一种用于检测毛发中皮质醇含量的前处理方法

摘要

本发明提供了一种用于检测毛发中皮质醇含量的前处理方法，包括以下步骤，S1、取毛发样品，并将样品去角质化；S2、将S1去角质化后的样品进行液氮冷冻；S3、将经S2中液氮冷冻后的样品研磨粉碎；S4、萃取S3中粉碎后的样品，再干燥萃取后的混合溶液，将干燥所得溶质加入缓冲液。本发明在正常剪碎后需经液氮冷冻研磨的处理，避免了局部高温和发样粉碎不均的情况，得到更加准确、稳定的数据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物内分泌系统数据检测方法，尤其涉及一种皮质醇的检测方法。

背景技术

目前，头发中皮质醇（Cor.）的检测，LC-MS法、酶联免疫吸附法及放射免疫法都被研究中用到。由于考虑到检测灵敏度和特异性，以及检测成本的优越性，利用放射免疫法检测头发中的痕量皮质醇，成为目前测量头发中皮质醇的一个重要方法。

由于头发易受到外界环境污染等多方面因素，同时又不同于血清、尿液等检测介质，传统的采用手工剪碎、磨粉机磨碎、甲醇萃取等方法造成皮质醇提取量低，手工剪碎的过程还容易造成局部高温和发样粉碎不均的情况，严重影响检测结果稳定性和准确性。

发明内容

本发明的目的提供一种用于检测毛发中皮质醇含量的前处理方法，提高皮质醇检测的稳定性和准确度。

本发明提供了一种用于检测毛发中皮质醇含量的前处理方法，包括以下步骤，S1、取毛发样品，并将样品去角质化；S2、将S1去角质化后的样品进行液氮冷冻；S3、将经S2中液氮冷冻后的样品研磨粉碎；S4、萃取S3中粉碎后的样品，再干燥萃取后的混合溶液，将干燥所得溶质加入缓冲液。

本发明提出了一种用于检测毛发中皮质醇含量的前处理方法，在正常剪碎后需经液氮冷冻研磨的处理，避免了局部高温和发样粉碎不均的情况，得到更加准确、稳定的数据。

在一些实施方式中，S1中样品去角质化采用异丙醇浸泡。采用异丙醇浸泡的方法，不仅可以去除角质蛋白，有利于后续的萃取，还可以有清洗毛发的作用。

在一些实施方式中，S4中萃取使用体积比为5：3的甲醇与乙醚的混合溶液作为萃取溶剂。采用甲醇与乙醚的混合溶液进行萃取，操作简单，容易实施，本发明采用体积比为5：3的甲醇与乙醚的混合溶液，可进一步提高测量稳定性和准确性。

在一些实施方式中，S4中缓冲液选用磷酸缓冲液。

在一些实施方式中，S4中干燥选用氮吹仪。大大提高干燥速度。

在一些实施方式中，本发明还包括S4后的S5—冰箱冷藏储存至检测日。一般将采用-4℃的冷藏条件。

在一些实施方式中，本发明还包括S4后的S6—使用放射免疫试剂通过自动放免仪测定。本发明可作为放射免疫法测定毛发中皮质醇含量的前处理。检测灵敏度较高。

在一些实施方式中，S6中取溶质与缓冲液的混合液的上层清液进行测定。上清液的检出水平更加稳定合理。因为皮质醇作为激素存在人体，经过处理将皮质醇提出溶于溶剂中，离心作用后杂质沉淀，上清液中的激素水平相对稳定，检出的稳定性也随之升高。

附图说明

图1为本发明第一次试验制作的标准曲线图；

图2为本发明第二次试验制作的标准曲线图。

具体实施方式

本实验基于放射免疫法，设置不同实验条件的对照组进行试验，分析实验结果后择选出最优的实验条件，修正人体头发中皮质醇水平测定的样品前处理方法。

1.1试验采用仪器与试剂

表一：试验采用的仪器设备

表二：试验采用的试剂

1.2溶液配制

磷酸盐缓冲液（PBS溶液）:将1.5g混合磷酸盐倒入250ml容量瓶内，以少量无CO₂蒸馏水冲洗试剂袋内壁，冲洗水也加入上述250ml容量瓶中，并用无CO₂蒸馏水稀释到刻度摇匀，用3mol/L的NaOH调至pH至7.35。

取适量的标准品配制成浓度为分别为0、10、50、100、200、500ng/ml的标准溶液。

上述皮质醇放免试剂盒包括用来配制标准溶液的标准品，以及配制好的兔抗-Cor.抗体、驴抗兔免疫分离剂。

2.第一次试验

2.1第一次试验设计

试验分别采集男性、女性发样，试验为预试验，未设置空白对照和质控组，将男女发样分别作两个平行发样，此次试验采用正常剪碎发样的处理方式，在运用放射免疫法测定时，分为测定上清液、浑浊液。

