改进的编码的大载体、使用它们的测定系统以及用于进行测定的方法

摘要

本发明涉及一种编码的微载体(2)，该微载体(2)包括用于识别的附接至其上的一个可读代码，所述编码的微载体(2)包括一个本体(3)，该本体(3)具有用来检测一种化学和/或生物反应的至少一个检测表面(6)，该微载体进一步包括至少一个间隔元件(9)，该间隔元件(9)从该本体(3)突出并且被成形为当该编码的微载体(2)被放在一个平面上时确保在所述平面与该检测表面(6)之间存在一个间隙，其中该检测表面(6)面向所述平面。本发明还涉及一种测定装置，该测定装置被设计为使用多个所述编码的微载体(2)进行测定。最后，本发明涉及用于监测一种化学或生物反应的方法。

说明书

本发明涉及一种编码的微载体，并且更具体地涉及一种具有间隔元件的微载体，涉及 一种测定系统，并且涉及一种用于进行化学和/或生物测定的方法。

在本发明的范围之内，一种微粒或微载体是指任何类型的颗粒，分别是指在大小上用 显微镜可见的任何类型的载体，它们典型地具有从100nm至300微米、优选从1μm至200 μm的最大尺寸。

根据本发明，术语微载体是指一种被功能化或被设计为有待功能化的微粒，其包含或 被设计为包含结合至这些微载体的表面或充满在其容积内的一个或多个配体或功能单位。大 范围的化学以及生物分子可以作为配体附接至微载体。微载体可以具有多种功能和/或配 体。如在此使用的，术语功能单位表示定义修饰、附接至、附加自、涂覆、或者共价或非共 价地结合至所述微载体表面或充满在其容积内的任何种类。这些功能包括所有在高通量筛选 技术和诊断学中常规使用的功能。

在本披露中任何对微载体或微粒的代码的提及包括写在所述微载体或所述微粒表面上 的代码、以及写在该微载体或微粒的内部深处的代码。这些代码以及用于写代码的方法披露 于例如专利申请WO00/63695中，通过引用将其结合在此。具体地说，将披露的专利申请 WO00/63695的与这些代码以及读写方法有关的所有方面通过引用明确地结合在此。

药物发现或筛选以及DNA测序通常涉及对极大量化合物或分子进行测定。这些测定典 型地包括，例如，针对感兴趣的化合物或特定目标分子而筛选化学文库，或针对分子之间的 感兴趣的化学和生物相互作用进行测试。那些测定通常要求进行成千上万单独的化学和/或 生物反应。

由于处理如此大量的单独的反应而产生许多实际问题。最显著的问题可能是标记和跟 踪各个单独的反应的必要性。

跟踪这些反应的一致性的一个常规方法是通过物理分离在微量滴定板中的各个反应而 实现的。然而，微量滴定板的使用具有一些缺点，如尤其是所使用的微量滴定板的大小的物 理限制，并且因此限制了可以在该板上进行的不同反应的数目。

鉴于在微阵列的使用中的限制，如今它们被功能化的编码的微粒有利地取代而进行化 学和/或生物测定。功能化的编码的微粒各自配备有独特地识别结合至该微粒表面的特定I’ 配体的代码。这样的功能化的编码的微粒的使用允许随机处理，这表示可以将所有的成千上 万的独特地功能化的编码的微粒混合并且使其同时经受一种测定。功能化的编码的微粒的实 例描述于国际专利申请WO00/63695中并且展示于图1中。

国际专利申请WO2010/072011描述了一种具有至少一个微流体通道的测定装置，该微 流体通道用作在其中可以填充多个功能化的编码的微粒1(图1)的反应室。该微流体通道 配备有用作过滤器的止动装置，其允许含有化学和/或生物试剂的液体溶液流过，同时将这 些功能化的编码的微粒1封闭在内部。所述微流体通道的几何学高度以及所述功能化的编码 的微粒1的尺寸被选择为使得所述微粒在各个微流体通道内部典型地被安排为单层排列，从 而防止所述微粒1彼此重叠。

