含碘放射状大分子化合物及其制备方法及包含该化合物的CT造影介质组合物

摘要

本发明公开一种适于用作计算机断层扫描（CT）造影介质的活性成分的含碘放射状大分子及其制备方法及包含该含碘放射状大分子的造影介质组合物。针对本发明的含碘放射状大分子，其对比度增强的持续时间与现有的含碘小分子造影介质化合物相比已被显著提高；体内毒性已通过形成具有相对较长的生物相容性聚合物链的保护层（该保护层能够阻止在核区域的表面附近被取代的毒性含碘化合物暴露于外部环境而产生潜在的不利影响）而被降低；体内循环时间已通过阻止被巨噬细胞快速吸收而得到增加，已在血管内注射后的适宜时间点实现了排泄，且由于制备和纯化方法简单，易于控制高产量且低成本的大规模生产，由于相对较低的多分散性，在制备和效果上的重现性也较高，且由于该化合物整体通过共价键形成，能够保证含碘放射状大分子的结构完整性。因此，所述含碘放射状大分子适于制备CT造影介质。

说明书

技术领域

本申请涉及一种用作计算机断层扫描（CT）造影介质的活性成分的含 碘放射状大分子及其制备方法，及包含该放射状大分子的CT造影介质组 合物。

背景技术

计算机断层扫描（CT，Computed Tomography）是一种照相技术，在 该技术中，采用不同方向的X射线照射人体的目标区域，并将透射的X 射线用检测器收集，然后利用计算机通过数学技术重建针对该区域的X射 线吸收之间的差异。也就是说，其为一种成像技术，该技术利用计算机编 程通过重组多个用可围绕身体旋转360度的照相机在各个不同角度拍摄的 二维X射线照片产生三维图像。

因此，这种基于X射线的成像一般主要集中对骨骼生成图像。如果将 基于相对较高的原子序数，如钡或碘的造影介质注入活的动物或人的血管 后再进行CT成像，则由于光电效应，X射线并不能清楚地透射穿过这些 造影介质存在的区域，反而会被吸收，从而在产生的图像上呈现出与骨头 （显示为非常亮的白色）相类似的白色或浅灰色。通常情况下，X射线的 吸收度（α）与X射线的原子序数（N）和波长（λ）成正比，即，X射线 的吸收度（α）与X射线的能量成反比。

α=N⁵λ^7/2

带有磁共振成像（MRI，Magnetic Resonance Imaging）的CT提供了 解剖信息，而正电子发射断层扫描（PET，Positron Emission Tomography） 和单光子发射计算机化断层显像（SPECT，Single Photon Emission  Computed Tomography）的成像技术提供了针对生理/生化功能的信息。另 外，尽管与MRI相比，CT的分辨率较低，但由于CT扫描的扫描时间较 短、价格相对较低以及CT设备较易获得（大多数医院都拥有CT），CT在 临床上也是不可或缺的。即，由于总的CT扫描时间约为MRI扫描时间的 十分之一或更少，CT成像尤其对于患有重型脑损伤需要快速诊断的急诊 病人是极度不可或缺的。此外，CT扫描可减少病人在MRI扫描期间由于 噪声和较长的扫描时间带来的不适，CT设备较容易获得，且CT扫描的成 本约为MRI扫描成本的十分之一。

迄今为止，在临床上使用的含碘小分子CT造影介质大致分为两种类 型：离子型化合物和非离子型化合物。

由于非离子型化合物副作用的严重程度远小于离子型化合物副作用 的严重程度，目前多将非离子型CT造影介质用于患者。此外，传统的含 碘小分子非离子型CT造影介质化合物中的两个或三个苯环通过共价键连 接，以通过增加分子量延长体内循环时间。然而，由于体内循环时间（半 衰期）较短，为获得恰当水平的CT信号，高达80-90克的高剂量的这些 含碘小分子CT造影介质需要根据体重施用给成年人，。因此，一些病人偶 尔会发生不良反应，如过敏和休克，在有限的最坏的情况下，可能会威胁 生命。当必须通过施用高剂量的造影介质有效诊断心血管疾病如心脏区域 来获得足够的循环时间时，上述情况发生得更频繁。因此，为了克服这些 问题，迫切需要开发一种更安全的化合物，可通过施用相对低剂量的CT 造影介质在较长时间内产生非常好的对比度增强。此外，现有的含碘小分 子CT造影介质的其他缺陷可能包括低的LD₅₀值、高渗透压及高粘度等。

