A;2～10min，10%A→25%A;10～12min， 25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min，90%A～10%A;17~20min，10%A），体积流量0.4 mL/min，柱温30℃，进样量2μL，检测波长325nm。在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿 魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.5min、3.4min、6.8min和9.8min，4种酚酸能够得到有效 分离。

实施例3、检测方法

仪器与试药

Waters Acquity超高效液相色谱仪，二极管阵列（PDA）检测器。Mettler Toledo XS105分 析天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山，昆山市超声仪 器有限公司）。

甲醇（色谱纯，美国Merk公司）；乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；甲酸（色谱纯，瑞 士Fluka公司）；怡宝纯净水（深圳，华润怡宝食品饮料有限公司）

咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110885-200102），阿魏酸对照品（中国 药品生物制品检定所，批号：110773-201012），绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批 号：110753-200413），迷迭香酸对照品（天津一方科技有限公司，含量＞98%），水杨酸（内 标）对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100126-200303）

养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司）批号100121～100132），

溶液的配制

对照品溶液的制备

取对照品适量，准确称定置于10mL容量瓶中以80%甲醇定容至刻度。分别得250μg/mL 咖啡酸，250μg/mL阿魏酸，300μg/mL绿原酸，250μg/mL迷迭香酸溶液，置于4℃冰箱待用。

制剂供试品溶液的制备

分别称量约0.75g各不同批次养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加80%甲醇溶 液定容，超声提取20min，放至室温后，以80%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤过，弃 去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性

采用ACQUITYUPLC HSS T₃（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱柱，流动相为0.01%甲酸乙腈 溶液（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min，10%A;2~10min，10%A→25%A;10~12min， 25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min，90%A~10%A;17~20min，10%A），体积流量0.4 mL/min，柱温30℃，进样量2μL，检测波长325nm。在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿 魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.5min、3.4min、6.8min和9.8min，4种酚酸能够得到有效 分离。

实施例4、

对照品储备液的制备同实施例1。

制剂供试品溶液的制备：称量约0.5g养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加60% 甲醇溶液定容，超声提取15min，放至室温后，以60%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤 过，弃去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性：采用ACQUITYUPLC BEH HILIC（100mm×2.1mm,1.8μm）色 谱柱，流动相为0.02%甲酸乙腈溶液（A）-0.02%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min， 10%A;2~10min，10%A→25%A;10~12min，25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min， 90%A~10%A;17~20min，10%A），体积流量0.5mL/min，柱温28℃，进样量1.7μL。检测器 为二极管阵列检测器，检测波长325nm。

在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.6min、3.5min、 6.9min和9.9min，4种酚酸能够得到有效分离，分离度均大于1.5。

实施例5

对照品储备液的制备同实施例1。

制剂供试品溶液的制备：称量约0.5g养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加80% 甲醇溶液定容，回流提取15min，放至室温后，以80%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤 过，弃去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性：采用ACQUITYUPLC HSS C18（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱 柱，流动相为0.04%甲酸乙腈溶液（A）-0.04%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min， 10%A;2~10min，10%A→25%A;10～12min，25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min， 90%A～10%A;17~20min，10%A），流动相速度0.6mL/min，柱温33℃，进样量2.3μL。检测 器为二极管阵列检测器，检测波长340nm。

在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.7min、3.6min、 7min和10min，4种酚酸能够得到有效分离，分离度均大于1.5。

实施例6、

对照品储备液的制备同实施例1。

制剂供试品溶液的制备：称量约0.5g养血清脑颗粒制剂，置于10mL容量瓶中，加75% 甲醇溶液定容，超声提取15min，放至室温后，以75%甲醇补足至刻度，用0.45微孔滤膜滤 过，弃去初滤液取续滤液做为制剂供试品溶液。

色谱条件及系统适应性：采用ACQUITYUPLC BEH C18（100mm×2.1mm,1.8μm）色谱 柱，流动相为0.01%甲酸乙腈溶液（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2min， 10%A;2～10min，10%A→25%A;10～12min，25%A;12~15min，25%A~90%A;15~17min， 90%A～10%A;17~20min，10%A），流动相速度0.38mL/min，柱温30℃，进样量2μL。检测 器为二极管阵列检测器，检测波长325nm。

在此色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸的保留时间分别为2.3min、3.3min、 6.7min和9.6min，4种酚酸能够得到有效分离，分离度均大于1.5。