可清除水环境中氨氮的奇异变形杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株可清除水环境中氨氮的奇异变形杆菌Proteus mirabilis strain V7，该菌株已于2010年11月06日保藏于中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC No. 4312。该菌株能够快速、高效降低低盐和高盐水环境中氨氮的浓度，奇异变形杆菌的ammonia monooxygenase（amoA）基因参与到该菌降解氨氮的过程。

说明书

技术领域

本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说一种可清除水环 境中氨氮的奇异变形杆菌及其应用。

背景技术

随着水产养殖业的不断发展,集约化程度不断提高，养殖水体污染加 剧。在养殖过程中残饵、粪便、使用的抗生素等是水产养殖水体污染的主 要来源，可造成水体的富营养化和底泥的C、N、P富集污染。其中，氨氮 是重要的污染物之一。氨氮作为水体中的营养素，可导致水富营养化现象 产生，是水体中的主要耗氧污染物，对鱼类及某些水生生物有毒害。2-10 mg/L的氨氮即可达到对水产养殖生物的致死剂量，美国环境保护署规定饮 用水中氨氮的浓度不能超过1.5mg/L。因此，如何减少水产养殖水体中氨 氮的含量一直是研究工作的重点。与物理和化学方法相比，新兴的微生物 法利用微生物自身的代谢过程降低环境中氨氮的浓度，具有省时、彻底、 无二次污染等优点，而且还可调节养殖水体水质，有利于养殖水体中的生 态平衡。目前硝化细菌、光合细菌、芽孢杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌、不 动杆菌等均对养殖水体中的氨氮具有较强的去除能力。但是目前尚无奇异 变形杆菌清除环境中氨氮的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可清除水环境中氨氮的奇异变形杆菌及其 应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的具有清除氨氮能力的细菌筛选简述如下：

一种可清除水环境中氨氮的奇异变形杆菌，奇异变形杆菌Proteus  mirabilis strain V7，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC）登记保藏；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No.4312， 保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

可清除水环境中氨氮的奇异变形杆菌的应用，其特征在于：所述奇异 变形杆菌V7可应用于环境中清除氨氮。

进一步的说，所述奇异变形杆菌V7可用于清除水环境中的氨氮。

更进一步的说，所述奇异变形杆菌V7可用于清除水环境中的氨氮，其 自身的amoA基因在清除氨氮的过程中在RNA水平上被激活。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

目前，通过细菌的代谢过程降解环境污染物在重金属富集、有机污染 的降解和石油降解中均有应用。在接种奇异变形杆菌V7后，环境中氨氮的 浓度快速显著降低。因此，利用奇异变形杆菌自身的代谢清除环境中的氨 氮，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为清除水环境中的 氨氮污染物提供了较好的思路。

附图说明

图1为本发明实施例提供的分别接种奇异变形杆菌V7、蜡状芽孢杆菌 KF8、短小芽孢杆菌Bb和假丝酵母菌Cb后溶液中氨氮浓度的半定量测定图。

图2为本发明实施例提供的接种奇异变形杆菌V7后氨氮浓度随时间的 变化过程图。

图3为本发明实施例提供的不同氨氮起始浓度对清除效率的影响图。

图4为本发明实施例提供的接种奇异变形杆菌V7后海水中氨氮浓度随 时间的变化过程图。

图5为本发明实施例提供的奇异变形杆菌中单氨氧化酶amoA的基因序 列。

具体实施方式

实施例1：能够降低环境中氨氮浓度的奇异变形杆菌的筛选

将-80℃保存的奇异变形杆菌种子接种于LB培养基，摇瓶装液量30%， 培养温度为27～30℃，培养转速150～200rpm/min，培养时间为10-16小 时。

收集上述的菌体，将收集的奇异变形杆菌V7按1.0×10⁷CFU/ml的奇 异变形杆菌接种于氨氮培养基中进行培养，以未接种细菌的氨氮培养基作 为对照。在不同的时间点取出1ml的培养液，13,000rpm离心5min，保 留上清液。上清液采用氨氮半定量测定试剂盒（杭州陆恒生物科技有限公 司）进行氨氮浓度的半定量测定，颜色越黄代表氨氮的浓度越低。本实验 中采用的测试菌株包括奇异变形杆菌V7、蜡状芽孢杆菌KF8、短小芽孢杆 菌Bb和假丝酵母菌Cb。由图1可以看出，奇异变形杆菌V7相对于其他菌 株具有较高的降低水环境中氨氮浓度的能力。

