在高速细胞分选装置上测量窄和宽角光散射的系统和方法

摘要

在此公开的各种实施例利用了具有不同波长的多个激光器和单个检测路径。激光器被安装成相互垂直，从而一个激光器将提供检测路径上的前向角光散射（FALS）信号，一个激光器将提供检测路径上的侧向散射信号（即，单个检测光学器件与FALS激光器大致在一条直线上并与侧向散射激光器大致垂直）。单个检测器路径在将前向和侧向散射信号应用于它们各自的用于测量的检测器之前在谱带上将它们分离。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年1月4日提交的第61/583,074号美国临时专 利申请以及2012年9月20日提交的第13/623,305号美国专利申请的 权益，上述申请的文本和附图通过引用全部包含在本申请中。

背景技术

在各个学科中使用流式细胞仪和基于液滴的细胞分选仪，从而当 个体粒子流经单个或多个询问点时执行个体粒子的光学测量。这些光 学测量通常分为两类，即，散射和荧光。光散射是当粒子与光束相互 作用且光子离开入射光束时发生的复杂现象。单个粒子将以宽角度范 围散射来自入射光束的光。与测量的光的波长长于入射光的波长的荧 光不同，以与入射光的波长相同的波长测量散射的光。流式细胞仪或 细胞分选仪通常测量前向角光散射和宽角光散射。

与入射光束的传播轴成小角度地（通常小于大约15度）测量前 向角光散射（FALS）。主要使用米氏散射理论描述FALS，并且FALS 是被相对大的粒子进行散射的结果。尽管由于粒子的折射率也影响 FALS信号强度，所以FALS测量信号并不是粒子尺寸的真实测量， 但是FALS测量信号仍与粒子的尺寸成比例；然而，在流式细胞仪中， FALS通常用作粒子尺寸的粗略估计。

与入射光束的传播轴成相对大的角度地测量宽角光散射。通常， 流式细胞仪将测量侧向散射或后向散射，其中，在侧向散射的情况下， 检测器定位成收集垂直于入射光束散射的光；在后向散射的情况下， 几乎与入射光束的传播轴反向平行地测量散射的光。主要通过瑞利 （Rayleigh）散射理论描述宽角光散射，并且宽角光散射是被相对小 的粒子进行散射的结果。在流式细胞仪中，宽角光散射被用作测量的 粒子的粒度的度量。

FALS和宽角光散射测量提供了关于粒子的形态学以及物理性质 的不同信息，并经常用于区分不同类型的粒子。它们的常用示例为分 析血细胞时它们的使用，其中，可基于FALS和宽角光散射信号区分 淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

在基于液滴的细胞分选仪中，常见的是对已经从喷嘴出射的流体 的射流中的粒子进行全部光学测量。当射流从喷嘴出射时，液滴将开 始形成，这导致将入射光折射和反射并且使从喷嘴的出射口的散射测 量失真超过几百个微米的流中波动。高级流式细胞仪和细胞分选仪通 常使用多个空间上分离的激光询问点以执行荧光测量。传统上，流式 细胞仪使用单个激光器（也是用于荧光测量的激光器之一）和两个分 离的光学检测路径以测量FALS和宽角光散射。当粒子下落通过单个 激光束时，该粒子以窄角和宽角散射光。系统将分离的收集光学器件 放置在不同的位置处，从而收集并分析以不同角度散射的光。

将理解的是，对分离的光学检测路径的需求使得整个光学测量系 统更复杂。因此，需要对高速分选装置中的窄角和宽角光散射的测量 进行改进。当前公开的实施例旨在满足这一需求。

发明内容

在此公开的各种实施例利用了具有不同波长的多个激光器和单 个检测路径。激光器被安装成相互垂直，从而一个激光器将提供检测 路径上的FALS信号，一个激光器将提供检测路径上的侧向散射信号 （即，单个检测光学器件与FALS激光器大致在一条线上并与侧向散 射激光器大致垂直）。单个检测器路径在将前向和侧向散射信号应用 于它们各自的用于测量的检测器之前在谱带上将它们分离。散射激光 在足够靠近喷嘴的样本射流上交叉，从而尚未形成波动，因此减少失 真。在一些实施例中，在具有多个激光询问点的流式细胞仪的荧光收 集光学器件的聚焦平面中出现两个激光的交叉。因此，不需要用于散 射测量的另外的收集光学器件。

