一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗

摘要

本发明公开了一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗，将LC3b的基因与HIV抗原基因融合，进而将该融合基因克隆到疫苗载体中构建出新的疫苗。根据动物实验数据可以预见，相比于其他技术的HIV疫苗，使用本发明中的方法设计的HIV疫苗可以诱发更为强烈的，更为广谱以及更加多功能性的T淋巴细胞，尤其是多功能的CD4+T细胞反应，该方法还可以诱发强烈的B细胞反应。本发明技术可以普遍应用于预防和治疗艾滋病。

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗。

背景技术

自1984年发现艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS）至今，30年中，在艾滋病的治疗与预防方面，取得了极大的进步。然后，艾滋病仍然是全球威胁人民健康的最严重的疾病之一。截至2012年底，全球有约3400万的人感染艾滋病，累计死亡人数超过3000万。

目前为止，还未见有效的HIV疫苗应用于临床。一直以来，HIV诱发的特异性的细胞免疫反应，尤其是CD8+ T细胞免疫反应被认为是主要控制HIV病毒复制。因此，很多HIV疫苗的设计都是基于此点，诱发更强烈的CD8+ T 细胞反应以降低病毒载量。然而STE，Phambili，HVTN505等临床试验的失败表明：仅靠诱发强的CD8+ T 细胞反应来预防或者控制HIV是远远不够的。在经历了数次的临床失败后，近年来，对于HIV疫苗的CD4+ T淋巴细胞反应逐渐受到关注，或许诱发强烈，多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应是HIV疫苗发展的另一个方向。

均衡的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫反应或许可以更好的控制HIV。 STEP，Phambili，HVNT505失败的原因之一很有可能就是基于5型腺病毒（Ad5）载体的HIV疫苗诱发了强的CD8+ T细胞免疫反应而相对弱的CD4+ T细胞反应。在泰国进行的一项HIV疫苗三期临床试验（RV144）有效的预防了HIV病毒，这是首次在临床水平证实HIV疫苗具有保护性。RV144试验中所诱发的CD4+ T细胞反应主要是针对于HIV-1 env的V2区，而且高水平的针对V1V2区的抗体很有可能能够有效的抑制或抵抗HIV-1病毒的感染。RV144试验表明诱发强的HIV特异性的CD4+ T细胞免疫反应对HIV疫苗的效果的发挥有重要的作用。

在哺乳动物中，LC3蛋白有3种形式：LC3a，LC3b，LC3c。可合成微管相关蛋白1轻链（microtuble associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3b，LC3b ）有2种形式，LC3b-I和LC3b-II。LC3-I游离于细胞质中，和磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3b-II。LC3b-II是唯一的已知的可以特异性的定位在自噬体膜上的蛋白。当发生自噬的时候，在胞质中，游离的LC3b-I就会转化为LC3b-II，LC3b-II共价结合与自噬体的膜上，从而形成自噬体完整的膜结构。LC3b-II也是自噬体发生的Marker。有研究报道，将流感蛋白MP1与LC3b融合从而通过自噬途径把MP1递呈至CD4 T细胞识别，提高CD4+ T细胞免疫反应。但是，未有文献报导这种递呈作用具有普遍性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HIV疫苗。

本发明所采取的技术方案是：

一种HIV疫苗，疫苗含有HIV目的抗原基因与LC3基因的融合基因，HIV目的抗原基因选自HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev。

作为本发明的进一步改进，LC3基因为LC3b基因。

作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒或病毒。

作为本发明的进一步改进，疫苗的载体为质粒pVAX载体或腺病毒AD5载体。

作为本发明的进一步改进，将HIV目的抗原基因与LC3基因融合，使表达出的融合蛋白中，HIV目的抗原与LC3蛋白的N端融合。

本发明的有益效果是：

动物模型实验数据显示，通过融合LC3b到SIVgag蛋白，可以诱发更加强烈，广谱，多功能性的CD4+ T淋巴细胞反应。并且，这种方法是安全可行的。本发明的疫苗可以普遍用于预防和治疗艾滋病。

附图说明

图1是携带SIVgag-LC3b的DNA载体和Ad5载体的构建；图1A是携带有的LC3b，SIVgag，SIVgag-LC3b的示意图，图1B是用western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测，分别使用Anti-SIVgag和Anti-LC3b抗体；图1C是用western-blot的方法检测重组腺病毒蛋白水平的检测；

 图2是靶向SIVgag到自噬体的细胞定位图；

 图3是靶向SIVgag到溶酶体（图3A）和MIICs的细胞定位图（图3B）；

 图4是ELISOPT检测疫苗诱发的IFN-γ分泌水平；图4A是免疫策略；图4B是DNA疫苗初免后（4周），ELISPOT检测IFN-γ分泌水平；图4C是腺病毒加强后（6周），ELISPOT检测IFN-γ分泌水平；