在它们的附接配体与流过的化学和/或生物试剂之间显示出有利反应的功能化的编码的 微粒1然后被读取其代码，由此导致产生该有利反应的配体的鉴别。

术语微流体通道是指一种闭合通道，即，具有在大小上用显微镜可见的横截面的细长 的流体通道，即，该通道具有典型地从大约1微米至大约500微米，优选大约10微米至大 约300微米的最大尺寸。微流体通道具有一个纵向，该纵向不一定是直线的并且相应于在该 微流体通道之内流体被导向的方向，即，优选地实质上相应于流体的平均速度矢量的方向 (假定一种层流态)。

用WO2010/072011中描述的测定装置，感兴趣的反应的检测可以基于在微流体通道中 存在的各个功能化的编码的微粒1的荧光强度的连续读出，如在图6a中所描绘的。图6a清 楚地显示，当将各个功能化的编码的微粒1的强度考虑为时间的函数时，在原点从斜率提取 早期定量信息是困难的或甚至是不可能的。因此，描述于WO2010/072011中的功能化的编 码的微粒1以及测定装置不允许在达到平衡状态(此时荧光信号饱和)之前将试剂或配体的 快速定量。虽然WO2010/072011的测定装置减少了达到平衡(分析物的典型浓度值在纳摩 尔范围)所需要的时间，但仍需要十分钟至二十分钟，而处于皮摩尔范围的更低浓度可能占 用长达数小时达到平衡并且用于定量。而且，它们的在荧光信号方面的差异(尤其是甚至已 经达到平衡之后的扩散模式)并不决定具有低于大约15％的误差幅度的定量信息。

本发明的目标在于补救所有或部分上述缺点。

本发明通过提供一种编码的微载体而实现了这些目标，该微载体包括一个用于识别该 微载体的可读代码，所述微载体包括一个本体，该本体具有用来检测一种化学和/或生物反 应的至少一个检测表面，该微载体包括至少一个间隔元件，该间隔元件从该本体突出并且被 成形为当该编码的微载体被放在一个平面上时(其中该检测表面面向所述平面)确保在所述 平面与这个检测表面之间存在一个间隙。

本发明还涉及一种测定系统，该测定系统包括多个根据本发明的编码的微载体并且进 一步包括一种测定装置，该测定装置具有被成形为容纳多个所述编码的微载体的至少一个微 流体通道，所述微流体通道具有通过其可监测一种测定的至少一个观察壁，其中各个编码的 微载体的所述微流体通道以及间隔元件被成形为当所述编码的微载体被引入所述微流体通道 时(其中所述检测表面面向所述观察壁)确保在所述检测表面与所述观察壁之间存在一个间 隙，从而允许流体在所述间隙中的循环。

此外，本发明涉及一种用于进行化学和/或生物测定的方法，该方法包括使用至少一个 根据本发明的编码的微载体的一个步骤，其中化学和/或生物反应在所述编码的微载体的一 个检测表面上被监测。

因此，可以在具有微流体通道的测定装置中使用至少一个根据本发明的编码的微载 体，从而以快速、多重以及定量的方式进行化学和/或生物测定。根据本发明的编码的微载 体允许在多重定量分析中的早期(典型地是在测定的前几秒)定量，因此显著减少了用描述 于WO2010/072011中的功能化的编码的微粒进行的定量分析的持续时间(典型地是该持续 时间除以至少十)。还已经发现，与现有技术的功能化的编码的微粒所需要的量相比较，根 据本发明的测定装置需要少得多的编码的微载体来获得可靠的定量分析，由此增加了多重化 水平并且减少了读出时间。当该编码的微载体被引入该测定装置的微流体通道时，其中该微 载体的检测表面面对观察壁，包含用于这些测定的化学和/或生物试剂的液体溶液可以流入 由这些间隔元件产生的、在所述检测表面与所述观察壁之间的间隙中。这些间隔元件允许将 这些编码的微载体以该微流体通道的几何高度对齐，并且因此促进该液体溶液流过该微流体 通道。

