瘤胃脲酶抗原组合物及其制备方法和应用及瘤胃脲酶抗原蛋白的应用

摘要

本发明提供了一种瘤胃脲酶抗原组合物，所述瘤胃脲酶抗原组合物含有瘤胃脲酶抗原蛋白和免疫佐剂；瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。还提供了一种瘤胃脲酶抗原组合物的制备方法，该制备方法制备得到的瘤胃脲酶抗原组合物，如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物在制备用于减缓反刍动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用和在制备用于提高反刍动物产奶的品质的组合物中的应用，以及瘤胃脲酶抗原蛋白在制备用于减缓反刍动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用和在制备用于提高反刍动物产奶的品质的组合物中的应用。本发明减缓了尿素在反刍动物的瘤胃内的分解速度，提高了反刍动物尿素利用率和微生物蛋白质合成效率。

说明书

技术领域

本发明涉及畜牧学领域，具体地，涉及一种瘤胃脲酶抗原组合物，该瘤 胃脲酶抗原组合物的制备方法、该瘤胃脲酶抗原组合物的应用和瘤胃脲酶抗 原蛋白的应用。

背景技术

反刍动物是指哺乳纲，偶蹄目，反刍亚目中的动物，如骆驼、鹿、长颈 鹿、羊驼、羚羊、牛、羊等。由于这类动物都具有复杂的反刍胃，能反刍食 物，故称反刍动物。反刍动物的消化分两个阶段：首先咀嚼原料吞入胃中， 经过一段时间以后将半消化的食物反刍再次咀嚼。反刍动物的胃分为四个胃 室，分别为瘤胃、网胃、重瓣胃和皱胃。前两个胃室（瘤胃和网胃）将食物 和胆汁混合，特别是使用共生细菌将纤维素分解为葡萄糖，然后食物反刍， 经缓慢咀嚼以充分混合，进一步分解纤维，然后重新吞咽，经过瘤胃到重瓣 胃，进行脱水，然后送到皱胃，最后送入小肠进行吸收。

在现行的反刍动物饲养方法中，通常在反刍动物的饲料中添加尿素，尿 素在瘤胃中被微生物分解成氨，然后氨被微生物吸收利用，从而转化为微生 物蛋白，供小肠消化吸收。所以，添加尿素能够起到向反刍动物补充蛋白质 来源的效果。

但是，研究发现，瘤胃中尿素分解产氨的速度为微生物利用氨的速度的 4倍，这样不仅导致尿素的利用率降低，而且蓄积过多的氨易导致动物氨中 毒。因此，如何减缓尿素在瘤胃内的分解速度，对于提高反刍动物尿素利用 率和微生物蛋白质合成效率具有重要的影响。

发明内容

本发明的目的是减缓尿素在反刍动物的瘤胃内的分解速度，以提高反刍 动物尿素利用率和微生物蛋白质合成效率。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种瘤胃脲酶抗原组合物，其 特征在于，所述瘤胃脲酶抗原组合物含有瘤胃脲酶抗原蛋白和免疫佐剂；所 述瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原组合物的制备方法，其特 征在于，该制备方法包括如下步骤：（1）将SEQ ID NO：2所示的核酸克隆 到原核表达载体上，得到能够表达SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白 的质粒；（2）将步骤（1）得到质粒转化到感受态原核细胞中，并培养转化 后的感受态原核细胞，使SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白得到表达， 得到培养物；（3）从步骤（3）得到的培养物中纯化SEQ ID NO：1所示的 瘤胃脲酶抗原蛋白；并且将SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白与免疫 佐剂混合。

另一方面，本发明还提供了如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物的制备方法 制备得到的瘤胃脲酶抗原组合物。

另一方面，本发明还提供了如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物在制备用于 减缓反刍动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用。

另一方面，本发明还提供了如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物在制备用于 提高反刍动物产奶的品质的组合物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原蛋白在制备用于减缓反刍 动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用，该瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原蛋白在制备用于提高反刍 动物产奶的品质的组合物中的应用，该瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO： 1所示的氨基酸序列，其中，所述反刍动物产奶的品质包括反刍动物产奶的 酪蛋白含量、蛋白含量和非乳脂固体含量中的至少一种。

另一方面，本发明还提供了一种提高反刍动物产奶的品质的方法，其中， 所述反刍动物产奶的品质包括反刍动物产奶的酪蛋白含量、蛋白含量和非乳 脂固体含量中的至少一种，其特征在于，该方法包括：使用如上所述的瘤胃 脲酶抗原组合物对反刍动物进行免疫，以使反刍动物的唾液中含有抗SEQ  ID NO：1所示的蛋白的抗体。