 图5是多色流式技术（ICS）检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；图5A是设定阳性细胞阈值的策略图；图5B是DNA疫苗初免后（4周），ICS检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；图5C为腺病毒加强（8周），ICS检测Gag肽刺激CD4+ T细胞分泌细胞因子的结果；

图6是小鼠免疫6周后，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测SIV特异性抗体分泌水平。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明。

下列实验中未提及的具体实验方法，通常按照现有常规实验方法进行。

鉴于现有技术中缺乏HIV的实验模型，以下实验中，使用SIV实验模型对疫苗的效果进行评价。

一、疫苗的构建

基因的获得：从NCBI数据库中得到LC3b基因序列，通过全基因合成得到LC3b基因。LC3b的基因序列如SEQ ID NO：1所示，SIVgag的基因序列SEQ ID NO：2所示；携带有SIVgag的 pVAX载体以及Ad5-SIVgag重组腺病毒由本实验室保存。

疫苗的构建

质粒载体外源元件的插入顺序如如图1 A所示。SIVgag-LC3b融合基因表达出的融合蛋白中，SIVgag蛋白与LC3蛋白的N端融合。

按照常规的方法将合成的LC3b基因构建到pVAX 质粒载体上，即pVAX-LC3b。通过酶切，连接的方法将LC3b和SIVgag共同构建于pVAX载体上，即 pVAX-SIVgag-LC3b图1B 是用Western-blot方法检测重组pVAX载体蛋白表达水平的检测。pVAX-LC3b，pVAX-SIVgag-LC3b均的到正确表达。SIVgag在融合了LC3b后，条带上移，表达结果符合预期大小。

重组腺病毒的构建，扩增，纯化与鉴定

按照常规的重组腺病毒构建方法将LC3b和SIVgag-LC3b构建到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了E1和E3区域的人五型腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，少量扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID₅₀和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用（相关方法的具体操作步骤可参见CN101219221A）。图1C是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图；Ad5-SIVgag可表达p55和p27，而Ad5-SIVgag-LC3b表达的条带大小为71Ka和43Ka，表明融合蛋白表达正确。无论用Anti-SIVgag，还是Anti-LC3b抗体均得到相同的结果。并且与DNA疫苗表达结果一致。

 

二、靶向SIVgag到自噬体，溶酶体，MIICs的检测

1.实验材料

1.1细胞

稳定表达GFP-LC3b的Hela细胞系，Hela细胞系，小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系。

1.2抗体

一抗：Anti-MHCII（品牌：Abcam；货号：ab64528），Anti-LAMPII（品牌：Abcam；货号：ab37024），Anti-SIVgag（美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program）提供）。

二抗：Alexa Fluro 488标记山羊抗小鼠IgG（H+L） （品牌：碧云天；货号：A0428），Cy3-标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0521），Alexa Fluro 488标记山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0423），Cy3-标记山羊抗大鼠IgG（H+L）（品牌：碧云天；货号：A0507）。

其他：DAPI（品牌：碧云天；货号：C1002）。

实验操作

2.1实验步骤

1）用4%多聚甲醛（Paraformaldehyde）固定细胞10min；

2）弃固定液0.2%吐温20（TWEEN-20）透膜10min；

3）弃透膜液，PBS洗3遍，每遍5min；

4）1%牛血清白蛋白封闭1h；

5）弃封闭液，一抗体孵育2h；

6）弃一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

7）相应二抗孵育1h；

8）弃二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

9）DAPI染核3min；

10）镜下观察。

2.2检测系统

使用激光共聚焦显微镜（LEICA DMI6000B）观察细胞。

实验结果

在载体构建正确后，在细胞水平检测SIVgag是否被LC3b靶向到自噬体，并最终被MHCII递呈至CD4+ T细胞识别。

3.1靶向SIVgag到自噬体

转染pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b到稳定表达GFP-LC3b的Hela细胞系。转染36h后，加入氯喹（CQ）,并设不加CQ组做对照。转染48h后，将细胞如上述实验步骤处理，在激光共聚焦显微镜下观察。如图2所示，在融合了LC3b后，SIVgag在胞质中聚集成点，并且可与GFP-LC3b共定位，说明LC3b靶向SIVgag到自噬体。而SIVgag在胞质中是弥散的分布的，不能聚集成点，无法与GFP-LC3b共定位。

3.2靶向SIVgag到溶酶体和MIICs

转染pVAX-SIVgag，pVAX-SIVgag-LC3b到Hela细胞，具体操作如上述实验步骤。如图3A所示，融合蛋白可以成点并与LAMPII共定位，证明SIVgag 在溶酶体/自噬溶酶体中存在。而SIVgag不可成点，弥散的分布于细胞质中，也无法与LAMPII共定位。