为了克服含碘小分子CT造影介质的这些缺陷，最近已报道了开发新 的含碘大分子CT造影介质。例如，已将（市售的）含碘小分子化合物或 其衍生物的多个单元共价连接到大分子支架（scaffold）或物理包封在大分 子组合体（assembly），例如脂质体、胶束及其他纳米粒子内。

将市售的含碘小分子CT造影介质或其衍生物包封在大分子脂质体内 的方法已在非专利文献1[J.Zheng et al,Mol.Pharmaceutics2009,6, 571-580],文献2[A.Sachse et al,Invest.Radiol.1997,32,44-50],文献3[E. Samei et al,Int.J.Nanomedicine2009,4,277-282]，及文献4[C.Y.Kao et al, Acad.Radiol.2003,10,475-483]中公开。

将市售的含碘小分子CT造影介质或其衍生物包封在大分子胶束内的 方法已在非专利文献5[V.S.Trubetskoy et al,J.Drug Target.1997,4, 381-388]和文献6[V.P.Torchilin et al,Acad.Radiol.1999,6,61-65]中公开。

将市售的含碘小分子CT造影介质或其衍生物包封在大分子纳米粒子 内的方法已在非专利文献7[F.Hyafil et al,Nat.Med.2007,13,636-641]中 公开。

在非专利文献7中，碘化化合物的羧酸端基以烷基封端，以增强化合 物的疏水性，这有利于碘化化合物内化到纳米粒子的内部。当这些含碘纳 米粒子被注射到血管中时，他们一般很容易被巨噬细胞吸收，并随时间在 相对大量的巨噬细胞存在的炎症、癌症和动脉粥样硬化的区域日益积累， 以便于通过CT成像诊断相关的疾病。同时，在非专利文献5中，胶束结 构由一端被包含小分子疏水性碘化化合物的几个单元的短肽取代的亲水 性的聚（乙二醇）（PEG）形成，以延长体内循环时间。然而，这些基于自 组装的脂质体和胶束的结构是不完整的，容易通过体内周围介质的改变而 被拆散，以释放全部或部分有毒的碘化小分子造影剂。

因此，已报道了能够通过自身增强对比度而不需要包封含碘小分子化 合物的基于金属纳米粒子的CT造影介质的开发。

专利文献1[PCT/KR2006/003452]公开了基于表面被PEG基团取代的 金（Au）纳米粒子的CT造影介质。

非专利文献8[I.C.,Sun et al,Chem.Eur.J.2009,15,13341-13347]公开 了基于覆盖肝素的金纳米粒子的CT造影介质。

非专利文献9[M.H.Oh et al,J.Am.Chem.Soc.2011,133,5508-5515] 公开了基于被PEG和荧光基团取代的均匀尺寸的氧化钽（Ta）纳米粒子的 CT造影介质。

对于基于金属纳米粒子的CT造影介质，金属（Au、Ta等）本身作为 成像剂（即，吸收X射线束），其涂布有生物相容性的PEG和肝素以分别 延长体内循环时间及通过在肝脏中的积累促进特定器官的成像。

然而，由于受限的排泄和长期的体内积累（即，超过几年到几十年的 半衰期），预期上述的大分子造影介质存在诸如高成本和毒性的问题。另 外，预期这些大分子在体内保持结构的完整性（例如，自组装的结构）及 实现在生产上的重现性以获得相同分子量分布的大分子混合物以产生同 样的效果方面存在困难。此外，预期由于缺乏针对毒性评估的标准化全球 协议，使这些通过临床试验的用于人类给药的基于大分子混合物的材料的 商业化存在更多的困难。

