一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法

摘要

一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法，包括以下步骤：步骤一、打破种子休眠；步骤二、恒温催芽；步骤三、低温胁迫；步骤四、常温恢复生长；步骤五、耐冷性评价；步骤五、耐冷强度计算。根据相同长势水稻芽在低温胁迫后的成苗率评价耐冷性，将耐冷性分为：极强，强，中，弱，极弱五个类型，并通过连续性的耐冷强度计算值对不同种质间耐冷性给出评价标准，能有效避免因测试方法而导致的误差，并能为不同种水稻芽期耐冷性测试提供依据，从而能帮助水稻育种人员合理选择耐寒性种质进行水稻品种耐寒性改良，具有结果客观，准确性高，方法易操作，重复性好的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻栽培及育种方法，特别涉及一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法。 

背景技术

低温是水稻生长的一大限制因素，是影响水稻产量的一个重大问题，我国每年因低温寒害损失的稻谷达30～50亿kg。水稻整个生长发育期间均可发生低温冷害反应。其中芽期的低温冷害比较容易发生在直播田和秧田，芽期若不耐冷，将导致水稻成苗率的降低和烂秧现象，从而影响水稻光合群体的建立，导致水稻产量的降低。因此，水稻芽期耐冷性是水稻生产不可忽视的重要性状之一。水稻芽期耐冷性是影响水稻芽生长发育的重要因素，芽期耐冷性是幼芽细胞维持生活的能力，从外观上表现为幼芽诱发绿苗的能力，芽期耐冷性与孕穗期和开花期耐冷性有着密切的相关，普遍应用于稻种资源的耐冷性鉴定。 

精确鉴定和评估水稻种质的苗期耐冷性能帮助水稻育种人员合理选择耐寒性种质进行水稻品种耐寒性改良。然而目前水稻种质芽期耐冷性的试验方法及评估标准不统一，现有的试验方法及评估结果对试验结果存在较大的误差， 

现有技术中水稻芽期耐冷性测定方法为： 

每品种选取饱满种子100粒，试验前先用45℃～50℃高温处理48 小时，以打破种子休眠。然后将种子放置于垫滤纸的培养皿中，经浸种后在30℃的恒温箱内催芽。待芽长长至5mm时，取出置于5℃光照培养箱内处理10d。然后将培养皿取出并置于温度高于20℃的有阳光的室内，使稻芽恢复正常生长。放置7-10d后调查成活苗数，并计算成苗率。以成苗率评价芽期耐冷性的强弱，分1～9级评价，评价标准详见表1，试验设三个重复，以三个重复的平均值作为统计单元。 

成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)X100 

表1水稻芽期耐冷性分级标准 

Grading standard of cold tolerance at bud stage 

现有技术的缺点为： 

1、利用100粒种子进行催芽，由于品种出芽率不同，导致最后成苗率存在差异；此外，由于各品种发芽势不同，同一品种不同种子间发芽快慢也有差异，导致最终于符合试验条件(芽长5mm)的种子更少，根据出芽总粒数计算出来的成苗率误差比较大； 

2、现有的评估标准分级标准不尽相同，韩龙植等提出的分级标准中第1级与第3级，第7级与第9级过渡快，因此而产生的试验误差比较大，然而此评价标准却被广泛用于水稻种质芽期耐冷性鉴定中； 

3、单纯利用不连续的评价标准如1、3、5、7、9等只能将不同的水稻种质进行模糊的归类，在比较大量不同水稻种质间芽期耐寒性差异的时候，则容易使耐寒性存在较大差异水稻种质仍然归于同一耐寒类型，而耐寒性差异较小的却归于不同的耐寒性类型，所得结果误差较大。因此，在比较不同水稻种质的耐寒性时，应该使用连续性值进行比较评估分析。 

因此提供一种更加科学精确的芽期耐冷性评估方法，能有效避免因测试方法而导致的误差，并能为不同种水稻芽期耐冷性测试提供依据就显得尤为重要。 

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提出一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法，能有效避免因测试方法而导致的误差，并能为不同种水稻芽期耐冷性测试提供依据，从而能帮助水稻育种人员合理选择耐寒性种质进行水稻品种耐寒性改良，具有结果客观，准确性高，方法易操作，重复性好的特点。 

为达到上述目的，本发明的技术方案为： 

一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法，包括以下步骤： 

步骤一、打破种子休眠：每品种选取足量充实饱满种子，试验前先用45℃～50℃高温处理48小时打破种子休眠； 

步骤二、恒温催芽：所有种子放入清水中浸泡1天，然后取出放至30℃的恒温箱内催芽，待大部分种子的芽长至5mm时，从每品种中挑选芽长5mm的种子各100粒放置于垫有湿润滤纸的培养皿中； 