在一个实施例中，公开了一种用于测量在喷射轴上移动的粒子的 光散射的系统，所述系统包括：前向角光散射光源，用于发射在前向 源轴上定向的第一波长的电磁辐射；侧向散射光源，用于发射在侧向 源轴上定向的第二波长的电磁辐射；其中，第一波长与第二波长不同； 其中，前向源轴基本垂直于侧向源轴；其中，喷射轴、前向源轴和侧 向源轴在聚焦斑点处相交；其中，当粒子位于聚焦斑点处时将产生具 有第一波长的前向角光散射和具有第二波长的侧向散射光；收集光学 器件，具有光轴；其中，该光轴和前向源轴是从由平行和共线构成的 组中选择的；从而收集光学器件接收前向角光散射和侧向散射光两 者；以及检测器，适于接收由收集光学器件接收的组合的前向角光散 射和侧向散射光，检测器可操作用来确定组合的前向角光散射和侧向 散射光中的前向角光散射分量和侧向散射光分量。

在另一实施例中，公开了一种用于测量在喷射轴上移动的粒子的 光散射的系统，所述系统包括：前向角光散射光源，用于发射第一波 长的电磁辐射；侧向散射光源，用于发射第二波长的电磁辐射；其中， 第一波长与第二波长不同；其中，第一波长的电磁辐射和第二波长的 电磁辐射在聚焦斑点处相会；其中，当粒子位于焦点处时将产生具有 第一波长的前向角光散射和具有第二波长的侧向散射光；收集光学器 件，可操作用来接收前向角光散射和侧向散射光两者；以及检测器， 适于接收由收集光学器件接收的组合的前向角光散射和侧向散射光， 检测器可操作用来确定组合的前向角光散射和侧向散射光中的前向 角光散射分量和侧向散射光分量。

在另一实施例中，公开了一种用于来自在喷射轴上移动的粒子的 光散射的角度选择的散射角选择滤光器，包括：第一滤光器，可操作 用来基本透射第一波长并基本阻挡第二波长，第一滤光器具有第一侧 和第二侧；其中，第一波长与第二波长不同；第二滤光器，可操作用 来基本透射第二波长并基本阻挡第一波长，第二滤光器具有第三侧和 第四侧；其中，第二滤光器的第三侧与第一滤光器的第一侧邻接；以 及第三滤光器，可操作用来基本透射第二波长并基本阻挡第一波长， 第三滤光器具有第五侧和第六侧；其中，第二滤光器的第五侧与第一 滤光器的第二侧邻接。

在另一实施例中，公开了一种用于测量在喷射轴上移动的粒子的 光散射的系统，所述系统包括：散射光源，用于发射聚焦在第一斑点 处的第一波长的电磁辐射；荧光光源，用于发射聚焦在第二斑点处的 第二波长的电磁辐射；其中，第一斑点和第二斑点在喷射轴上相交； 散射检测器，可操作用来检测来自散射光源的被粒子散射的光；以及 荧光检测器，可操作用来检测由来自荧光光源的光导致的来自粒子的 荧光。

还公开了其它实施例。

附图说明

图1是根据一个实施例的用于测量窄角和宽角光散射的系统的示 意性框图。

图2是根据一个实施例的侧向散射激光器组件的立体示意图。

图3是根据一个实施例的散射角选择滤光器组件的示意性剖视 图。

图4是根据一个实施例的检测光学器件和光电倍增管组件的示意 图。

图5是使用一个实施例系统进行的血液样本的侧向散射区域测量 对比前向散射区域测量的绘制图，显示出可清晰地区分淋巴细胞、单 核细胞和粒细胞数量。

图6是使用一个实施例系统进行的聚苯乙烯微粒的前向散射区域 测量的绘制图，显示出可使用FALS测量以基于微粒的尺寸识别混合 物中的聚苯乙烯微粒的各群体数量。

图7是当使用一个实施例系统测量两个不同尺寸的聚苯乙烯微粒 时的侧向散射区域对比前向散射区域的绘制图，显示出可清晰地区分 0.49微米聚苯乙烯珠（bead）和1微米聚苯乙烯珠。