鼠巨噬细胞RAW264.7感染Ad5-SIVgag，Ad5-SIVgag-LC3b腺病毒，感染36h后加入氯喹（CQ）,并设不加CQ组做对照。剩余步骤如上述实验步骤。如图3B所示，融合蛋白可以成点并与MHCII共定位，表明SIVgag被运送至MIICs中。而SIVgag弥散与细胞质中，无法与MHCII定位。

 

三、疫苗在小鼠模型中的免疫原性

在证实LC3b能够靶向SIVgag到自噬体，并通过自噬这条途径将SIVgag最终有效的递呈至CD4+ T淋巴细胞后。进一步研究融合了LC3b的SIVgag是否能够在机体内发挥作用而有效的提高CD4+ T淋巴细胞反应。

1．实验材料    

1.1流式抗体

所用单克隆抗体，抗鼠anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC (BD Biosciences) anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7 (BD Pharmingen)购自BD公司。

1.2 SIVgag抗原多肽

SIVgag多肽由美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program）提供，大部分肽由15个氨基酸组成，两两之间有11个氨基酸重叠，纯度>80%。用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成0.4mg/ml/肽的储存液，分装后-70℃保存。

1.3其他试剂

ELISPOT 板(品牌：Millipore；货号：MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIVgag蛋白购自苏州杰恩生物技术有限公司，TMB/E底物（货号：ES001）购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物（品牌：Pierce；货号：34042）购自广州吉泰生物科技有限公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶（品牌：BD PharMingen，货号：554065）购自基因有限公司。

2、实验方法

2.1实验动物和免疫策略

每组8只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。DNA疫苗免疫剂量为50μg/100μL/只；腺病毒疫苗免疫剂量为1×10⁹vp/只/100μL，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50μL。共免疫4次，间隔2周。免疫策略如图4A所示。免疫2次DNA疫苗后（即4周），每组随机取4只，处死，进行免疫检测。剩余4只继续注射腺病毒疫苗。

2.2 多色流式技术检测多功能 T 细胞

1）分离好的PBMC细胞计数后调整至2×10⁶/ml，加入到96孔培养板,每孔200μL；培养基为R10；

2）在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMSO，阳性对照加入佛波酯（PMA）（20ng/ml）+离子霉素（1000ng/ml）； 

3）37 ℃, 5％CO₂培养1-2h； 

4）加入布雷菲德菌素（BFA）（10μg/ml）混匀； 

5）37 ℃, 5％ CO₂培养16h； 

6）吹打均匀细胞，转移至流式管中（12×75mm 聚苯乙烯管）；加入1ml 流式洗液；混匀后300g室温离心10分钟； 

7）弃上清；分别加入细胞表明标记抗体，如anti-CD3-PerCP, anti-CD4-FITC and anti-CD8-APC，振荡2－3秒； 

8）室温避光放置25－30分钟； 

9）加入3ml FACS 洗液；混匀后300g室温离心10分钟； 

10）重复洗涤一次； 

11）振荡均匀细胞，然后加入250μl 细胞固定/通透液（cytofix/cytoperm，品牌：BD；货号：554722），混匀； 

12）4℃，避光反应20min； 

13）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash，品牌：BD Biosciences；货号：554723；产品为10倍，用之前用无菌蒸馏水稀释至1倍），400g，离心8min；弃上清； 

14）重复一次； 

15）弃上清，加入anti-IFN-γ-PE, anti-TNF-α-PE-cy7, anti-IL-2-APC-cy7（各10μL抗体），混匀； 

16）4℃避光30－60分钟；

17）加入1ml 1×细胞通透/洗涤液（perm/wash），400g，离心8min； 

18）弃上清，加入1ml 流式洗液；混匀后400g室温离心10分钟； 

19）吸走大部分上清，约留300μl；振荡混匀后上机；

20）在FACSAria流式细胞仪上检测，用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit 软件分析。 

2.3 IFN-γ酶联免疫斑点技术

第一天： 

取一管包被抗体（抗鼠IFN-γ 抗体对其中包含有这个抗体，品牌：BD，PharMingen；克隆号为R4-6A2）用无菌PBS（pH7.2-7.4）1:100稀释，100μl/孔加入到96孔 PVDF膜板，4℃包被过夜。

第二天： 

1） 甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200μl R10完全培养基，37℃封闭 2小时； 

2） 封闭期间分离PBMC；采用95%稀释的淋巴细胞分离液（商品名为opti-prep）分离淋巴细胞；

3） 弃去封闭液，每孔加入100μl PBMC；

4） 实验中设阳性对照组（ConA组），特异肽，空白对照（DMSO）；在37℃ 5%CO2培养箱中孵育； 

第三天： 

5） 24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220μl/well洗涤6次； 

6） 甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干； 

7） 用含5％FBS的PBST按1:400稀释检测抗体（生物素标记的抗鼠IFN-γ 抗体），100μl/well，4℃过夜； 

第四天： 

8） 用无菌PBST 220μl/孔洗涤4次； 

9） 甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干； 

10） 配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5％FBS的PBST按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100μl/孔，37℃，2小时； 

