来源于怒江藤黄的抗肿瘤化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了两种来源于怒江藤黄的抗肿瘤化合物及其制备方法和用途。所述抗肿瘤化合物是从怒江藤黄中提取获得，具有如下化学结构式：

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法和用途，具体说，是涉及两种来源于怒江藤黄的抗肿瘤化合物及其制备方法和用途，属于天然化合物技术领域。

背景技术

天然产物的结构具有新颖和多样的特点。结构新颖的活性天然产物是先导化合物的重要来源之一，其发现不仅会推动化学与药学研究的进展，还可能导致药物新靶标的发现。当前使用的抗肿瘤药物中，超过60%是直接或间接来自天然产物，如抗肿瘤药物紫杉醇和长春花生物碱等。从传统中药和药用植物中寻找具有抗肿瘤活性的先导化合物，研究其作用机制，从而研制抗肿瘤治疗药物是当前研究的热点。

怒江藤黄（G.nujiangnsis）是我国的特有植物，分布于云南省西北部和西藏等地，生长于海拔800米至1,700米的地区，见于山坡或沟谷的密林中，目前尚未见从怒江藤黄中提取制备抗肿瘤活性物质的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供两种来源于怒江藤黄的抗肿瘤化合物及其制备方法和用途。

本发明所述的抗肿瘤化合物，是从怒江藤黄中提取获得，具有如下化学结构式：

一种所述抗肿瘤化合物的制备方法，包括如下步骤：

a)首先将怒江藤黄用丙酮浸泡提取，然后减压浓缩丙酮提取液至无丙酮味，再用二氯甲烷萃取浓缩液，减压浓缩二氯甲烷萃取液得浸膏；

b)对所得浸膏进行硅胶柱层析分离：以二氯甲烷与甲醇按1:0-0:1的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有所述化合物的流份；再经反相硅胶柱层析分离：以甲醇与水按75:25-95:5的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有所述化合物的流份；然后经ODS柱层析分离：以甲醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱；

c)采用HPLC纯化：洗脱液是以甲醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液，且混合溶液中还含有0.1vol%三氟乙酸（TFA）；流速为2mL/min；收集保留时间为14.1分钟的式A化合物和保留时间为15.6分钟的式B化合物。

一种所述抗肿瘤化合物的用途，是以式A化合物或/和式B化合物作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂。

作为一种优选方案，以式A化合物作为活性成分用于制备治疗脑胶质瘤、胰腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌中的任意一种或二种以上肿瘤的药物制剂。

作为一种优选方案，以式B化合物作为活性成分用于制备治疗脑胶质瘤、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌中的任意一种或二种以上肿瘤的药物制剂。

作为进一步优选方案，所述的药物制剂形式是任何可药用的口服剂型或注射剂，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、注射液、粉针剂等。

药理试验证明，式A化合物对U87人脑胶质瘤细胞株、BXPC-3人胰腺癌细胞株、PANC-1人胰腺癌细胞株、A549人非小细胞肺癌细胞株、AGs人胃癌细胞株、A375人黑色素瘤细胞株、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株、SMMC-7721人肝癌细胞株的生长均具有明显抑制作用，与阳性对照药紫杉醇和姜黄素相当；式B化合物对U87人脑胶质瘤细胞株、BXPC-3人胰腺癌细胞株、PANC-1人胰腺癌细胞株、AGs人胃癌细胞株、A375人黑色素瘤细胞株、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株、SMMC-7721人肝癌细胞株的生长均具有明显抑制作用，与阳性对照药紫杉醇和姜黄素相当；可见：本发明所述的抗肿瘤化合物具有显著的抗肿瘤活性，可望作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂，具有药用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明，但并不因此限制本发明；本领域的技术人员根据下述内容所作的一些非本质的改进或替换均属于本发明的保护范围。

实施例

一、制备抗肿瘤化合物

a)将怒江藤黄（2010年8月采自云南省怒江州，植物样本由云南中医学院周元川教授鉴定，并留样于上海中医药大学中药创新实验室，标号为G.N.0001）用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为怒江藤黄待提取的怒江藤黄药材质量的5倍，每次浸泡一星期，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味；采用二氯甲烷萃取浓缩液4次，减压浓缩二氯甲烷萃取液得浸膏；

b)对所得浸膏采用硅胶柱层析分离：以二氯甲烷与甲醇按1:0-0:1的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有所述化合物的流份；再经反相硅胶柱层析分离：以甲醇与水按75:25-95:5的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有所述化合物的流份；然后经ODS柱层析分离：以甲醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱；

c)采用HPLC纯化：采用Agilent 1200Series，色谱柱Zorbax SB-C18columns(9.4×250mm×5μm)；洗脱液是以甲醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液，且混合溶液中还含有0.1vol%三氟乙酸（TFA）；流速为2mL/min；收集保留时间为14.1分钟的式A化合物和保留时间为15.6分钟的式B化合物。