步骤三、低温胁迫：所有放置好种子的培养皿先置于5℃光照培养箱内处理10d； 

步骤四、常温恢复生长：将培养皿取出并置于温度高于20℃的有阳光的室内，使稻芽恢复正常生长，放置7-10d后调查成活苗数； 

步骤五、耐冷性评价：根据公式：成苗率(％)＝(成活苗数/100)×100计算成苗率；以成苗率评价芽期耐冷性的强弱，根据成苗率将各品种独立的耐冷性分为1、3、5、7、9五个等级进行评价，确定各等级评定标准及命名； 

步骤六、耐冷强度计算：使用连续性耐冷强度的计算值对品种间耐冷性进行比较。 

所述步骤五中水稻芽期耐冷性评价指标及分级命名为： 

1级：成苗率＞90％，叶色青绿，耐冷性极强； 

3级：90％≥成苗率＞70％，耐冷性强； 

5级：70％≥成苗率＞50％，耐冷性中； 

7级：50％≥成苗率＞10％，耐冷性弱； 

9级：10％≥成苗率，耐冷性极弱。 

所述步骤六中耐冷强度的计算方法为： 

1级：1-(成苗率(％)-90)/10，0≤耐冷强度＜1； 

3级：3-(成苗率(％)-70)/10，1≤耐冷强度＜3； 

5级：5-(成苗率(％)-50)/10，3≤耐冷强度＜5； 

7级：7-(成苗率(％)-10)/20，5≤耐冷强度＜7； 

9级：9-成苗率(％)/5，7≤耐冷强度≤9。 

相对于现有技术，本发明的有益效果为： 

1、利用100粒已出芽且芽长均为5mm的种子进行低温胁迫处理，避免了由于品种出芽率不同，导致最后成苗率存在差异；也避免了由于各品种发芽势不同，同一品种不同种子间发芽快慢有差异而导致最终符合试验条件的数量种子更少，解决了根据出芽总粒数计算成苗率误差大的问题； 

2、能对同一品种及不同品种间均进行科学精确的耐冷性判断，解决了现有的评估标准分级标准不尽相同从而导致评估结果适用范围不统一的问题； 

3、在比较不同水稻种质的耐寒性时，使用连续性的耐冷强度值进行比较评估分析解决了单纯利用不连续的评价标准如1、3、5、7、9等只能将不同的水稻种质进行模糊的归类，在比较大量不同水稻种质间芽期耐寒性差异的时候，则容易使耐寒性存在较大差异水稻种质仍然归于同一耐寒类型，而耐寒性差异较小的却归于不同的耐寒性类型，所得结果误差较大的问题。 

具体实施方式

下面通过具体试验例进一步阐述本发明： 

设计了利用现有试验方法和本发明方法进行芽期耐冷性评估和鉴定的两个试验，比较两种方法在鉴定及评估效果方面的优劣： 

1、利用现有方法进行水稻品种芽期耐冷性鉴定及评估： 

试验设计： 

试验对23个水稻早籼品种(组合)进行了芽期耐冷性鉴定，参照前人试验方法进行试验设计，具体为：每品种选取饱满种子100粒，试验前先用45℃～50℃高温处理48小时，以打破种子休眠。然后将种子放置于垫滤纸的培养皿中，经浸种后在30℃的恒温箱内催芽。待芽长长至5mm时，取出置于5℃光照培养箱内处理10d。然后将培养皿取出并置于温度高于20℃的有阳光的室内，使稻芽恢复正常生长。放置10d后调查成活苗数，并计算成苗率。芽期耐冷性的评价标准参照应存山[1]及韩龙植等[2]的评价方法：以成苗率评价芽期耐冷性的强弱，分1～9级评价，评价标准详见表2，以三个重复的平均值作为统计单元。各品种间芽期耐冷性显著性差异用SAS软件进行分析。 

成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)X100 

表2水稻芽期耐冷性分级标准 

Tab l Grading standard of cold to lerance at bud stage 

2、结果与分析 

参试品种的芽期耐冷性结果见表3，显示不同的品种间芽期耐冷性存在差异。 

表3不同品种芽期耐冷性表现 

*为细化后的耐冷性级别，根据级差与成苗率比率计算而得。 

不同品种的芽期耐冷性显著性比较见表4，显示品种间芽期耐冷性存在显著性差异。 

表4不同品种芽期耐冷性显著性比较 

*为细化后的耐冷性级别，根据级差与成苗率比率计算而得。 

3、存在问题 

3、1、表2显示，试验中选取预先破除休眠的100粒种子进行芽期耐冷性试验，导致不同品种在最终符合试验条件(5mm芽长)的出芽率 上存在很大的差异(出芽数从2-80不等)。出芽率的差异将对最终成苗率造成影响，而影响试验的精确性。 