现有技术的功能化的编码的微粒1的准确定位在它们填塞进入微流体通道的过程中不 受控制并且它们中的一些与微流体通道的表面之一相接触，特别是该观察壁。这样的接触阻 止在接触表面(其中之一可以是该检测表面)之间发生对流并且限制试剂到针对与该微流体 通道的表面接触的功能化的编码的微粒的那些检测表面的扩散流的质量传递。

相反，用本发明的编码的微载体，各个间隔元件防止在该微流体通道的检测表面与壁 之间的任何接触，迫使一种对流并且避免在该检测表面上的反应仅仅受到扩散流支配。一个 特定的微流体通道壁例如是测定装置的观察壁。

根据一个实施例，当该编码的微载体被放在一个平面上时(其中该检测表面面向那个 平面)，预期与所述平面接触的接触表面代表小于检测表面的20％，优选小于15％，更优选 小于7％。由此有可能促进相对于扩散流的质量传递。一个特定的平面例如是测定装置的观 察壁。当该编码的微载体被放在一个平面上时(其中该检测表面面向那个平面)，预期与所 述平面接触的接触表面代表小于面向所述平面的该检测表面的部分的20％，优选小于15％， 更优选小于7％。

根据一个技术特征，该检测表面具有至少一个区域，其中当所述微载体被放在一个平 面上时(其中该检测表面面向所述表面)，所述区域的各个点属于所述编码的微载体的两个 不同的横截面，这两个不同的横截面彼此垂直并且垂直于所述表面，所述横截面没有间隔元 件。这个技术特征确保当该微载体平放在所述平面上并且在与那个平面基本上平行的层流中 时，该微载体围绕垂直于该平面的轴的取向不显著影响在该间隙中的流动。换言之，没有该 微载体关于该流动的择优旋转取向，该择优旋转取向会改变发生在该检测表面上的反应的效 能。

在一个实施例中，所述接触表面仅仅由所有这些间隔元件形成。更优选地，该接触表 面存在于在该检测表面的远侧的一个或多个间隔元件的至少一个末端。这样的末端还称为远 端。

在一个实施例中，该接触表面远离该检测表面。

在一个实施例中，该编码的微载体包括至少两个，优选至少三个间隔元件，这些间隔 元件被设计为使得当该编码的微载体被放在一个平面上时，所述至少两个间隔元件面向所述 平面。

根据本发明的一个实施例，该本体具有圆柱形的形状或薄片形状。

在一个优选的实施例中，该检测表面是基本上平坦的。

在一个实施例中，至少一个间隔元件与所述本体是一体的。在另一个实施例中，至少 一个间隔元件是与该本体结合的分开部分。

根据一个实施例，当该编码的微载体被放在一个平面上时(其中该检测表面面向所述 平面)，在所述检测表面与所述平面之间的最大距离大于该编码的微载体的最大高度的 5％，优选大于10％。由此增加了在该检测表面与该平面之间的间隙的横截面的大小，同时减 轻了由该编码的微载体在一个微流体通道中产生的拥塞(congestion)，从而允许在所述微 流体通道中的层流。该间隙的横截面的大小的这种增加将增加相对于该检测表面的流动速度 并且因此增加在该流体溶液中的感兴趣的分子与附接至该编码的微载体的一种或多种配体之 间的接触的机会。它增加了测定灵敏度。而且，当所述编码的微载体被加载进入一个微流体 通道时，这个比率降低了流过的液体的流体阻力。降低微流体阻力意味着在测定过程中可以 增加在一个给定微流体通道中所加载的编码的微载体的数目，因此增加了多重化水平。已经 发现的是，在测定过程中本发明的编码的微载体保持了该测定装置的整体性。