实施例2：接种奇异变形杆菌V7后氨氮的含量随时间变化过程

将奇异变形杆菌V7按1.0×10⁷CFU/mL的起始浓度接种至氨氮培养基 中，而后承装于摇瓶中，装液量为摇瓶体积的30%，培养温度为28～30℃， 培养转速150～200rpm/min。每隔24小时取出1ml的细菌培养液，12,000 rpm离心5min，采用纳氏试剂比色法分析上清液中氨氮的含量。接种奇异 变形杆菌V7后细菌培养液上清中氨氮的含量随时间变化的过程见图3。在 接种4天后，氨氮的清除效率相对稳定，可达85%以上。

实施例3：不同氨氮起始浓度对氨氮清除效率的影响

将奇异变形杆菌V7分别接种至含有20、50、100、200、500、1000和 2000mg/L的氨氮培养基中（每种浓度下菌体的起始浓度为1.0×10⁷CFU/mL），而后承装于摇瓶中，装液量为摇瓶体积的30%，培养温度为28～ 30℃，培养转速150～200rpm/min。64小时后取出1ml的细菌培养液， 12,000rpm离心5min，采用纳氏试剂比色法分析培养液上清中氨氮的含量。 接种奇异变形杆菌V7后氨氮清除效率随时间的变化过程见图3。当氨氮浓 度为20、50和100mg/L时，奇异变形杆菌转化氨氮的效率均可到或是接 近100%。当培养液中含有200mg/L的氨氮时，奇异变形杆菌对氨氮的清除 效率仍可达到50%以上。

实施例4：奇异变形杆菌V7清除海水中的氨氮

将奇异变形杆菌V7按1.0×10⁷CFU/mL的起始浓度接种至含有20mg/L 氨氮的2216E培养基中（2216E培养基为1升的陈海水中含有胰蛋白胨5g， 酵母浸膏1g，FePO₄0.01g），而后承装于摇瓶中，装液量为摇瓶体积的30%， 培养温度为28～30℃，培养转速150～200rpm/min。每隔一定时间取出1 ml的细菌培养液，12,000rpm离心5min，采用纳氏试剂比色法分析上清液 中氨氮的含量。接种奇异变形杆菌V7后细菌培养液上清中氨氮的含量随时 间变化的过程见图4。

上述收集的上清液分别采用纳氏试剂比色法进行氨氮含量的测定，并计 算在接种奇异变形杆菌后氨氮的清除效率。氨氮的清除率=（清除前氨氮的 浓度-剩余氨氮的浓度）/清除前氨氮的浓度。

实施例5：奇异变形杆菌V7中单氨氧化酶amoA的基因序列克隆

设计引物PmamoF1（gacgcatATGTCATTTTTAAAAAAACTACC）和PmamoR1 （ctcgagCTCACGTTTTCTTTTCTG）进行奇异变形杆菌V7中amoA基因的克隆。 PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，48℃退火1min， 72℃延伸1min，从第二步开始进行5个循环，然后94℃变性30s，60℃ 退火1min，72℃延伸1min，进行25循环。PCR产物进行胶回收纯化（Omega 胶回收试剂盒），和pBST载体（购自大连Takara）连接，连接产物转入到 大肠杆菌Top10感受态中，得到含有目的基因的转化子，由北京诺赛基因 进行测序。得到的序列见图5。该1041bp的核苷酸序列在NCBI数据库中的 序列比对结果表明，与来自于奇异变形杆菌的单氨氧化酶同源性达99%。该 基因序列已提交美国NCBI数据库，其accession number为KC775377。

实施例6：amoA基因在RNA转录水平上的研究

为了确定amoA基因在mRNA水平上的转录是否受氨氮的影响，将奇异 变形杆菌V7分别在含有氨氮和不含有氨氮的培养基中培养，提取RNA进行 反转录，最后进行了荧光定量PCR分析了amoA基因的mRNA表达水平。