(成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)X100)； 

而且，由于有些品种符合试验条件(5mm芽长)的种子量很小，如试验的中嘉早17的三个重复分别只有12个，7个和13个试验样本，嘉育948的三个重复也分别只有20个，18个和18个试验样本，众所周知，小样本量将导致误差偏大，影响试验的精确性。 

如果试验预先选取足量的种子破除休眠并催芽，从中选取符合条件要求的5mm芽长种子进行试验，各品种的出芽率都为100，则可以避免因为出芽率的不同而造成的试验误差，也提高了样本数量，最终提高试验的精确率。(成苗率(％)＝(成活苗数/100)×100)； 

2、试验中芽期耐冷性的评价标准参照应存山[1]及韩龙植等[2]的评价方法，该标准中99％及以下的成苗率都归于第3级别，从级别1到级别3过渡太快，评价结果不能客观反应品种真实的芽期耐冷性。如在本试验中，很多品种不同重复的的成苗率都在90％以上，有些甚至是96％以上，却归于级别3，属于强耐冷性级别。同样的在第7与第9级别间存在的同样的范围太小或过大的问题。该种分级标准不能对品种的抗性进行客观评价。Liu et al。，(2004)^[3]，提出了一个更为合理的芽期耐冷性评价标准(表5)，该标准把90％以上幼芽全部诱发成绿苗，叶色青绿的归于第1级别；成苗率在10％-50％之间的归为第7级，成苗率在10％以下归为第9级，该分级标准更为合理，能客观地对品种的抗性进行分级评估。 

表5水稻芽期耐冷性分级标准 

Grading standard of cold to lerance at bud stage 

3、试验结果中品种的成苗率是连续型数值，而品种的芽期耐冷性评估标准是间段性数值，利用间段性数值来对连续性数值进行描述只能将品种进行模糊归类，不能客观反映同一组内不同品种间的耐冷性差异。利用间段性数值进行的品种间耐冷性差异显著性比较把所有的23个品种分为A、B、C、D四类，大多数品种集中在其中的一个类型，如表3中I优899、隆平006、T优898、荣优463、03优66、金优418、金优458、金优L2、株两优505、贺优早27等的耐冷性级别都为3，然而具体品种间的差异如何并不能显现出来，而且品种间的显著性差异也会因为利用间断性数据进行处理而不能进行细微比较，当在对大量水稻品种(组合)或者水稻品种资源进行耐冷性的鉴定、评估和比较时，这种情况尤其突出，严重影响了整个试验的精确性和客观性。如果能利用连续性数值进行品种间的差异性比较，则能大大提高试验分析结果的精确性。 

针对上述试验可能产生的误差，利用本发明方法重新对该23个 品种进行了芽期耐冷性的鉴定和评估，以比较本发明新方法的优越性，具体为： 

2、利用本发明方法对同样的水稻品种进行芽期耐冷性的鉴定与评估 

试验设计： 

一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法，包括以下步骤： 

步骤一、打破种子休眠：每品种选取足量充实饱满种子，试验前先用45℃～50℃高温处理48小时打破种子休眠； 

步骤二、恒温催芽：所有种子放入清水中浸泡1天，然后取出放至30℃的恒温箱内催芽，待大部分种子的芽长至5mm时，从每品种中挑选芽长5mm的种子各100粒放置于垫有湿润滤纸的培养皿中； 

步骤三、低温胁迫：所有放置好种子的培养皿先置于5℃光照培养箱内处理10d； 

步骤四、常温恢复生长：将培养皿取出并置于温度高于20℃的有阳光的室内，使稻芽恢复正常生长，放置7-10d后调查成活苗数； 

步骤五、耐冷性评价：根据公式：成苗率(％)＝(成活苗数/100)×100计算成苗率；以成苗率评价芽期耐冷性的强弱，根据成苗率将各品种独立的耐冷性分为1、3、5、7、9五个等级进行评价，确定各等级评定标准及命名； 