本发明的技术方案减缓了尿素在反刍动物的瘤胃内的分解速度，提高了 反刍动物尿素利用率和微生物蛋白质合成效率。特别地，本发明的技术方案 提高了奶中酪蛋白含量、蛋白含量和非乳脂固体含量。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1是实施例1中的实验菌体和对照菌体的变性凝胶电泳图。

图2是实施例1中的蛋白溶液的变性凝胶电泳结果图。

图3是实施例3中的抗体效价图，A为血清IgG，B为血清IgA，C为 唾液IgG，D为唾液IgA。

图4是实施例4中脲酶活性和氨氮结果测定图，A是脲酶活性，B是投 喂尿素后的氨氮。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是， 此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发 明。

本发明提供了一种瘤胃脲酶抗原组合物，其特征在于，所述瘤胃脲酶抗 原组合物含有瘤胃脲酶抗原蛋白和免疫佐剂；瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

其中，相对于每重量份的所述瘤胃脲酶抗原蛋白，所述免疫佐剂的含量 可以为100-10000重量份，优选为1000-3000重量份。其中，所述免疫佐剂 可以为本领域公知的选择，例如为弗氏免疫佐剂，所述弗氏免疫佐剂可以为 弗氏完全免疫佐剂和弗氏不完全免疫佐剂，均可通过商购获得。其中，所述 免疫佐剂的重量是指免疫佐剂的总重量。

本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原组合物的制备方法，其特征在于，该 制备方法包括如下步骤：（1）将SEQ ID NO：2所示的核酸克隆到原核表达 载体上，得到能够表达SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白的质粒；（2） 将步骤（1）得到质粒转化到感受态原核细胞中，并培养转化后的感受态原 核细胞，使SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白得到表达，得到培养物； （3）从步骤（3）得到的培养物中纯化SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原 蛋白；并且将SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白与免疫佐剂混合。

其中，相对于每重量份的所述瘤胃脲酶抗原蛋白，所述免疫佐剂的用量 可以为100-10000重量份，优选为1000-3000重量份。其中，所述免疫佐剂 可以为本领域公知的选择，例如为弗氏免疫佐剂，所述弗氏免疫佐剂可以为 弗氏完全免疫佐剂和弗氏不完全免疫佐剂，均可通过商购获得。其中，所述 免疫佐剂的重量是指免疫佐剂的总重量。

其中，SEQ ID NO：2所示的核酸能够编码SEQ ID NO：1所示的瘤胃 脲酶抗原蛋白。所述“克隆”、“转化”、“表达”、“培养”和“纯化”的操作 均是本领域技术人员所熟知的。即本领域技术人员在知晓SEQ ID NO：2所 示的核酸的条件下，可以得到纯化SEQ ID NO：1所示的瘤胃脲酶抗原蛋白。

本发明还提供了如上所述的制备方法制备得到的瘤胃脲酶抗原组合物。

本发明还提供了如上所述的制备方法制备得到的瘤胃脲酶抗原组合物。

本发明还提供了如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物在制备用于减缓反刍 动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用。其中，优选所述反刍动物为骆 驼、鹿、长颈鹿、羊驼、羚羊、牛或羊，更优选所述反刍动物为奶牛。其中， 可以使用如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物对反刍动物进行免疫，以使反刍动 物的唾液中含有抗SEQ ID NO：1所示的蛋白的抗体。其中，免疫的的操作 是通过本领域技术人员熟知的常规方法进行的。

本发明还提供了如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物在制备用于提高反刍 动物产奶的品质的组合物中的应用。其中，优选所述反刍动物为骆驼、鹿、 长颈鹿、羊驼、羚羊、牛或羊，更优选所述反刍动物为奶牛。其中，可以使 用如上所述的瘤胃脲酶抗原组合物对反刍动物进行免疫，以使反刍动物的唾 液中含有抗SEQ ID NO：1所示的蛋白的抗体。

另一方面，本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原蛋白在制备用于减缓反刍 动物的瘤胃中的尿素分解的组合物中的应用，该瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ  ID NO：1所示的氨基酸序列。其中，优选所述反刍动物为骆驼、鹿、长颈 鹿、羊驼、羚羊、牛或羊，更优选所述反刍动物为奶牛。其中，可以使用如 上所述的瘤胃脲酶抗原蛋白对反刍动物进行免疫，以使反刍动物的唾液中含 有抗SEQ ID NO：1所示的蛋白的抗体。

