细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法

摘要

本发明涉及一种细胞载体芯片，包括基底层和镀层，基底层材料为不影响光线透射的材料，基底材料上覆盖对细胞无损伤的镀层，待测样品最低拉曼信噪比和镀层最高拉曼信噪比的比值>3，镀层可吸收激光并被局部剥离或局部融化。还涉及该细胞载体芯片在单细胞拉曼图谱的快速测量方法、基于拉曼图谱的单细胞快速鉴定方法和快速分选/分离单细胞的方法上的应用。降低了细胞载体芯片的拉曼光谱背景；提高了弹射系统的精确度及易操作性；保证了被弹射的目标细胞的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞鉴定和分选技术领域，具体涉及一种细胞载体芯片及 利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法。

背景技术

地球上所有生命均由单一细胞个体组合与分化而成，因此单细胞是生命 活动的基本单元和进化单位。对单细胞进行深入系统的研究不仅可以全景式 地揭示生命活动的本质，而且单个细胞的特异性与分化过程对于研究疾病机 理和诊断预防疾病等具有重要的意义。传统微生物学对微生物细胞表征的研 究基于群体细胞水平，而最近研究表明，在细胞种群中，即使是基因组信息 完全一致的不同单个细胞之间，其表型也具有极为显著的差异，即“细胞功 能异质性”问题，而这些差异往往具有重要的生物学意义。另一方面，自然 环境中超过99%的微生物为不可培养微生物，不能通过传统的培养方法分离和 研究。而这些不可培养微生物中蕴含着大量未知的功能基因，且可能具有比 可培养微生物更重要的功能。单细胞的功能识别及其定向分选因其不依赖于 细胞的扩增，从而允许直接跳过细胞培养这一步，能够克服“尚不可培养微 生物”这一瓶颈问题。同时，即使对于可培养微生物，在群落环境中的原位 研究也能更真实地解析他们在自然环境中的作用。因此，“单细胞研究”（针 对特定功能的单个细胞的分析）将能够解析生命体系最“深”层次的运作机 制，从而能够带来生命科学及其在能源、环境、健康、农业、海洋等广泛应 用领域的突破。

单细胞技术主要包括两部分，即目标细胞的识别和分选。细胞的识别方 式包括形态、大小、颜色、荧光、质谱或者拉曼图谱等，分选方法包括光钳、 显微操作、微毛细管电泳以及流式细胞术等。其中，荧光活化细胞分选 （Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS）是分离细胞的有效手段， 可实现高通量分选，但也具有一定的局限性。FACS严重依赖于对欲分选的细 胞功能与表型（及其生物标记）的预先认知以实现荧光标记。但不论在干细 胞发育的机理研究、肿瘤细胞的诊断，还是微生物群落中功能组分的识别中， 关键的细胞表型经常仅有粗放认识或完全未知（即“未知”的细胞表型）， 也没有其生物标记。恰恰相反，这些研究的目的往往正是寻找这些未知但关 键的表型（及其生物标记）。同时部分荧光标记手段会对细胞造成伤害，甚 至导致细胞死亡。此外，FACS在单位时间只能获得与区分很有限的细胞信息 数据，如形态、折光率、反射率或荧光强度等有限指标。尤为重要的是，FACS 方法需要将细胞预先悬浮于液态环境中，因此不能有效的建立在不同环境条 件下基因表达与环境因素之间的关系，进而无法获得不可培养微生物与其生 态功能之间的原位联系。因此，对于单细胞的深入研究需要依赖于一种无需 标记、且能真实反映细胞原位状态下的活性与功能的方法，实现活体单细胞 水平上的性状识别与分选，从根本上认识、改进和利用细胞功能。

拉曼光谱技术是一种高效的信息识别技术，可以提供细胞内化合物分子 构成和结构的信息作为其“分子指纹”，包括核酸、蛋白、多糖及脂类等， 且可实现原位无侵害性测量。这些信息可反映细胞的多种性状，如种类、生 理周期、环境变化以及其它表型。此外，研究表明，当细胞被¹³C或¹⁵N等同 位素标记时，其部分拉曼峰位会出现显著的“红移”，且红移的幅度与其¹³C 或¹⁵N的含量成正比，因此同位素标记-拉曼联用技术可作为研究细胞代谢的 有效途径。但是自发的拉曼信号相对较弱，因此限制了拉曼光谱在单细胞高 通量鉴定与分选中的应用。共振拉曼技术可将单细胞拉曼图谱采集时间缩短 到1ms，但其仅适用于含有拉曼活性分子如色素的特定细胞。表面增强拉曼 技术（SERS）可将拉曼信号显著增强10¹⁰～10¹⁴倍，但在短期内使用该技术仍 无法获得稳定的可重复的细胞拉曼图谱。