步骤六、耐冷强度计算：使用连续性耐冷强度的计算值对品种间耐冷性进行比较。 

所述步骤五中水稻芽期耐冷性评价指标及分级命名为： 

1级：成苗率＞90％，叶色青绿，耐冷性极强； 

3级：90％≥成苗率＞70％，耐冷性强； 

5级：70％≥成苗率＞50％，耐冷性中； 

7级：50％≥成苗率＞10％，耐冷性弱； 

9级：10％≥成苗率，耐冷性极弱。 

所述步骤六中耐冷强度的计算方法为： 

1级：1-(成苗率(％)-90)/10，0≤耐冷强度＜1； 

3级：3-(成苗率(％)-70)/10，1≤耐冷强度＜3； 

5级：5-(成苗率(％)-50)/10，3≤耐冷强度＜5； 

7级：7-(成苗率(％)-10)/20，5≤耐冷强度＜7； 

9级：9-成苗率(％)/5，7≤耐冷强度≤9。 

各品种间芽期耐冷性显著性差异根据各品种耐冷强度的连续值用SAS软件进行分析。 

1、试验结果与分析 

利用本发明方法所得的不同品种的芽期耐冷性表现见表6。不同方法的品种间的耐冷性级别差异比较见表7，利用连续性差值对品种进行耐冷性显著性差异比较结果见表8。 

表6不同品种芽期耐冷性表现 

表7、不同试验方法耐冷性比较 

*为细化后的耐冷性级别，根据级差与成苗率比率计算而得 

比较现有技术和本发明方法在鉴定和评估水稻品种芽期耐冷性差异的精确性，可以发现： 

l、本发明试验中由于同一品种使用了同样数量的芽长均匀一致的种子，各品种符合试验条件的样本数量一致，没有出现如现有技术试验中的如中嘉早17中那样，三个重复中分别只有12个，7个和13个符合试验条件的芽进入试验。大样本试验可以有效降低因试验材料所造成的误差。

2、利用本发明试验方法可以使同一品种不同重复间误差降低。利用本发明的试验方法，同一品种不同重复的成苗率数值相对集中，大多品种的耐冷性都处于同一级别，少数品种处于相邻的两个级别中，没有出现在现有技术的试验方法中跨越三个级别的现象(如现有技术方法中的淦鑫203三个重复分别为3，5， 7三个级别，五优157的三个重复则为1，3，7三个级别)，提高了试验的精确度。 

3、利用本发明的分级鉴定标准，将成苗率高于90％的归于极强耐冷性，可以避免从1级到3级过度过快，而且级别3的跨度过大，使得成苗率大于70以上的都归于同一耐冷强度，可以更合理地定位品种的耐冷性级别，减小因试验误差造成的分级错误。(如金优L2成苗率的三个重复值分别为98.39，98.61和72.41，在统计上第三重复值与前两个重复值具有显著性差异，然而按照现有技术的分级标准，他们的耐冷性强度仍然属于同一级别的，误差显然很大)。 

4、采用连续性数值进行品种间耐冷性强度比较，利用新的标准，可以很好地显示不同品种间耐冷性的细微差别(表8)。 

表8利用连续性差值的品种耐寒性显著性比较 

*为利用连续性差值进行品种耐冷性显著性差异比较 

表8可见，如果只利用不连续的耐冷性强度值进行比较，品种只分为A、B、C、D四个级别，大多数品种都处于ABCD的级别中，而利用连续型数值进行品种间耐冷性比较，品种的耐冷性则分为从A到H的8个级别，品种分布于之间的各个级别，可以更好地区别不同品种的耐冷性差异，尤其是当试验品种数量多时(比如鉴定和评估水稻品种资源的芽期耐冷性)，使用连续性值的优越性更能体现出来。 

2、两种鉴定评估方法比较 

从比较试验结果可以看出，本发明的水稻芽期耐冷性试验方法，耐冷性级别评价标准及鉴定方法可以很好地减小试验误差，提高试验的精确率，合理地对不同水稻品种的芽期耐冷性进行鉴定、评估及比较，相对于现有技术的试验及评价方法，本发明方法存在以下几个方 

面的优势： 

1、本发明的试验方法可以有效地试验提高样本数量，减小因试验材料的差异造成的试验误差，从而提高试验的精确率。 

2、本发明的分级标准可以避免因分级范围过窄(从1级到3级) 或过宽(从7级到9级)造成成苗率存在显著差异却仍然处于同一耐冷性级别的现象出现，合理地对品种的耐冷性进行强度分级。 

3、利用连续性数值对不同品种间的耐冷性强度，可以有效地比较不同水稻品种芽期耐冷性的细微差别，为水稻品种资源的选择和利用提供更详细和可靠的数据。 

3、总结 

水稻芽期耐冷性是影响水稻芽生长发育的重要因素，精确鉴定和评估水稻种质的苗期耐冷性能帮助水稻育种人员合理选择耐寒性种质进行水稻品种耐寒性改良。目前水稻种质芽期耐冷性的试验方法及评估标准不统一，现有的试验方法及评估结果对试验结果存在较大的误差，对现有的试验方法、鉴定和评估标准进行改良和修正，能有效避免因测试方法而导致的误差，提高试验及评估的精确度，极大地提高水稻种质资源的利用率和耐冷性育种的成功率。 

本试验指出了以往的试验方法，鉴定和评估标准所存在的弊端，并建设性地对试验方法进行了改进，对鉴定和评估标准进行了改正并细化，利用本发明的试验方法可以避免因试验材料不同所造成的误差，利用新的鉴定和评估标准可以对不同品种的耐冷性进行客观分析和细微鉴定，该试验方法和鉴定评估标准将为今后水稻种质资源芽期耐冷性的鉴定评估提供一个客观、准确的方法和标准。