根据上述，本次测定共有八个样品号，具体分组如下：

表三中样品组取上层清液测量；

表三：样品组一（上层清液测定组）

样品质量(mg)女性发样男性发样1001310024

表四中样品组取浑浊液测量；

表四：样品组二（浑浊液测定组）

样品质量(mg)女性发样男性发样1005710068

2.2样品前处理

（1）在理发店采集发样，女性发样为同一人头顶刘海发梢，男性发样为多人未知部位混杂发样；

（2）采集发样后，由信封装袋室温保存待处理；

（3）将发样分别剪碎，装入玻璃烧杯，分别称重取100mg发样；

（4）发样加入甲醇溶液5ml、乙醚溶液3ml；

（5）将发样放置50.8℃萃取16h；

（6）使用氮吹仪将吹干萃取后混合液，干燥后溶质加入各个编号后的样品管；

（7）配置PH=7.35的PBS溶液;

（8）各样品管分别加入5mlPBS溶液后，放置于-4℃冰箱内冷藏贮存至检测日。

2.3放射免疫测定

（1）取圆底试管，用记号笔编号NSB、T、B0至B5和各样品序号；

（2）按照碘【¹²⁵I】皮质醇放射免疫分析试剂盒说明书进行加样入离心管；

（3）充分摇匀离心管后，室温放置15min；

（4）使用低速冷冻离心机3500转/分钟将离心管旋转15min；

（5）吸取上清液/浑浊液使用自动放免仪对样品进行测定。

表五：加样顺序表（单位：μl）

表六是按照上述配制后测量的各个标准管的数据列表；

表六:皮质醇的标准管数据(单位：ng/ml)

B/B0表示各个标准管（或者后面的样品管）的放射性均值（cpm）与B0的比值。

并针对上述数据制作了如图1所示的标准曲线。

表七为第一次试验中样品管的检测数据。

表七：第一次试验中的样品管的皮质醇测量数据

管名称放射性(cpm)B/B0浓度值(ng/ml)换算浓度(ng/g)1167380.886.46190.502161020.848.24412.003159180.8310.09504.504163300.857.60380.005195081.020.000.006182000.952.37118.507178400.943.38169.008171720.905.25262.50

2.4第一次试验结果

为便于与文献皮质醇浓度（ng/g）为对照，本次试验将自动放免仪测定的结果（ng/ml）进行单位换算（ng/g），换算公式为：

换算后浓度（ng/g）=实验浓度（ng/ml）×测定样本体积（ml）×单位换算系数；

上式中，单位换算系数=1g/样本质量（mg）。

第一次试验为预实验，试验未设置空白对照和质控组。由表七可以看出，除管5未测出皮质醇，样本的浓度(ng/g）均在文献皮质醇水平的范围(76.60～949.90ng/g)内。但样本数据除8号管262.50ng/g较接近文献皮质醇水平中值224.90ng/g，其余各管的数据波动较大。

1号与2号（190.50ng/g与412.00ng/g）、3号与4号（504.50ng/g与380.00ng/g）、7号与8号（169.00ng/g与262.50ng/g）各平行样的数据差别较大。但又有测定时取浑浊液比取上清液的数据要相对稳定些，也更接近文献数据中值224.90ng/g。

2.5第一次试验结果的总结

第一次试验结果中数据差异较大，可能与如下原因有关：

男发皮质醇浓度高于女发样，女发采集的刘海发样为发梢发样，也很可能影响实验的结果。

此次试验采集的发样在实验过程中发现男、女发样均有染发现象，这种染发很可能对试验造成影响。

本次试验选取的发样为100mg，文献显示发样适宜选取的范围为25mg～80mg，则此次提取的结果比文献中值普遍较高。

3.总结第一次试验的经验准备进行第二次试验，改进点如下：

采集无染发发样，男性分别采集同一人的发根、发梢发样，女性采集同一人的发根和发梢的混合样。

4.第二次试验

4.1第二次试验设计

试验共有3种发样，即女性发样、男性发根发样、男性发梢发样，为得到客观可信的结果，试验设置空白对照组。为控制试验使用的试剂盒的精度，试验设置质控，保证实验结果精确、客观、有效。在样品检测的过程中，为比较测定上清液和浑浊液的不同结果，所有发样分组为1组（上清液组）和2组（浑浊液组）。样品前处理过程中，应该考虑正常剪碎和正常剪碎后再经过液氮冷冻研磨处理的影响，即原来的1、2组再分别分组：1-1组（正常剪碎、取上清液）、1-2组（液氮冷冻研磨、取上清液）、2-1组（正常剪碎、取浑浊液）和2-2组（液氮冷冻研磨、取浑浊液）。为探讨不同剂量发样对测定结果的影响，试验设置不同剂量梯度（25mg、50mg、100mg）。