激光诱导向前转移（LIFT）技术可用于材料转移，其原理为将该材料镀 于某种背景介质上形成薄膜，细胞或细胞悬浮液置于薄膜上，使用脉冲激光 将能量传递到薄膜上，从而剥离或融化脉冲激光目标范围内薄膜材料，并将 薄膜及其上细胞转移至新的接收体系中。该方法已用于将人体组织涂于镀银 的石英材料表面以分离目标组织细胞等。但该方法目前仍具有一定的局限性： （1）目前使用的镀层材料有拉曼背景或荧光薄膜，干扰单细胞的拉曼图谱和 荧光测量；（2）多需要使用高强度紫外脉冲激光进行细胞转移，通常会对细 胞造成伤害，无法保证细胞活性；（3）对于目标细胞的鉴定仍基于形态、荧 光标记等少数因素，需对细胞有预先了解。（4）到目前为止，没有任何系统 耦合单细胞拉曼-荧光检测系统和单细胞弹射系统。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种细胞载体芯片及利用其进行 单细胞快速鉴定或分选的方法，降低了细胞载体芯片的拉曼光谱背景；提 高了弹射系统的精确度及易操作性；保证了被弹射的目标细胞的活性。

本发明通过以下技术方案实现：

一种细胞载体芯片，包括基底层和镀层，所述基底层材料为不影响光 线透射的材料，所述基底材料上覆盖对细胞无损伤的所述镀层，待测样品 最低拉曼信噪比和所述镀层最高拉曼信噪比<3，所述镀层可吸收激光并被 局部剥离或局部融化。

在上述技术方案中，所述基底材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃或氟化 钙玻璃中的任一种。

在上述技术方案中，所述镀层材料包括金属、金属氧化物或非金属氧 化物中的任一种。

在上述技术方案中，所述镀层材料包括Ti、TiO₂、SiO₂、Si、Al、Al₂O₃、 Au或Ag中的任一种。

在上述技术方案中，所述镀层厚度为0-1000nm。

在上述技术方案中，所述局部剥离或局部融化深度<1000nm。

一种单细胞拉曼图谱的快速测量方法，将细胞涂于上述技术方案中任 一所述的细胞载体芯片上，风干，进行拉曼光谱采集，拉曼光谱采集时的 表面激光功率小于等于500mW，0.01s≤采样时间≤600s。

一种基于拉曼图谱的单细胞快速鉴定方法，将细胞涂于上述技术方案 中任一所述的细胞载体芯片上，风干，进行拉曼光谱采集，通过采集结果 区分单细胞。

一种快速分选/分离单细胞的方法，将细胞样品涂于上述技术方案中任 一所述的细胞载体芯片表面，锁定目标单细胞，使用脉冲激光对锁定的目 标单细胞所处位置处镀层施加能量，将锁定的目标单细胞弹射并收集到收 集容器内。

在上述技术方案中，所述锁定目标单细胞通过拉曼光谱仪或拉曼显微 设备进行拉曼光谱激发后检测单细胞的拉曼光谱进行判别和锁定。

在上述技术方案中，对细胞进行拉曼光谱激发的激光与弹射的脉冲激 光具有同一波长。

在上述技术方案中，所述锁定的目标单细胞经弹射后为活体单细胞。

本发明通过选择合适的镀层材料降低了细胞载体芯片的拉曼光谱背 景；提高弹射系统的精确度及易操作性；通过镀膜材料的改造使其对激光 较敏感,降低激光强度以保证细胞活性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的经改进的拉曼显微系统与现有技术的系统 相比在保证相同信噪比（SNR）的前提下的拉曼图谱，可以看出实施例提供 的经改进的拉曼显微系统可显著缩短图谱采集时间。