另一方面，本发明还提供了一种瘤胃脲酶抗原蛋白在制备用于提高反刍 动物产奶的品质的组合物中的应用，该瘤胃脲酶抗原蛋白具有SEQ ID NO： 1所示的氨基酸序列，其中，所述反刍动物产奶的品质包括反刍动物产奶的 酪蛋白含量、蛋白含量和非乳脂固体含量中的至少一种。其中，优选所述反 刍动物为骆驼、鹿、长颈鹿、羊驼、羚羊、牛或羊，更优选所述反刍动物为 奶牛。其中，可以使用如上所述的瘤胃脲酶抗原蛋白对反刍动物进行免疫， 以使反刍动物的唾液中含有抗SEQ ID NO：1所示的蛋白的抗体。

本发明还提供了一种提高反刍动物产奶的品质的方法，其中，所述反刍 动物产奶的品质包括反刍动物产奶的酪蛋白含量、蛋白含量和非乳脂固体含 量中的至少一种，其特征在于，该方法包括：使用如上所述的瘤胃脲酶抗原 组合物对反刍动物进行免疫，以使反刍动物的唾液中含有抗SEQ ID NO：1 所示的蛋白的抗体。其中，优选所述反刍动物为骆驼、鹿、长颈鹿、羊驼、 羚羊、牛或羊，更优选所述反刍动物为奶牛。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

SEQ ID NO：2所示的DNA通过委托宝生物工程(大连)有限公司进行商 业订制的全序列合成得到，该DNA的5’端具有限制性酶Nde I的酶切位点 （5-CATATG-3），且3’端具有限制性酶Xho I的酶切序列（5-CTCGAG-3）， 并且具有编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核酸序列（第8-1714位）。

利用限制性酶Nde I（购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1161A） 和Xho I（购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1094A）将上述插入序列 的DNA（约500ng）和pET-28a表达载体（约500ng，购自默克公司，货 号69864-3）按照酶的使用说明书进行12小时酶切。利用胶回收试剂盒 （Takara），按其说明书对酶切后的插入序列的DNA（大小为1.7kb，序列包 括SEQ ID NO：2所示的核酸序列）和酶切后pET-28a表达载体的进行回收 并纯化。在T4连接酶（购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D2011A）的 作用下，按其说明书将酶切后的PCR产物连接到酶切后pET-28a表达载体上， 得到表达质粒。按照文献（分子克隆实验指南（第三版），科学出版社2002 年9月出版）中的方法，将上述表达质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株的感受 态细胞中（购自默克公司，货号69450-3），并经过筛选和验证，得到携带上 述表达质粒的原核细胞。

将携带上述表达质粒的原核细胞用LB培养基（胰蛋白胨10g/L、酵母 提取物5g/L、氯化钠10g/L）在37℃下培养到OD值为0.6时，加入终浓度 为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，购自宝生物工程(大连) 有限公司），继续在37℃下培养4小时，然后离心收集实验菌体。

将上述实验菌体和对照菌体（即未进行IPTG诱导的平行对照实验获得 的菌体）通过变性凝胶电泳（SDS-PAGE，按照文献（分子克隆实验指南（第 三版），科学出版社2002年9月出版）中的方法进行），结果如图1所示。 证明实验菌体中表达出了分子量为60kDa左右的蛋白，与SEQ ID NO：1 所示的蛋白分子量相同，证明实验菌体中表达出了SEQ ID NO：1所示的蛋 白。

在蛋白提取缓冲液（购自默克公司，货号70584-3）中重悬上述实验菌 体（每克菌体用5mL蛋白提取缓冲液），用超声处理破碎上述菌体（相对于 每mL的接受超声处理的物质，超声波的功率为100W，频率为40kHz，时 间为5min）后离心去除上清，得到包涵体沉淀。将包涵体沉淀用包涵体溶 解缓冲液（配方10mM Tris-HCl,pH 8,8mM尿素）溶解（每克包涵体用2mL 的包涵体溶解缓冲液）。然后利用金属螯合层析柱（购自默克公司，货号 70751-3）按其说明书纯化包涵体中的蛋白。按照文献（分子克隆实验指南 （第三版），科学出版社2002年9月出版）中的方法，通过超滤（10kDa） 和透析，对脲酶进行逐步复性，得到SEQ ID NO：1所示的蛋白含量为0.5 mg/mL的蛋白溶液，该蛋白溶液的变性凝胶电泳结果如图2所示。

将上述蛋白溶液与弗氏佐剂（购自Sigma公司，货号F5881和F5506， 分别为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂）混合均匀（相对于每重量份的蛋白， 弗氏佐剂的用量为2000重量份），得到瘤胃脲酶抗原组合物。