图8是当使用一个实施例系统测量的大肠杆菌的样本时的侧向散 射区域对比前向散射区域的绘制图。

具体实施方式

出于促进理解本发明的原理的目的，现在将对附图中示出的实施 例进行说明，并且将使用专用语言来描述实施例。然而，将理解的是， 并不因此意图限制本发明的范围。在描述的实施例中的任何替换和进 一步的变型以及对在此描述的本发明的原理的任何进一步的应用通 常对本发明所涉及领域的技术人员来说是能想到的。特别详细地示出 了本发明的一个实施例，但是相关领域技术人员将清楚的是，为了清 晰的缘故，可不示出与本发明不相关的一些特征。

在此公开的新颖的多激光器散射检测系统使用了两个不同的激 光器，所述两个不同的激光器具有不同的发射波长和用于FALS测量 和宽角光散射测量两者的单个散射收集路径。激光器被安装成使光束 基本相互垂直。然后，单个收集光学器件能够从两个激光器收集散射 的光。FALS检测系统测量的具体角度通常是重要的，因此在一些实 施例中，角度选择滤光器组件控制FALS的检测角和侧向散射收集。 收集光学器件使散射的光聚焦在光纤上，该光纤将散射的光传递到检 测光学器件。FALS和侧向散射信号具有不同的波长，因此滤光器和 二向色滤光器被用于把这两个信号分离至两个不同的检测器中，一个 检测器用于FALS，一个检测器用于侧向散射。在其它实施例中，由 收集光学器件收集的光通过模拟至数字转换器和数据处理器（诸如运 行软件以计算用于在两个信号之间进行区分的傅里叶变换的微处理 器）被数字化。

如图1所示，总体地以10示出和表示多激光器散射检测系统的 一个实施例的示意图。粒子的喷射流12在垂直于页面的平面的喷射 轴上流动。FALS激光二极管14和侧向散射激光二极管16被定位成 相互垂直，从而它们在流12上交叉。源14、16可为电磁辐射的任何 源，所述电磁辐射包括但不限于红外光、可见光、紫外光、X射线和 其它频率的电磁辐射。这里公开的实施例提到激光二极管，因为激光 二极管在这种类型的系统中是常用的，但不应由此推断出对本发明所 要求的范围的限制。FALS激光二极管14在前向源轴15上发射光， 而侧向散射激光二极管16在侧向源轴17上发射光，其中，侧向源轴 17基本垂直于前向源轴15。FALS激光二极管14的发射波长被选择 成与侧向散射激光二极管16的发射波长不同。激光器14、16均被聚 焦到相互交叉并与喷射轴交叉的聚焦斑点（focus spot），从而喷射轴 上的粒子将移动穿过组合的聚焦斑点。

来自激光器14、16的被喷射流12中的粒子散射的光在传递到散 射收集组件22之前，会经过收集透镜18和散射角选择滤光器组件20。 这个检测光学路径被定位成使得单个检测光学器件可收集来自激光 器14的FALS（由于激光器14和检测光学器件二者的光轴基本共线 或平行），并且还可以收集来自另一激光器16的侧向散射（由于激 光器16和检测光学器件的光轴基本垂直）。光纤缆24将散射的光送 至长通二色性滤光器26，其中这两个波长被分离以供FALS检测器 28和侧向散射检测器30检测。将理解的是，图1中示出的系统只是 一个实施例，本领域的技术人员将从本公开中认识到，可以以各种构 造布置各种光学和检测组件，从而实现这里公开的构思。

从上面将理解的是，当前公开的实施例的一个益处在于对散射测 量和荧光测量使用了分离的照射源。流式细胞仪中的激光斑点尺寸和 形状的选择是在该斑点处的光强度（偏好于更小的斑点，以得到更高 的强度）与样本核上的照明的均匀性（偏好于更宽的斑点，以得到更 大的照明面积）之间进行的权衡。光散射是比荧光强度大很多的信号 （>2或3个数量级）。使用散射和荧光专用的激光器允许利用优化的 光束斑点形状，使得对于散射激光器斑点具有较大的宽高比以改善稳 定性，对于荧光激光器斑点具有较小的宽高比以允许更强的照射，这 将导致更大的灵敏度。另外，由于在大多数应用中使用散射作为触发 信号，所以更宽的照射斑点尺寸将导致更少的遗漏事件（细胞、珠等）， 如果遗漏事件以与期望的分选事件相同的液滴间隔到达，则遗漏事件 会影响分选的性能（纯度）。