图2为本发明实施例提供的五种口腔微生物的具有代表性的单细胞拉 曼图谱。每个图谱采集时间为0.5s，激光强度为60mW。

图3为本发明实施例提供的五种口腔微生物的单细胞拉曼图谱（采集 时间0.5s）的PC-CVA分析结果。十五个单细胞拉曼图谱作为训练集，五 个单细胞拉曼图谱（带方框）作为测试集以验证分类结果。

图4为基于不带镀层的细胞载体芯片的单细胞弹射分选前和分选后显 微镜下的照片。

图5为基于不带镀层的细胞载体芯片弹射分选所得¹³C-E.coli单细胞 DNA扩增结果电泳图（L代表DNA电泳分子量标准，条带1和2为弹射出的 两个单细胞的扩增结果）。

图6为本发明实施例提供的基于带镀层的细胞载体芯片的细胞弹射分 选流程示意图。

图7为本发明实施例提供的分别被¹²C或¹³C标记的Escherichia coli  DH5α的单细胞拉曼图谱。

图8为本发明实施例提供的使用50nm Au作为镀膜材料的结果示意图。

图9为本发明实施例提供的使用25nm Al₂O₃作为镀膜材料的结果示意 图。

图10为本发明实施例提供的使用25nm TiO₂作为镀膜材料的结果示 意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。

实施例1：细胞载体芯片的材料选择与制作

其基底材料为不影响光线透射的材料，包括但不限于硅酸盐玻璃、石 英玻璃、氟化钙玻璃；可使用的特殊镀层材料包括Ti、TiO₂、SiO₂、Si、 Al、Al₂O₃、Au和Ag等。使用SEM/TEM溅射镀膜机(型号Q150T，购自Quorum  Technologies公司)将上述材料涂覆于基底表面形成镀层；镀层厚度与镀 膜时间及电流相关，在电压为2.5KV，目标与材料的距离为50mm时，镀 层厚度计算的具体公式为Th=7.5It（Th，镀层厚度，埃；I，电流，mA；t， 时间，min）。根据需要，制作镀层的厚度为10-1000nm。

实施例2：单细胞拉曼图谱的快速测量方法

用于测试的Escherichia coli DH5α（购自Promega(Beijing) Biotech Co.,Ltd.）在含有5g/l葡萄糖的基础培养基中进行37°C，150  rpm过夜培养至稳定期。1升基础培养基含有2.5g Na₂HPO₄、2.5g KH₂PO₄、 1.0g NH₄Cl、0.1g MgSO₄·7H₂O、10μl饱和CaCl₂溶液、10μl饱和FeSO₄溶液和1ml Bauchop&Elsden溶液。其中，1升的Bauchop&Elsden溶 液含有10.75g MgSO₄、4.5g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCO₃、1.44g ZnSO₄·7H₂O、 1.12g MnSO₄·4H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.28g CoSO₄·7H₂O、0.06g H₃BO₃和51.3ml饱和HCl溶液。

拉曼图谱测定时，将稳定期的细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高 纯水中，并利用高纯水将细胞稀释至10⁶-10⁸个/ml浓度，以保证单细胞水 平的分散。取2μl稀释后细胞涂于镀有25nm TiO₂的细胞载体芯片（基 底层材料透明，厚度<10mm）上，室温风干。

所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使 用了高灵敏度EMCCD（型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国），可缩 短图谱采集时间；使用发射波长为532nm激光的激光器，激光强度最高为 500mW；使用纳米-微米尺度显微镜，采用63倍物镜。将带有样品的细胞 载体芯片置于改进的拉曼光谱仪的载物台，样品表面激光强度60mW，采 集时间0.1s，获得如图1所示的单细胞拉曼图谱。

以前报道系统采用Jobin Yvon系统，表面激光强度15mW，采集时间 30s，由结果可见，在保证谱图相同信息量的前提下可将单细胞拉曼图谱 的最低采集时间缩短到0.1s，为已报道的系统的采集时间（30s）的1/300。