在一个实施例中，各个间隔元件从至少一个检测表面突出。

在一个优选的实施例中，各个间隔元件被成形为确保当该编码的微载体被放在一个平 面上时(其中该检测表面面向所述平面)，所述平面与所述检测表面基本上彼此平行。由此 当该编码的微载体被加载进入一个微流体通道时，在该检测表面与所述平面之间的间隙促进 层流。根据本发明的一种编码的微载体促进层流，其中在所述平面与该检测表面之间的距离 是恒定的。

根据一种可能性，各个间隔元件位于该检测表面的周围。

本发明的这些编码的微载体可以包括在高通量筛选技术和诊断学中常规使用的任何材 料或从其制造。这些材料的非限制性实例包括胶乳、聚苯乙烯、交联葡聚糖、聚甲基苯乙 烯、聚碳酸酯、聚丙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、氟化乙烯丙烯，以及 在微加工或微铣削中常用的材料，如玻璃、SiO₂、硅、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、多晶 硅、molubden、聚酰亚胺、金、银、铝、钢或其他金属，或者环氧基光敏材料，如SU8。 该编码的微载体可以具有任何形状和大小。优选地，这些编码的微载体由硅晶体制成。

在一个实施例中，本发明的编码的微载体以这样一种方式被编码以使得可以通过阅读 该代码来确定其功能。

在一个优选的实施例中，本发明的编码的微载体的本体具有薄片形式。术语薄片表示 该编码的微载体的本体具有两个基本上平行的并且基本上平坦的主要表面，其中一个至少用 作一个检测表面，并且它的在这两个主要表面之间的高度显著小于其宽度和其长度(例如， 小至少两倍)。

根据一个技术特征，各个主要表面可以具有任何形状；非限制性实例是正方形、矩 形、圆形、三角形或六角形。

因此，当具有薄片形式的本体的编码的微载体被引入具有如专利申请WO2010/072011 中描述的矩形或近似矩形截面的微流体通道中时，它们的两个主要表面基本上面向该微流体 通道的两个主要表面，其中之一是观察壁，并且可以通过光学方法穿过该观察壁而容易地对 它们进行检测。

在另一个实施例中，该编码的微载体具有磁性特性。由此它们可以被固定在该微流体 通道之内。

在一个实施例中，根据本发明的方法进一步包括将一个或多个编码的微载体引入根据 本发明的一个测定装置的微流体通道中的步骤。

在一个优选的实施例中，根据本发明的方法进一步包括通过该测定装置的所述观察壁 阅读所述编码的微载体的附带的代码的步骤。

在一个实施例中，该方法进一步包括通过该测定装置的所述观察壁阅读所述编码的微 载体的附带的代码的步骤。

通过基于附图提出的以下详细说明进一步展示了本发明，这些附图代表编码的微载体 的示例性和解释性的实施例，并不限制本发明，其中：

图1展示了现有技术的编码的微载体的俯视透视图；

图2展示了根据本发明的编码的微载体的俯视透视图；

图3展示了根据本发明的一个测定装置的微流体通道的横截面图；

图4展示了加载在图3的微流体通道中的图2的编码的微载体的俯视图；

图5展示了加载在图3和图4的微流体通道中的图2的编码的微载体的详细横截面 图。

图6a展示了在测定的第一分钟之内观察到的在图1的功能化的编码的微粒上的荧光发 射；

图6b展示了在测定的第一分钟之内观察到的在图2的编码的微载体上的荧光发射；

图7a展示了在图1的功能化的编码的微粒上发生的荧光信号的动力学曲线；

图7b展示了在图2的编码的微载体上发生的荧光信号的动力学曲线；

本发明的在图2、4、5以及6b中展示的一种编码的微载体2包括一个具有通过圆柱形 表面4描绘的直圆柱体形状的本体3以及两个圆形的主要表面5，如在图2、4、5以及6b 中所显示的。这些主要表面5中的至少一个包括一个基本上平坦的检测表面6(显示在图2 和图5中)，用来检测化学和/或生物反应。该编码的微载体2的典型直径的范围是从1μm 至大约200μm。