（1）不同条件下奇异变形杆菌V7中mRNA的提取和DNA的消化

首先提取在含有氨氮和不含有氨氮的培养基中所生长的细菌的RNA，具 体的操作步骤为：

①菌体的收集：将-80℃保存的奇异变形杆菌V7种子接种于LB培养基 中，于28℃摇床中震荡培养过夜，次日按1%（体积比）接种量分别接种到 不含氨氮的SWMYK培养基（不含氨氮的SWMYK培养基其成分为Na₂HPO₄ 3.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，NaCl 3.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L和丁二酸4.0g/L， 水1000mL）和上述的含氨氮的SWMYK培养基（含氨氮的SWMYK培养基其成 分为Na₂HPO₄ 3.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L,NaCl 3.0g/L， MgSO₄ 0.3g/L和丁二酸4.0g/L，水1000mL）中。待菌液分别培养12小 时后，菌液分别以13,000rpm离心5min，分别收集菌体。

②RNA的提取：使用Trizol试剂提取收集的奇异变形杆菌V7的菌体 RNA，提取步骤按照Trizol试剂（Tiangen，北京）使用说明进行，具体操 作步骤为：

a.菌液重悬于1ml的Trizol试剂中，加入200μL的氯仿，震荡15s 充分混匀，室温静置5min后12,000g离心15min。

b.上清液转移至一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，室 温静置30min后10,000g 4℃离心10min。

c.小心吸出管中液体，此时沉淀下来的RNA应该在离心管的底部（一 般情况下，RNA在1.5ml离心管底部呈乳白色），75%的乙醇（DEPC水配置） 洗涤两次，注意不要打散沉淀。

d.瞬时离心后尽量吸尽剩余的乙醇，室温干燥2min，加入适量无RNA 酶的ddH2O反复吹打溶解RNA（注意干燥的时间不要过长，否则RNA很难溶 解）。

e.凝胶电泳和紫外分光光度法对提取的RNA进行定性和定量分析。

注：所有的实验用品都要事先采用DEPC水进行处理，以除掉其中的RNA酶。

③提取的RNA加入DNaseI进行处理，消化掉污染的DNA，反应体系为：

37℃温育2h，DNaseI处理后的RNA进行苯酚-氯仿抽提纯化。最后PCR检 验确定没有DNA污染。

（2）RNA的反转录

对提取的RNA样品进行反转录，具体步骤为：①取1μg的RNA和1.5 μL的随机引物混合，加入5.5μL的无RNase ddH₂O至8μl。将混合物 于75℃保温5min进行RNA变性，立即置于冰水浴中。

②依次加入4μl反转录缓冲液、6μL dNTP混合物和1μL RNA酶抑制 剂，25℃保温5min后加入1μL的反转录酶，反应混合物25℃继续保温 10min，然后置于42℃反应1小时。75℃保温5min灭活反转录酶即得到 cDNA。

（3）Real-Time PCR检验amoA基因的表达

Real-Time PCR的步骤按照Takara Real-Time PCR试剂盒进行，主要操作 如下：

①首先确认PCR所用引物。amoA基因所采用的引物为V7GSTF4 （TTTGGCAAGTGGGAGGATTT）和V7GSTR4（CAAGATAAGGAGATTGAGCGAGTC）。内 参16S rDNA的引物为933F(GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG)和 16SRTR1(CGTGTGTAGCCCTGGTCGTA)。

②得到的cDNA进行500倍稀释，依次加入Mix、正向引物、反向引物、 模板等试剂，所使用的荧光定量PCR仪为ABI7500。退火温度为60℃。

③数据处理：以生长在不含氨氮培养基中的细菌中amoA基因的表达水 平为参照，分析氨氮对amoA表达水平的影响。结果表明，在氨氮存在的情 况下，奇异变形杆菌V7体内的amoA基因表达量明显上升至无氨氮存在情 况时表达量的1.77倍。据此，可以推断，amoA基因参与奇异变形杆菌V7 清除氨氮的过程。