在以下描述的一个实施例中，FALS和宽角散射检测设备可集成 到可从iCyt Mission Technology,Inc.(2100South Oak Street, Champaign,IL61820,USA)得到的Synergy^TM流式细胞仪中。在这个 实施例中，散射检测设备由四个具体的子组件构成：1）前向散射激 光器组件，包括安装在整个仪器激光传递组件上的光纤耦合激光器和 相关的光束整形光学器件，以在与其它荧光激发激光器的流照射方向 平行的方向上照射样本流；2）侧向散射激光器组件，包括带有相关 的光束整形光学器件的光纤耦合激光器，其被安装成在基本垂直于前 向散射激光器的方向上照射样本流；3）光收集光学器件组件，收集 并修整（condition）来自前向散射激光器和侧向散射激光器的从样本 散射的光，并将所述光传送到检测器；4）检测光学器件和光电倍增 管(PMT)，将信号分离并将每个散射方向上的光级（light level）报告 给处理系统。

前向散射激光器组件

808nm激光器被耦合到单模偏振保持光纤中。激光器附接于 Synergy^TM流式细胞仪的激光器传递组件（LDA）。光束整形光学器 件对来自光纤的输出进行校准并产生大约20微米高、200微米宽的光 束斑点，该光束斑点被针对前向散射测量进行了优化并在样本流处聚 焦。该斑点被聚焦在由在Synergy^TM细胞仪中使用的5-spot 收集光学器件（RCO5）限定的最高点处。将光的偏振设 置为在样本流处垂直以优化散射的光信号。

侧向散射激光器组件

如图2所示，耦合到单模偏振保持光纤101中的830nm激光器安 装在Synergy^TM流式细胞仪的LDA上。光纤101将激光从激光器传 送到图2中的侧向散射（SSC）激光器组件，所述侧向散射（SSC） 激光器组件安装在Synergy^TM仪器中的分选模块中。该组件中的光束 整形光学器件包括光纤准直器102、凹柱面透镜103、光束折叠棱镜 104-106、凸柱面透镜107和凸球面透镜108，用以在样本流处产生与 前向散射激光器聚焦斑点重合的大约20微米高、200微米宽的斑点 110，并在与前向散射照射方向正交的方向上入射到流上。光的偏振 被设置成在样本流处垂直以优化散射的光信号。折叠光束路径允许小 型化的组件。

光收集光学器件组件

再次参照图1，单个光收集光学器件组件被定位成在与前向散射 入射光（来自激光器14）共线或平行且垂直于侧向散射入射光（来自 激光器16）的方向上收集从样本流散射的光。0.5NA收集透镜18以 至多±30度的角度收集从样本散射的光。在±4度之间入射的光被透镜 18前面的光束阻挡件（未示出）阻挡，从而防止未散射的光进入检测 系统。波长选择滤光器进一步修整散射信号。第一滤光器阻挡小于2 个散射激光波长的全部波长。如图3所示，新颖的散射角选择滤光器 组件20阻挡以小于|±7|度的角度入射的全部侧向散射光，同时还阻 挡以大于|±7|且小于|±4|度的角度入射的全部前向散射光。散射角选 择滤光器组件20包括：滤光器201，透射前向散射（FSC）激光器14 波长并阻挡侧向散射（SSC）激光器16波长；和滤光器202，透射SSC 激光器16波长并阻挡FSC激光器14波长，从而滤光器201的边缘 203限定系统收集的FSC的高半角。以204表示检测器系统的光轴（0 度）。一单独的透镜系统（未示出）随后将全部光聚焦到光纤24中， 用于检测器模块中的检测。