实施例3：基于拉曼图谱的单细胞快速鉴定

五株口腔微生物Enterococcus faecalis ATCC29212，Actinomyces  viscosus ATCC27045，Streptococcus mutans UA159(ATCC700610)， Streptococcus sanguinis ATCC49295以及Porphyromonas gingivalis W83 (ATCC:BAA-308)（所述五株口腔微生物购买自广东省微生物研究所微生物 菌种保藏中心（Microbial Culture Collection Center of Guangdong  Institute of Microbiology,GIMCC））均在BHI培养基中37°C静置培 养至稳定期（所述BHI培养基购买自Qingdao Hopebio-Technology Co.， Ltd，中国），其中P.gingivalis W83的培养在严格厌氧条件下实行。拉 曼图谱测定时，将稳定期的细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中， 并利用高纯水将细胞稀释至10⁶-10⁸个/ml浓度，以保证单细胞水平的分散。 取2μl稀释后细胞涂于镀有50nm Au镀层的细胞载体芯片（基底层材料 透明，厚度<10mm）上，室温风干。

所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使 用了高灵敏度EMCCD（型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国），可缩 短图谱采集时间；使用发射波长为532nm激光的激光器，激光强度最高为 500mW；使用纳米-微米尺度显微镜，采用63倍物镜。将带有样品的细胞 载体芯片置于改进的光谱仪的载物台，样品表面激光强度60mW，采集时 间0.5s，对每种菌株测定20个单细胞拉曼图谱（图2是测定的具有代表 性的单细胞拉曼图谱），并对采集所得图谱通过MatLab软件进行主成分分 析（PCA）和典型变量分析（CVA）。PC-CVA分析结果可将细胞分成五组， 如图3所示，且除Enterococcus faecalis ATCC29212(b)和Streptococcus  sanguinis ATCC49295(e)间有微弱的重叠外，其它菌株均可被较好分开（这 些细胞属于不同种属，图中不同符号代表不同种的细胞。若不同种的细胞 有混合交叉，证明其未被分开；若其分隔较远，如所有的a聚集到一起， 所有的b聚集到一起，且a和b无任何交叉，则证明a和b可被分开）。 所有独立的测试样本都分布在置信区间内，且分类中具有较高权重的拉曼 峰位与图2的结果吻合度较高，证明该分类结果的有效性。因此，快速扫 描所获得的单细胞拉曼图谱可作为细胞分类的依据。

实施例4：基于细胞载体芯片的细胞分选/分离方法

用于测试的Escherichia coli DH5α分别在含有5g/l¹²C或¹³C标 记葡萄糖的基础培养基中进行37°C，150rpm过夜培养至稳定期。1升基 础培养基含有2.5g Na₂HPO₄、2.5g KH₂PO₄、1.0g NH₄Cl、0.1g MgSO₄·7H₂O、 10μl饱和CaCl₂溶液、10μl饱和FeSO₄溶液和1ml Bauchop&Elsden 溶液。其中，1升的Bauchop&Elsden溶液含有10.75g MgSO₄、4.5g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCO₃、1.44g ZnSO₄·7H₂O、1.12g MnSO₄·4H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.28g CoSO₄·7H₂O、0.06g H₃BO₃和51.3ml饱和HCl溶液。

在两种培养基中培养的细胞长至稳定期后，将菌液按体积等量混合， 将细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中，并利用高纯水将细胞稀 释至10⁶-10⁸/ml浓度，以保证单细胞水平的分散。取2-3μl稀释后细胞 涂于不具备镀膜的细胞载体芯片上。所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购 买的普通拉曼光谱仪的基础上使用了高灵敏度EMCCD（型号DU970N-BV,购 自Andor公司,英国），可缩短图谱采集时间；使用发射波长为532nm 激光的激光器，激光强度最高为500mW；使用纳米-微米尺度显微镜，采 用63倍物镜。将带有样品的细胞载体芯片置于改进的光谱仪的载物台，样 品表面激光强度60mW，采集时间0.1s。经¹³C标记的细胞与未被标记的细 胞的拉曼图谱有显著区别，据此可定位目标E.coli单细胞。随后开启高强 度（能量约为270μJ）的337nm紫外氮分子激光将目标单细胞弹射并收 集到离心管管盖中。经弹射分离后目标单细胞位置呈现空白，而其周围其 它细胞未受影响（图4）。将分离所得单细胞进行基因组扩增，结果见图5， 随后的16s-rRNA测序结果（与实施例5测序结果相同）证明管内细胞确实 为E.coli而非其它物种，证明该基于细胞载体芯片的弹射方法分离单细胞 的可靠性。