所述编码的微载体2的本体3具有圆柱形薄片的形式，这意味着该直圆柱体的高度显 著小于(小至少两倍)主要表面5的半径。为了能够检测化学和/或生物反应，该编码的微 载体2的检测表面6有利地是部分或完全功能化的。

本发明的编码的微载体2进一步包括一种可读代码。由此，该编码的微载体2以这样 一种方式被编码并且功能化以使得可通过阅读其代码来确定其功能化。如在图2和6b中所 显示的，该代码包括多个穿越孔7的一种独特模式。该代码还优选地包括一种不对称取向标 记8，如一个L形的记号(图2)或一个三角形。这个不对称取向标记8旨在将这些主要表 面5彼此区分。

根据本发明的编码的微载体2是由氧化硅制成的。本发明的编码的微载体2可以使用 干和/或湿蚀刻技术来成形。

此外，根据本发明的编码的微载体2包括多个间隔元件9(显示在图2和图5中)， 尤其是二十个间隔元件9，它们从本体3突出。编码的微载体2的间隔元件9被成形为确保 当编码的微载体2被放在一个平面10上时(其中检测表面6面向所述平面10)，在所述平 面10与检测表面6之间存在一个间隙11，如在图5中所示。

各个间隔元件9具有截短的直圆柱体的形状12，被布置在检测表面6的周围并且继续 在圆柱形表面4延伸至一个远端13。各个圆形直圆柱体12通过该编码的微载体2的圆柱形 表面4沿着其高度被截短。

可替代地(未显示在图中)，各个间隔元件9可以具有截短的圆锥的或钉突(spike) 的形状。

各个间隔元件9的高度彼此相等。各个间隔元件9的远端13一起形成接触表面14 (展示在图2中)，它与检测表面6基本上平行。当所述编码的微载体2被放在一个平面 10上时(其中检测表面6面向这样一个平面10)，预期这个接触表面14与所述平面10相 接触。接触表面14的大小代表小于检测表面6的大小的20％，优选小于15％。

选择各个截短的直圆柱体12的高度允许定义在检测表面6与所述平面10(编码的微 载体2如下所述被放在该平面上)之间的在图5中表示的距离d(图5)。有利地，这个距 离d(即，间隙11的高度)小于编码的微载体2的最大高度H的30％(图5)。最优选地， 该距离d大于该高度H的5％，更优选是大于10％。在这些图的实例中，编码的微载体2的高 度H是大约10μm并且该距离d是大约1μm。

检测表面6进一步具有一个区域15，其中，当编码的微载体2被放在一个平面10上 时(其中检测表面6面向所述表面10)，所述区域15的各个点属于沿着轴AA和BB的两个 不同的横截面(显示在图2中)，这两个不同的横截面彼此垂直并且垂直于所述平面10。 所述横截面没有间隔元件9。这确保了当微载体2被平放在所述平面10上并且在与那个平 面10基本上平行的层流中时，微载体2围绕垂直于平面10的轴的取向不显著影响在间隙 11中的流动。换言之，没有微载体2关于该流动的择优旋转取向，该择优旋转取向会改变 发生在检测表面6上的反应的效能。

功能化的编码的微载体2对于在根据本发明的一个测定系统中进行化学和/或生物测定 是有用的。实际上，编码的微载体2用作一种用于化学和/或生物测定的支持物。在这方面 的能力，编码的微载体2包含结合至其表面(尤其是结合至检测表面6)的一种或多种配 体。当该结合配体的编码的微载体2与一种可能含有一种或多种目标分析物的溶液接触时， 取决于一种适当的分析物的存在或不存在，感兴趣的反应可以在检测表面6上发生。作为一 个实例，感兴趣的反应可以发射或抑制可以被监测的荧光信号。检测在检测表面6上的反应 可以允许确定感兴趣的特定分析物的存在或不存在。