检测光学器件和光电倍增管（PMT）组件

参照图1和图4，通过用滤光器将波长分离，前向散射信号和侧 向散射信号通过检测光学器件和光电倍增管（PMT）组件被分离和检 测。来自光收集和修整组件的组合的散射光从光纤24在301处输入。 长通二色性滤光器302（诸如从Chroma Technology Corporation，10 Imtec Lane,Bellows Falls,VT05101可得到的型号t808rb）将SSC激 光器16波长光传输到SSC检测器30，同时阻挡FSC激光器14波长 光到达SSC检测器30，还将FSC激光器14波长光反射到FSC检测 器28，并阻挡SSC激光器16波长光到达FSC检测器28。光通过长 通边缘滤光器303（诸如Chroma E825LP或从Semrock,Inc.,3625 Buffalo Road,Suite6,Rochester,New York14624可得到的型号 LP02-808RS）进入SSC检测器30。光通过单带带通滤光器304（诸 如Chroma ET792/50或Semrock FF01-785/62）进入FSC检测器28。 滤光器的这种组合允许每个检测器28、30仅接收该检测器本应该测 量的（前向或侧向）散射光。由于FSC激光器14和SSC激光器16 被选择为具有不同的发射波长，所以前向散射光和侧向散射光可用单 个收集光学器件收集，然后来自每个激光器的贡献可随后被分离以用 于各个测量。如上所述，这种分离可在使用允许各个频率分量被从组 合信号中分离并进行测量的数字技术（诸如傅里叶变换）的其它实施 例中实现。

示例

上述的多激光器/单收集光学器件散射检测系统被安装到Synergy^TM细胞分选仪上并被充分调准。然后使用该系统测量大量样 本的FALS和侧向散射。图5至图8显示了下面总结的这些实验的结 果。

血液散射测量

使用以上公开的多激光器散射检测系统进行血液样本的分析。样 本是收集在EDTA真空采血管（从Becton,Dickinson and Company,1 Becton Drive,Franklin Lakes,NJ07417-1880,USA可得到）中的捐献 的人血液，并使用RBC Lysis Buffer（从iCyt Mission  Technology,Inc.,2100South Oak Street,Champaign,IL61820,USA 可得到）进行准备以去除红细胞。图5示出了使用以上公开的多激光 器散射检测系统的侧向散射区域测量对比前向散射区域测量的绘制 图。该数据表明通过淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的不同的前向和侧 向散射性质可清楚地区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数量。

聚苯乙烯微粒测量

使用以上公开的多激光器散射检测系统测量聚苯乙烯微粒或珠 的混合物。图6仅绘制了前向散射区域数据。该数据表明了可使用 FALS测量以基于微粒的尺寸来识别混合物中的聚苯乙烯微粒的单独 数量。

图7绘制了在细胞分选仪中测量两种不同尺寸的珠时侧向散射区 域与前向散射区域的对比。该图示出了0.49微米聚苯乙烯珠和1微米 聚苯乙烯珠的混合物的散射测量。该数据表明以上公开的多激光器散 射检测系统具有分辨小粒子的能力。

菌测量

图8绘制了当在细胞分选仪中测量大肠杆菌的样本时侧向散射区 域与前向散射区域的对比。该图表明了可基于以上公开的多激光器散 射系统的散射测量从背景噪声中分辨出大肠杆菌。

结论

从以上描述将理解的是，在此已经描述了新颖的多激光/单收集光 学器件散射测量系统。该系统使用分离的激光器来激发前向角光散射 和侧向散射，并包括用于这两种形式的散射光的单个检测光学路径。 专用的散射激光器具有彼此不同的发射波长，从而它们各自的贡献可 从自单个收集光学器件收集的组合的散射光中分离。专用的散射激光 器具有针对稳定性和散射检测而优化的斑点形状，而传统的流式细胞 仪对散射测量和荧光测量使用同一激光器，从而必须在散射性能和荧 光灵敏度之间做出权衡。另外，在这里公开的实施例中，散射激光的 交叉在三维上提供了物理界标，以准确地调准喷嘴位置，并且这个界 标有助于多激光器细胞分选仪的光学系统的调准。已经使用了多激光 器散射系统成功对若干样本执行了散射测量。

尽管在附图和前面的描述中已经详细示出和描述了本发明，但是 其应被认为是示例性的而不是限制性的，将理解的是，仅示出和描述 了优选的实施例，并且在本发明的范围内的全部改变和变型被期望受 到保护。还可以想到，在本示例中实施的结构和特征可被更改、重新 布置、替换、删除、复制或添加到彼此。冠词不一定限制为意味着仅 一个，而是包含性的和开放性的，从而可选地包括多个这种元件。