实施例2

选择装有瘘管（按照文献（牛瘤胃造瘘术，畜牧兽医科技信息，2010 年02期）中的方法造瘘并植入瘘管）的泌乳荷斯坦奶牛（胎次2-3次；泌 乳日龄152±45天；产奶量23.2±5.4kg/天）8头，随机分为2组，每组4 头，分别为免疫组和生理盐水对照组。

在上述奶牛颈部两侧皮下和胯部两侧肌肉内（共4个注射点）注射实施 例1得到的瘤胃脲酶抗原组合物，以进行免疫，每次每个注射点的注射剂量 为1mL。并且首次免疫时使用含有弗氏完全佐剂的瘤胃脲酶抗原组合物， 在首次免疫后的第14天、28天、42天和49天使用含有弗氏不完全佐剂的 瘤胃脲酶抗原组合物分别进行加强免疫。

实施例3

在实施例2进行的过程中，分别取受试奶牛在首次免疫后的当天、第7 天、21天、35天和49天的血清和唾液，使用实施例1中制备的SEQ ID NO： 1所示的蛋白的蛋白溶液和酶联免疫（ELISA）试剂盒（购自Bethyl公司， 货号A10-118P）按其说明书测定血清和唾液中对SEQ ID NO：1所示的蛋白 具有特异性免疫反应的抗体的效价，结果如图3所示。具体地，血清IgG特 异性抗体在第4次免疫后达到1:92160。血清IgA特异性抗体在第3次免疫 后达到1:6400。此外，血清IgM特异性抗体效价在第4次免疫后达到1:25600。 唾液中特异性IgG效价在第4次免疫后达到最高值。而唾液中特异性IgA效 价在第3次免疫达到最高值。

实施例4

在实施例2进行奶牛免疫后的第56天，通过瘘管投喂60g尿素，分别 在投喂同时和投喂后的1、2、4、6、8和12h取瘤胃液样品，并按文献（反 刍动物营养学研究方法，2011年10月第一版，现代教育出版社）中的方法 测定瘤胃液的氨氮浓度。按文献（反刍动物营养学研究方法，2011年10月 第一版，现代教育出版社）中的方法测定受试奶牛在首次免疫后的当天、第 7天、21天、35天和49天的瘤胃液脲酶活性。

结果（如图4所示）表明，第4次免疫后，免疫组与非免疫组相比瘤胃 脲酶活性显著降低。第4次免疫后并且投喂尿素后，奶牛瘤胃氨氮快速升高， 在第1h达到高峰，之后氨氮浓度逐渐回落到正常水平。但是，免疫组与对 照组奶牛相比，在第1h时氨氮浓度显著降低。这表明，实施例1得到的瘤 胃脲酶抗原组合物能有效降低了脲酶活性，并减缓氨氮的生成速度。

实施例5

按照实施例2的方法，按照文献（反刍动物营养学研究方法，2011年10 月第一版，现代教育出版社）中的方法检测并计算受试奶牛在首次免疫后的 当天、第7天、21天、35天和49天瘤胃液pH值和VFA（挥发性脂肪酸）。 由表1可见，脲酶免疫刺激物对瘤胃pH无显著影响，对总VFA和各类VFA 也没有显著影响（统计t检验的P值均远大于0.05），表明脲酶免疫后未影 响奶牛瘤胃的正常发酵模式。

表1  脲酶免疫后对瘤胃发酵指标影响

  项目   对照组平均值   免疫组平均值   总体标准误   t检验的P值   pH值   6.38   6.40   0.08   0.88   总VFA(mM)   98.80   108.97   8.45   0.27   乙酸(mM)   67.73   74.41   5.05   0.23   丙酸(mM)   15.81   17.05   1.76   0.51   异丁酸(mM)   1.00   0.98   0.11   0.88   丁酸(mM)   11.97   13.57   1.32   0.27   异戊酸(mM)   1.73   1.65   0.26   0.77   戊酸(mM)   1.16   1.32   0.19   0.44   乙酸：丙酸   4.21   4.41   0.20   0.52

实施例6

对奶牛采食量及产奶量的记录显示，疫苗免疫后对奶牛采食量无显著影 响，同样对奶牛产奶量也无显著影响。按照文献（反刍动物营养学研究方法， 2011年10月第一版，现代教育出版社）中的方法检测并计算奶牛产奶的乳 品指标，结果如表2所示，显示免疫处理组中的酪蛋白含量、蛋白含量和非 乳脂固体含量均高于空白对照组。

表2  免疫脲酶后奶牛乳成分的变化

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限 于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明 的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。