一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法

摘要

本发明公开了一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法，筛选出建立喜树无性系的最优培养基配方。结果表明：茎段的诱导培养基以MS+0.1mg／L KT+4mg/L2，4-D为佳；增殖培养以B5+0.5mg／L KT+1.0mg／LNAA+0.5mg／L2，4-D最优；叶片表现出较差的诱导率。将愈伤在红光、绿光、蓝光、红蓝光、白光条件下增殖，通过分析单位愈伤的增长量，得到红光、绿光对喜树愈伤的生长有促进作用，蓝光对愈伤的生长有抑制作用，白光、红蓝光的作用不明显，其中以绿光的促进作用最显著。

说明书

技术领域

本发明属于植物培育技术领域，涉及一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法。

背景技术

喜树(Campototheca acuminate Decaisne)为珙桐科落叶乔木，我国特有树种。1966年，美 国的Monroe E.WALL博士从喜树的次生代谢产物中分离得到喜树碱(Compothecine，简称 CPT)。1985年，Hisang等发现CPT能阻断拓扑异构酶I的合成而具有抗癌效应。目前，已 有多种以CPT为前体合成的喜树碱衍生物用于临床治疗卵巢癌、结肠癌等，另外，CPT对 HIV病毒也具有较强的抑制作用。随着CPT抗肿瘤、抗病毒等功能的不断挖掘、验证，全 球对CPT的需求量迅猛增加。自20世纪90年代来，美国、日本、加拿大和英国等国家积 极投入大量人力物力进行喜树引种栽培和CPT研发，喜树成为红豆杉之后第2个重要的木 本抗癌药用植物。但喜树中CPT含量低，单纯依靠从植株中提取CPT已不能满足市场的需 求，利用植物细胞大规模培养技术生产高价值次生代谢产物在多种药用植物中取得了成功， 同样，已有相关研究证实，通过喜树愈伤组织培养生产CPT是一种行之有效的途径。

光作为一个重要的环境因子，对植物的生长发育有重要的调节作用。顾青等研究了光照 对喜树愈伤组织生理生化特性及喜树碱合成的影响，结果显示，与暗培养相比，光下培养可 以促进喜树愈伤组织的生理代谢，且对喜树碱的合成和积累有一定的促进作用。目前，日光 灯是组织培养的主要光源，但其能耗高，寿命短，含汞，易造成环境污染，且光质单一，不 能满足植物在组织培养不同生长阶段对光质的需求差异。发光二级管(LED)是一种能发光 的半导体电子原件，通过化学修饰方法，调整材料的能带结构和禁带宽度，可实现红黄绿蓝 橙多色发光，满足植物在组织培养不同阶段对光质的需求差异，同时，LED能耗较同效的白 炽灯减少80％，无有害金属汞，使用寿命可达10万小时，《国家基本公共服务体系“十二五” 规划》指出要大力支持发展LED产业，在规划期间LED灯将大量替代传统日光灯在各行各业 广泛推广应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种能有效提高喜树茎段愈伤组织诱导率和增殖 率的优化培养基及LED组培光源调控方法。

一种喜树愈伤组织培养和增殖的光调控方法，包括以下步骤：

1)将选取的喜树春发新梢剪切成小段，用自来水冲洗干净，用洗衣液溶液浸泡15min， 流水下反复冲洗；

2)用流水冲洗干净后，在75％乙醇溶液中浸1min，立即放人0.1％升汞溶液中消毒5min， 无菌水冲洗5次后放在无菌滤纸上晾干备接种用；

3)将叶片剪成5mm×5mm，带腋芽茎段切成2mm的小段，在无菌的条件下分别接入配制 好的诱导培养基MS+0.1mg／L KT+4mg／L2，4-D上，每配制1L培养基加入5.5g琼脂和30 g蔗糖，调pH至5.9，将诱导培养基分装到培养瓶中，每瓶40mL，在121℃下灭菌15min，培 养温度25±2℃，光照强度1000～1500lx，暗培养一周，再转入光照培养，每天光照时间12 h；

4)诱导出的愈伤组织转移至新的继代培养基上继代培养，30d继代1次，继代培养基为 B5+0.5mg／L KT+1.0mg／L NAA+0.5mg／L2，4-D，5.5g／L琼脂和30g／L蔗糖，pH为5.9；

5)30d继代1次，连续继代5次后，挑选疏松易碎的愈伤组织进行LED光下培养。

进一步优选，步骤5)中采用绿光微继代的光质。

本发明提供的提高喜树茎段愈伤组织增殖率的LED光源调控方法，其为在愈伤组 织增殖阶段，将愈伤组织转移至光谱波长为500～580nm、光量在105μmol·m^-2·s^-1左右的 LED绿光下培养。

本发明的优化培养基和LED组培光调控方法能有效地提高喜树愈伤组织诱导率和增殖 率，为获得大量的CPT提取原料喜树愈伤提供了技术保证，此外，本发明还能降低能耗， 降低生产成本，减少环境污染。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以喜树当年生无病虫害的幼嫩茎段为外植体。茎段采摘清洗后，在75％乙醇溶液 中消毒1min，立即放人0.1％升汞溶液中继续消毒5min，无菌水冲洗3～4次，无菌 滤纸吸干水分，备用。

将茎段剪成2～3mm的小段，分别接人以下4种愈伤组织诱导培养基中，每种培 养基接种15瓶，每瓶接入5个外植体，接种暗培养一周后转入光下培养，培养温度(25±2) ℃，光照强度1000～1500lx，光照时间12h／天，光源为日光灯。实验3次重复。