实施例5：基于细胞载体芯片的活体细胞分选/分离方法

本鉴定与分选方法原理如图6所示，其具体实现过程如下：

用于测试的Escherichia coli DH5α分别在含有5g/l¹²C或¹³C标 记葡萄糖的基础培养基中进行37°C，150rpm过夜培养至稳定期。1升基 础培养基含有2.5g Na₂HPO₄、2.5g KH₂PO₄、1.0g NH₄Cl、0.1g MgSO₄·7H₂O、 10μl饱和CaCl₂溶液、10μl饱和FeSO₄溶液和1ml Bauchop&Elsden 溶液。其中，1升的Bauchop&Elsden溶液含有10.75g MgSO₄、4.5g FeSO₄·7H₂O、2.0g CaCO₃、1.44g ZnSO₄·7H₂O、1.12g MnSO₄·4H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.28g CoSO₄·7H₂O、0.06g H₃BO₃和51.3ml饱和HCl溶液。

在两种培养基中培养的细胞长至稳定期后，将菌液按体积等量混合， 将细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中，并利用高纯水将细胞稀 释至10⁶-10⁸/ml浓度，以保证单细胞水平的分散。取2μl稀释后细胞分别 涂于50nm Au、25nm TiO₂、25nm Al₂O₃的细胞载体芯片上，室温风干。

所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使 用了高灵敏度EMCCD（型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国），可缩 短图谱采集时间；使用发射波长为532nm激光的激光器，激光强度最高为 500mW；使用纳米-微米尺度显微镜，采用63倍物镜。将带有样品的细胞 载体芯片置于改进的光谱仪的载物台，样品表面激光强度60mW，采集时 间0.1s，获得如图7所得的单细胞拉曼图谱，由图可见，在¹³C标记葡萄 糖的基础培养基中培养的细胞，其拉曼图谱与¹²C标记葡萄糖的基础培养基 中培养的同种细胞具有显著差异。利用该差异，可以迅速识别和锁定所需 要的目标细胞。

为了分离得到一个被¹³C标记的活体单细胞Escherichia coli DH5α， 将拉曼共聚焦显微镜焦平面定位于镀膜底部，开启由激光器发出的共享光 路的另一束532nm的脉冲激光，脉冲激光的最高输出能量为150mW；此 处使用的脉冲激光与拉曼光谱采集所需激光波长相同，并且具有相同的光 路系统，以避免频繁的光路系统切换及安装另外的仪器设备，降低设备成 本用脉冲激光对锁定目标单细胞所处位置处镀膜施加能量，从而将目标单 细胞弹射并收集到一个微量离心管管盖中。在三种镀层上的细胞分别被弹 射后的细胞载体芯片，在显微镜下可以明显看到原有锁定的细胞已经不存 在与细胞载体芯片上（图8，图9，图10）。将离心管盖上的细胞洗涤并 转移到离心管中，并在100μl LB液体培养基

中进行培养，得到细胞生长悬浮液，利用悬浮液中的细胞进行16s rRNA 的PCR扩增，对扩增产物测序，结果表明确实为Escherichia coli DH5α 而非其他杂菌污染。表明通过细胞载体芯片与拉曼显微系统结合，可以在 快速识别目标细胞后，得到活体单细胞。经该方法弹射所得的目标E.coli DH5α细胞可用于单细胞基因组扩增。所述16S-rRNA测序证实分离的细胞 是Escherichia coli DH5α（测序结果如下：

CNGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTG  GAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCG  GGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAAC  GGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACT  GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC  ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG  GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCT  CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG  GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC  AGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA  TCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG  CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG  GACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA  CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG  CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCA  AGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG  GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAG  TTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGC  TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC  CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT  GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACC  AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGA  GCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCNA  CTCCATGAAGTCNGAA）（SEQ ID No.1）。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技 术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不 脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围 当中。

<110>  北京惟馨雨生物科技有限公司

 

<120>  细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法

 

<130>  XLB-0026

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1235

<212>  DNA

<213>  Escherichia coli

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (2)..(2)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1218)..(1218)

<223>  n is a, c, g, or t

 

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<221>  misc_feature

<222>  (1232)..(1232)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  1

cngacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg       60

 

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