金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因及其编码产物和应用

摘要

本发明公开了一种金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因及其编码的蛋白酶与用途。本发明所提供的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用全长cDNA文库克隆4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的机酸类、黄酮类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。 

背景技术

药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。 

药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分。金银花Lonicera japonica Thunb为一味常用中药，主要用于身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症状的治疗，且具有较强的抗菌作用。金银花的主要活性成分包括绿原酸和木樨草苷等，其中绿原酸属于有机酸类，木犀草苷属于黄酮类化合物。 

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)是植物天然苯丙基衍生物产物合成分歧途径中关键酶。4CL的主要功能是以肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物如4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸等为底物，生成相应的辅酶A酯。这些中间产物随后进人苯丙烷类衍生物支路合成途径，其中生成的香豆酞CoA、阿魏酞CoA及芥子酞CoA转化为肉桂醇衍生物，可以进一步转化为香豆素、绿原酸等，也可形成CoA酯，再进一步转化为木樨草苷、绿原酸等化合物。因此，4CL也是绿原酸和木樨草苷生物合成的关键酶。金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因的克隆，将为利用基因工程提高金银花活性成分含量提供重要基础。 

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的金银花中苯丙氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因。 

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。 

本发明所提供的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因，为以下核苷酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。 

该基因所编码的蛋白质为金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因，是以下氨基酸序列之一： 

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列； 

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。 

本发明所提供的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因是首次从金银花中克隆制备的，体外实验表明，LJ4CL具有催化肉桂酸生成肉桂酸CoA的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高金银花等植物中有机酸类物质绿原酸、黄酮类物质木犀草苷的含量。 

附图说明：

图1：LJ4CL功能域预测分析(来源于NCBI数据库)； 

图2：LJ4CL系统进化树(邻接法)； 

图3：植物表达载体pQE31-LJ4CL构建。 

具体实施方式

实施例1、金银花全长cDNA文库的构建 

1、金银花总RNA的分离和检测 

取金银花(Lonicera japonica Thunb)花蕾2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25m mol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP40 2％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟， 沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。 

2、cDNA文库的构建 

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，采用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit(Cat.No.634903)进行建库，原理为SMART(switch mechanism at 5′end of mRNA template)。 

实施例2：金银花相关基因的克隆 

随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入：Taq buffer 2.5μL，MgCl₂(25mM)1.8μL，dNTP(2.5mM)1μL，M13+引物(10pmol)1μL，M13-引物(10pmol)1μL，Taq酶0.4μL。PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，94℃40秒，54℃ 40秒，72℃ 4分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得金银花相关基因序列。 

实施例3、LJ4CL基因的生物信息学分析 

本发明涉及的金银花4-香豆酸辅酶A连接酶(LJ4CL)基因全长cDNA的长度为1623bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于1-1623bp。将金银花全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的4CL有较高的同源性，同时具有典型的AMP-binding superfamily结构域。如图2。 

实施例4、LJ4CL基因功能的研究 

1、表达载体的构建 

以LJ4CL cDNA为模板，利用引物P1：5′-GGATCCATGGAGAAATTCGACCCAAATAGT-3′，P2：5′-GGATCCTCACAATTTAGAAGAAAAGCCTTGA-3′进行PCR反应，取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰跑电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1600bp。用BamH I在37℃ 下酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamHI在37℃下酶切pQE31载体2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收空载体片段。 

将回收的两个片段混合，在T4 DNALigase的作用下于4℃反应12小时，连接产物利用CaCl2法转入大肠杆菌M15中，挑取单克隆并在含有50mg/L的LB培养基中培养，利用SDS法提取基因组DNA。利用BamH I在37℃下酶切DNA 2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，结果表明完全酶切后存在符合条件的两个片段，该表达载体命名为pQE31-LJ4CL(图3)。 

2、工程菌诱导表达 

利用Gibco BRL电穿孔法将表达载体pQE31-LJ4CL导入大肠杆菌M15中。过夜培养后接种于含100ug/mL Amp、25ug/mL Kan的LB培养基，37℃培养至OD600达到0.6，培养3-4h。以含有pQE31空载体的E.coli BL21(DE3)培养物为阴性对照。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为58.7kD处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致。 

3、LJ4CL活性测定 

利用分光光度法测4CL活性，酶反应体系200ul，分别含有0.5mmol/L反式肉桂酸、5mmol/L Mg3+、5mmol/L ATP、0.3mmol/L CoA、0.2mmol/L Tris-HCL、PH＝7.8，加入适量的菌体裂解上清液，空白对照为.5mmol/L反式肉桂酸、5mmol/L Mg3+、0.2mmol/L Tris-HCL、PH＝7.8，反应温度20℃，反应时间5min。测得4CL酶活为84.9pkat/mg。 

4、突变LJ4CL活性测定 

以LJ4CL cDNA为模板，利用引物P3：5′-GGATCCATGGAGAAATCCGACCCAAATAGT-3′，P4：5′-GGATCCTCACAATTTAGAAGAAAAGCCTTGA-3′进行PCR反应，原核表达载体的构建、工程菌的诱导表达、粗酶液的制备及粗酶液4CL活性测定方法同上，结果表明突变LJ4CL转基因工程菌株经IPTG诱导后比活力与正常LJ4CL没有显著差异。