①MS+0.1mg／L KT+4mg/L2，4-D

②MS+0.5mg／L KT+4mg／L2，4-D

③MS+2mg／L6-BA+2mg/L NAA+2mg／L2，4-D

④MS+0.5mg／L6-BA+2mg／L NAA

以上4种培养基琼脂均为5.5g/L，蔗糖30g/L，pH为5.9。

接种后每日观察喜树茎段外植体在上述4种培养基上的生长情况。第5天，③号培 养基上的外植体开始出现褐化，第8天，④号培养基上的外植体也开始出现褐化，20天 后③号和④号培养基上的外植体褐化率超过90％。①号和②号培养基对喜树茎段有较高 的愈伤诱导率，第10天，①号培养基上的外植体首先出现愈伤，而②号培养基上的外 植体在第12天开始出现愈伤，第35天，对①号和②号培养基上的愈伤组织诱导率进行 统计，结果①号培养基的愈伤组织诱导率平均值为92.3％，②号的为85.4％。可见，① 号和②号培养基均为喜树茎段愈伤组织的合适诱导培养基。

实施例2

将①号和②号培养基上诱导的愈伤组织分别进行继代培养，所用继代培养基为：

④MS+2.0mg／L6-BA+0.5mg/LNAA

⑤MS+0.5mg／L KT+4.0mg/LNAA

(⑥B5+0.5mg／L KT+1.0mg／LNAA+0.5mg／L2，4-D

继代培养条件为培养温度(25±2)℃，光照强度1000～15001x，光照时间12h／天， 光源为日光灯。

继代培养30天后观察统计①号和②号培养基上诱导愈伤组织的继代培养情况，发 现：①号培养基上诱导的愈伤组织继代在B5(⑥号)培养基上长势良好，有85％以上的 愈伤组织结构疏松，容易散碎，颜色浅而透明，为优良愈伤组织，而继代在MS(④和⑤号) 培养基上的愈伤组织有些表面呈水渍状，有些太过致密且生长缓慢，不利于愈伤组织的继续 生长；②号培养基上诱导的愈伤组织继代情况不佳，发现其在任何一种继代培养基中 均出现愈伤严重致密、硬化，呈圆珠状，不适宜进行继代培养。

综合考虑初代和继代培养结果，喜树茎段最佳愈伤组织诱导培养基为①号培养基： MS+0.1mg/L KT+4mg／L2，4-D，最佳继代培养基为⑥号培养基：B5+0.5mg／L KT+1.0 mg/LNAA+0.5mg／L2，4-D。

实施例3

将继代在⑥号培养基上的优良愈伤组织进行转接增殖培养，转接培养基仍采用⑥号， 转接容器为规格90*15mm的培养皿，转接后将培养皿放置日光灯及5个不同光质LED光源下 培养，每个光下放9个培养皿，3次重复。调节LED灯控软件以及光源和培养皿的距离，使 光量均在105μmol·m^-2·s^-1左右，光周期为16h·d^-1，培养30天。培养室相对湿度70％±5％， 温度(24±1)℃。

其中，光源为购自杭州汉徽光电科技有限公司的LED灯。具体技术参数见表1。

表1不同光质LED光源的主要技术参数

培养30天后，观察不同光质下愈伤组织的形态特征，发现蓝光和红蓝光下培养的愈伤 组织呈紫红色或黄色，且严重致密，硬化；红光下的愈伤组织呈淡黄色，但是不够松散；白 光和日光灯下的愈伤组织致密度近似，但日光灯下以紫红色居多，白光下以淡黄色为主；绿 光下的愈伤组织结构疏松，呈淡黄色或白色，长势优良。

统计不同光质下愈伤组织的增殖倍数和褐化率，见表2。从表2中看出，LED绿光下培 养的愈伤组织增殖倍数最高，为3.502，LED红光次之，为2.951，其余光质处理均低于CK， 进行方差分析(表3)，发现各个光质下愈伤组织增殖倍数差异极显著(0.001≤P≤0.01，则差 异极显著)，因此，采用Tukey法进行多重比较(表4)，发现处理4(LED绿光)和处理3(LED 红光)差异不显著，却和CK(日光灯)等其他处理差异显著，同时，处理3除了和处理5 差异显著外，和其余处理均无显著差异，此外，其余处理之间的愈伤组织增殖倍数均无显著 差异，可见，与传统光源日光灯相比，LED绿光对愈伤组织生长具有显著的促进作用，而 其他光质作用不明显。

从表2中看出，除LED蓝光下的愈伤组织褐化率高于CK外，其余处理均低于CK，最 低的是LED绿光，为12.7％，对褐化率进行方差分析(表5)，发现各处理间的褐化率差异 不显著。

因此，从愈伤组织的形态特征、增殖倍数及褐化率考虑，喜树愈伤组织增殖培养最佳光 源为LED绿光。

表2不同光质下愈伤的增殖倍数和褐化率

表3不同光质下愈伤的增殖倍数方差分析表

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 处理间 5.8857 5 1.1771 7.315 0.0023 处理内 1.931 12 0.1609     总变异 7.8167 17      

表4不同光质下愈伤的增殖倍数显著性检验

处理 均值 4 3 1 6 2 5 4 3.635   0.5668 0.0385 0.0207 0.0118 0.002 3 2.951 0.5507   0.8504 0.3051 0.1883 0.0326 1 2.5737 0.928 0.3773   0.8927 0.736 0.2101 6 2.2307 1.271 0.7203 0.343   0.9993 0.7187 2 2.1207 1.381 0.8303 0.453 0.1 1   0.8807 5 1.7673 1.7343 1.1837 0.8063 0.4633 0.3533  

Tukey法多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)

表5不同光质下愈伤的褐化率方差分析表

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 处理间 69.2771 5 13.8554 0.714 0.6247 处理内 232.8092 12 19.4008     总变异 302.0863 17      

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。