式A化合物的结构鉴定数据如下：

HRESI-MS:599.3387；

[α]²⁰_D(c=0.10,MeOH):-2；

UV(MeOH):λ_max(logε)330.8(3.64),263.4(3.96),244.5(3.95)nm；

IR(KBr):ν_max 3425,3072,2966,2923,2852,1731,1685,1620,1465,1390,1143,889,798cm^-1；

H¹-NMR(400MHz in CD₃OD)及C¹³-NMR(100MHz in CD₃OD)数据见表1所示。

式B化合物的结构鉴定数据如下：

HRESI-MS:599.3387；

[α]²⁰_D(c=0.10,MeOH):+5；

UV(MeOH):λ_max(logε)340.4(3.47),326.2(3.52),263.7(3.83)nm；

IR(KBr):ν_max 3429,2923,2852,1730,1674,1624,1464,1398,1143,891cm^-1；

H¹-NMR(400MHz in CD₃OD)及C¹³-NMR(100MHz in CD₃OD)数据见表1所示。

表1式A和式B化合物的H¹-NMR、C¹³-NMR数据

二、采用MTT还原法验证抗肿瘤活性

取对数生长期人癌细胞株（U87人脑胶质瘤细胞株，BXPC-3人胰腺癌细胞株，NCI-2126人肺癌细胞株，PANC-1人胰腺癌细胞株，A549人非小细胞肺癌细胞株，AGs人胃癌细胞株，A375人黑色素瘤细胞株，MCF-7人乳腺癌细胞株，MDA-MB-231人乳腺癌细胞株，SMMC-7721人肝癌细胞株），采用含10%小牛血清的DMEM培养液培养，以1×10⁶/mL接种于96孔板中，接种体积为100μL，置37℃、5%CO₂孵箱中培养24h；分别设细胞对照组和8个浓度的实验组（100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.6和0.8μg/mL），每组3个复孔；培养24h后吸取培养液，实验组加入含不同浓度的式A化合物或式B化合物的培养液100μL，细胞对照组加等体积培养液；置37℃、5% CO₂孵箱中培养72h，加入MTT的磷酸缓冲液（5mg/mL）10μL/孔，继续培养4h，吸弃上清液，加DMSO 100μL/孔，轻微震荡10min，用酶标仪于检测波长540nm测定吸光度（OD）值，计算细胞IC₅₀。检测结果见表2所示。

表2IC₅₀(μM)

  人癌细胞株  式A化合物  式B化合物  姜黄素  紫杉醇  U87  20.34  23.84  20.81  285.4  BXPC-3  28.87  32.64     -  217.3  NCI-2126      -     -  56.88  80.56  PANC-1  43.48  59.67     -  139.26  A549  35.31     -  42.79  1.33  AGs  19.94  17.42  4.38  23.11  A375  29.92  32.03  47.24  61.4  MCF-7     -     -  43.79  155.31  MDA-MB-231  31.71  45.85  3.76    -  SMMC-7721  29.27  40.02  15.44  44.92

由表2可见：式A化合物对U87人脑胶质瘤细胞株、BXPC-3人胰腺癌细胞株、PANC-1人胰腺癌细胞株、A549人非小细胞肺癌细胞株、AGs人胃癌细胞株、A375人黑色素瘤细胞株、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株、SMMC-7721人肝癌细胞株的生长均具有明显抑制作用，与阳性对照药紫杉醇和姜黄素相当；式B化合物对U87人脑胶质瘤细胞株、BXPC-3人胰腺癌细胞株、PANC-1人胰腺癌细胞株、AGs人胃癌细胞株、A375人黑色素瘤细胞株、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株、SMMC-7721人肝癌细胞株的生长均具有明显抑制作用，与阳性对照药紫杉醇和姜黄素相当；可见：本发明所述的抗肿瘤化合物具有显著的抗肿瘤活性，可望作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂，具有药用前景。

最后有必要在此说明的是：上述内容只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。