11） 处理BCIP/NBT底物（Pierce, Cat：34042）,37℃温浴30min； 

12） 用无菌PBST 220μl/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干； 

13） 加入BCIP/NBT底物，100μl/孔，避光反应7min； 

14） 弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。

2.4 ELISA检测SIVgag特异性结合抗体

1）用SIVgag蛋白包板，浓度为1μg/ml，过夜；

2）弃包被蛋白， PBST洗3遍，每次5min；

3）4%的脱脂奶粉封闭1h；

4）4%的脱脂奶粉2倍比稀释待检测的小鼠血清，每孔100μL，37℃，2小时；

5）弃血清，PBST洗3遍，每次5min；

6）辣根过氧化物标记山羊抗小鼠1：5000稀释，每孔100μL，37℃，1小时；

7）弃上清，PBST洗3遍，每次5min；

8）加入TMB/E显色，每孔100μL，室温避光10min；

9）加入1mol/L硫酸终止反应；

10）读板：使用Synergy? HT Multi-Mode Plate Reader (BioTek Instruments, Inc., Vermont, USA)在450nm吸光值下读板。

 

3.实验结果

3.1  SIVgag-LC3b融合蛋白可以诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应

比较了SIVgag和SIVgag-LC3b在小鼠体内的免疫源性，ELISPOT检测IFN-γ的分泌情况。如图4B所示，在DNA疫苗初后，即免疫4周以后，免疫SIVgag-LC3b组诱发的更强的免疫反应，与免疫SIVgag组比较，产生的斑点是其2.5倍（59/23），差异极显著（p=0.0006）。在用腺病毒加强免疫后，即免疫6周以后，针对SIVgag特异性的免疫应答显著增强，免疫SIVgag-LC3b组平均产生749个斑点（百万个PBMC细胞），而免疫SIVgag组平均产生420个斑点，差异极显著（p=0.0019）。无论是单独使用DNA疫苗免疫还是在腺病毒疫苗加强后，免疫SIVgag-LC3b组都要比免疫SIVgag组免疫反应高出1倍左右。

融合蛋白诱发更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应

ELISPOT检测的是总IFN-γ的量，进一步检测CD4+ T，CD8+ T细胞抗原特异性的免疫反应。图5B是只免疫DNA疫苗所诱发的CD4+ T细胞反应，免疫SIVgag-LC3b组CD4+ T分泌IFN-γ，TNF-α，IL-2的细胞远远高于免疫SIVgag组，约为2-3倍左右；分泌细胞因子IFN-γ/ TNF-α，IFN-γ/ IL-2，IFN-γ/ TNF-α/ IL-2的多功能性CD4+ T细胞的也均高于SIVgag组，多功能性CD4+ T细胞的增多对于HIV疫苗来说是非常重要的。在两次腺病毒加强免疫反应后，如图5C所示，这种差距进一步被拉大，免疫SIVgag-LC3b组CD4+ T细胞分泌的IFN-γ，TNF-α，IL-2比免疫SIVgag组增强了将近10倍左右。更为有意义的是，多功能性CD4+ T细胞，尤其是同时分泌3种细胞因子的多功能CD4+ T细胞增多非常明显。从图5D，5E可以看出，无论是单独注射DNA疫苗，还是腺病毒疫苗加强，免疫SIVgag-LC3b组分泌单细胞因子的CD4+ T细胞以及多功能性CD4+ T都更为均衡。

融合蛋白可以诱发出更强的SIVgag特异的结合抗体

由于单独的DNA疫苗所诱发的免疫方面整体是比较弱的，因此只检测了第一次腺病毒加强后的小鼠血清中的抗体水平。如图6所示，免疫SIVgag-LC3b组，SIVgag特异性的结合抗体显著（p=0.01）高于免疫SIVgag组。

根据上述实验结果，可以预见，当使用HIV目的抗原基因，如HIV gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、vpx、rev，特别是同源性最高的HIV gag替换SIV gag基因时，制备得到的HIV疫苗可以表达出HIVgag-LC3b融合蛋白，进而诱发更强的抗原特异性的细胞免疫反应，更强更多功能性的CD4+ T淋巴细胞免疫反应。

<110>  中国科学院广州生物医药与健康研究院

 

<120>  一种引发强效CD4+ T细胞免疫反应的新型HIV疫苗

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  378

<212>  DNA

<213>  鼠

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  1565

<212>  DNA

<213>  猴免疫缺损病毒（Simian Immunodeficiency Virus）

 

<400>  2

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