根据本发明的测定系统100包括多个本发明的编码的微载体2并且进一步包括一个测 定装置101，其部分地显示在图3至5中。测定装置101具有至少一个描绘在图3至图5中 的微流体通道102。这样一个测定装置101在例如专利申请WO2010/072011中描述，在这 方面通过引用将其结合在此。微流体通道102包括一个进口103和一个出口104并且被成形 为容纳多个所述编码的微载体2。微流体通道102配备有止动装置105，止动装置105被安 排在微流体通道102的出口104的附近并且用作允许一种液体溶液流过同时将所述编码的微 载体2封闭在内部的过滤器。微流体通道102具有一个横截面，该横截面允许至少两个编码 的微载体2以如在图4中描绘的一种单层安排而跨所述微流体通道102的长度并列安排。微 流体通道102和编码的微载体2的大小被选择为使得所述编码的微载体2的高度H的范围是 从微流体通道102的最小高度D的大约51％至大约95％(图5)。

微流体通道102包括至少一个观察壁106，通过该观察壁可监测一种测定。典型地， 当该测定通过荧光信号而被监测时，观察壁106是透明的。

在根据本发明的一个系统中，当编码的微载体2被加载在微流体通道102中时(其中 所述检测表面6面向所述观察壁106)，这些间隔元件9在所述检测表面6与所述观察壁 106之间产生一个间隙10，从而允许液体在所述间隙10中的循环。被允许在间隙10中流动 的这种液体含有用于该测定的感兴趣的化学和/或生物试剂。

为了证明使用根据本发明的测定系统100中的编码的微载体2而不是使用一种现有测 定系统的优势，用相同的配体在相同条件下将现有技术的一组编码的微粒1以及一组编码的 微载体2功能化。涉及为了将所述编码的微载体2或所述编码的微粒功能化的化学过程是熟 知的，并且暗示首先是表面硅烷醇基的硅烷化，接着是在结合一种配体之前氧化为羧基。在 此处描述的测定中，结合在这些表面上的配体是免疫球蛋白G抗体(lgG)。然后将该组编 码的微粒1和该组编码的微载体2各自加载到两个相似的微流体通道102中并且两者都与同 样的液体接触，该液体含有一种可能与所述配体反应并且产生一种可以被监测的荧光信号的 化学试剂。对于当前测定，该液体含有一种抗免疫球蛋白G(抗IgG)。

图6a和图6b显示了分别由编码的微粒1和编码的微载体2以大约100nM的浓度在测 定的第一分钟之内发射的信号。

现有技术的给定的编码的微粒1的表面通常显示扩散模式或线性模式，如在图6a中所 展示的。相反，通过使用间隔元件9，编码的微载体2在给定的检测表面6上展现出均匀的 信号，如在图6b中所展示的。

图7a和7b显示了分别针对各个编码的微粒1或针对各个微载体2随着时间的过去的 荧光信号的定量测量。编码的微粒1展现出从一个微粒到另一个微粒的在它们的荧光信号方 面的显著差异，如在图7a中所示，并且最后需要大的统计组(statistical panel)来提取 重要信息。

相反，在测定的前几分钟，记录在各个编码的微载体2的各个检测表面6上的信号没 有展现出彼此之间的差异，如在图7b中所示。

因此间隔元件9允许遍及微流体通道101的均匀对流，从而导致随着时间的过去的并 且跨编码的微载体2的均匀荧光增加。

该均匀荧光增加允许在前几秒通过观看荧光率而快速定量正在被冲洗的分析物。对于 现有技术的编码的微粒1的情况不是这样，因为该荧光信号增加被淹没在来自如在图7a中 强调的区域中显示的质量传递缺陷的伪影中，无需诉诸于大的微粒统计组。

从在此披露的本发明的说明书和实践考虑，本发明的其他实施例对于本领域的技术人 员将是清楚的。该说明书和这些实例旨在被认为仅是示例性的，本发明的真正范围和精神由 下面的权利要求书指明。