本次测定共有三十六个样品号，具体分组情况如下表：

表八：1-1组样品（正常剪碎、取上清液）

剂量女性发样男性发根发样男性发梢发样25mg14750mg258100mg369

表九：1-2组样品（液氮冷冻研磨、取上清液）

剂量女性发样男性发根发样男性发梢发样25mg10131650mg111417100mg121518

表十：2-1组样品（正常剪碎、取浑浊液）

剂量女性发样男性发根发样男性发梢发样25mg19222550mg202326100mg212427

表十一：2-2组样品（液氮冷冻研磨、取浑浊液）

剂量女性发样男性发根发样男性发梢发样25mg28313450mg293235100mg303336

4.2第二次试验样品前处理：

（1）采集受试者发样，女性发样为同一人刘海的发根和发梢的混合样本，男性发样为同一人枕际发梢和发根样本；

（2）将发样放入烧杯中，分别加入异丙醇浸泡5min去角质化；

（3）分别将发样剪碎后放入玻璃烧杯内，试验分组，同一样本均分两组，分别称取25mg、50mg、100mg；

（4）第一组为正常剪碎，第二组为正常剪碎后液氮冷冻研磨处理；

（5）将经（4）粉碎后发样分别加入甲醇溶液5ml、乙醚溶液3ml。

（6）将发样放置50.8℃萃取16h；

（7）使用氮吹仪吹干萃取后混合液，干燥后溶质加入各个编号后的样品管；

（8）配置PH=7.35的PBS溶液；

（9）各样品管分别加入2mlPBS溶液后，放置于-4℃冰箱内冷藏贮存至检测日。

4.3第二次试验放射免疫测定：

（1）取圆底试管，用记号笔编号NSB、T、B0至B5和各样品序号；

（2）按照碘【¹²⁵I】皮质醇放射免疫分析试剂盒说明书进行加样；

（3）充分摇匀后，室温放置15min；

（4）使用低速冷冻离心机3500转/分钟离心15min；

（5）按照表八至表十一的设定，使用自动放免仪对各样品进行测定。

二次试验加样顺序表参照表五。

表十二为第二次试验中皮质醇的标准管数据。

表十二：第二次试验中皮质醇的标准管数据

针对上述数据制作了如图2所示的标准曲线。

表十三是第二次试验中皮质醇的样品管数据。

表十三：第二次试验中皮质醇的样品管数据（单位：ng/ml）

4.4第二次实验结果

为便于与文献皮质醇浓度（ng/g）为对照，本次试验将自动放免仪测定的结果（ng/ml）进行单位换算（ng/g），换算公式为：

换算后浓度=（ng/g）实验浓度（ng/ml×测定样本体积（ml）×单位换算系数；

上式中，单位换算系数=1g/样本质量（mg）。

第二次试验在第一次试验的基础之上改进了不足，实验结果显示，皮质醇浓度（ng/g）除2号管、30号管未检出皮质醇水平，18号管(60.80ng/g）超出文献皮质醇水平的范围(76.6ng/g～949.9ng/g)，其余样品管的皮质醇水平均在文献皮质醇水平范围内，说明此次试验方法确实可行。

文献显示头发中皮质醇水平中值为224.9ng/g。本次实验当中设置了25mg、50mg、100mg不同的剂量组，以此对照来分析发样剂量是否是头发皮质醇水平的影响因素，同时检验第一次试验方法所得结果的正确性。

理论上来说，头发中的皮质醇是累积存在的，随着头发剂量的翻倍，头发中皮质醇（ng/g）的水平应该也呈现倍数关系。表十三数据显示，只有13～15管的浓度水平（ng/g）比较符合这样的规律。再看换算浓度（ng/g）13～15管的数据（199.20ng/g、168.80ng/g、154.60ng/g）都在皮质醇水平范围之中。

5总结

5.1液氮的低温研磨

第一次试验均为正常剪碎，第二次试验设置了正常剪碎和液氮冷冻研磨组。从实验结果来看13～15管的结果符合倍数关系的皮质醇水平（ng/g），换算浓度也是符合文献浓度范围的，在中值附近波动。试验数据反映试验方法，13～15管分组的处理手段为正常剪碎后发样后，加液氮冷冻研磨后，测定皮质醇时则采用样品离心后的上清液。这样的结果，是液氮冷冻研磨的过程可以避免局部高温，温度不均等情况，使得发样研磨的更加彻底。同时，液氮的低温效果，发样变脆，研磨后的颗粒更细，如此发样的测定结果也会更稳定。

5.2上清液样品

检测时考虑到样品经过离心，是检测上清液还是浑浊液能够得到稳定的皮质醇水平，因此分组。实验结果表明，上清液的检出水平更加稳定合理。这样的结果可能因为皮质醇作为激素存在人体，经过处理将皮质醇提出溶于溶剂中，离心作用后杂质沉淀，上清液中的激素水平相对稳定，检出的稳定性也随之升高。

本实验在总结前人的经验之上，结合现有的实验室条件，完成利用人体头发样本测定皮质醇水平的实验，得到如下结论。头发中皮质醇水平的测定需采集受试者枕际5cm近发根发样，在正常剪碎后需经液氮冷冻研磨的处理，避免了局部高温和发样粉碎不均的情况，得到更加准确、稳定的数据。在放射免疫测定时，应取发样样本的上清液进行测定。本实验结果真实、可靠，望能给相关研究人员提供一些帮助。