同时，包封有含碘小分子化合物基于脂质体的CT血管造影介质的例 子为Fenestra（ART，先进研究技术公司（Advanced Research Technologies  Inc）,加拿大）和eXIA160（Binitio技术公司（Binitio Technologies Inc）， 加拿大），这两个物质均被出售仅用于动物。事实上，研究人员使用显微-CT （micro-CT）在基础医药研究领域的研究存在更大的压力，这不仅是因为 这些允许5-10次注射进小鼠或大鼠的血管的一小瓶（2.5毫升）造影介质 的价格为约一百万韩元，而且难以将这些造影介质注射到小动物的尾静脉 中。另一方面，如果将用于人类的小分子造影介质改为注射进小动物，要 实现适当水平的对比度增强是不可能的，因为大多数的造影剂已经在注射 后准备期的第1至3分钟通过肾脏排放至膀胱，该过程包括将动物转移到 摄像床并设定参数，如在启动CT扫描前操作软件的扫描范围。因此，迫 切需要开发一种用于CT的血管造影介质，该造影介质廉价，且在不需要 高剂量的情况下，能够在体内循环相对较长时间后较好地被排泄，不仅可 用于需要高剂量的心血管疾病的诊断，也可用于使用小动物的显微-CT实 验。

为达到上述目的，与使用树形分子作为大分子支架（scaffold）的含碘 CT造影介质相关的论文和专利在1990年左右开始出现。即，如果使用单 分子树形分子作为大分子支架（参见见下文描述），在制备和效果方面的 重现性均可实现。此外，由于树形分子的尺寸远小于基于金属纳米粒子或 线性聚合物自组装的造影剂的尺寸，因此，预期造影剂在血管内循环一定 时间后较易排出。

树形分子为直径通常为10nm或更小的相对较小的树状（或放射状） 大分子，并且为通过逐步（即添加一层）迭代有机合成和纯化制备的具有 单一分子重量值的纯分子。不像大多数其他传统的大分子（多分散性的混 合物），树形分子在特定的环境（溶剂、pH、温度等）下具有可预测的尺 寸，因而有利于需要使用特定的流体动力学直径的大分子的应用。树形分 子的一些优点包括结构的完整性、通过有机合成改变组分官能团的无限可 能性及相应的物理化学性质、将各种功能单元（例如，小分子药物、靶向 剂、表面改性剂等）共价连接至树形分子的内部及表面的可行性、以及对 于生物应用非常重要的极低的酶促降解率。

使用树形分子用于生物医学应用的例子包括，通过在聚阳离子树形分 子和阴离子型基因之间形成电荷复合物的基因转染；药物递送，其中药物 被包封在树形分子的内部空隙或共价连接至树形分子，因而它们能够在病 变的位点通过特定的刺激（pH、光、酶等）释放；通过改变载体树形分子 的结构实现药物的靶向递送或控释；可显著增强通过多效价效应 （multivalent effects）在细胞外膜的碳水化合物配位体和外源凝集素之间 的结合亲和力；通过在树形分子支架取代小分子显像剂的多个副本针对显 像剂的信号放大的医疗诊断；利用生物相容性和可生物降解的树形分子的 组织工程学。

自从20世纪70年代末Denkewalter发现了第一个树形分子，即聚赖 氨酸树形分子，针对树形分子领域的研究重点已从新的树形分子的分子设 计及其合成方法转向对不同类型的树形分子的物理化学性质及利用其特 殊性质（例如，自组装、仿生系统等）的一些基本应用的研究，并且最近 转向对用于材料科学和生物医学的树形分子的高级应用。Denkewalter合成 的聚赖氨酸树形分子的结构的例子的如下所示（专利文献2[US4,410, 688]）。

此外，Donald A.Tomalia博士在20世纪80年代在陶氏化学公司（Dow  Chemical company）工作期间开发了聚（酰胺）胺（PAMAM）树形分子。 PAMAM树形分子的内部由脂肪族氨基和酰胺基组成，其表面基团可为胺、 羧酸酯、羟基等。例如，以乙二胺作为核心单元、氨基作为表面基团的第一、 第二、第三和第四代（G1、G2、G3和G4）PAMAM树形分子的结构如下 所示。

对于体内应用，PAMAM树形分子在几种市售的树形分子中广受欢迎， 并已被广泛地用于各种生物医学应用。虽然通过逐步有机合成和纯化制备 的树形分子在本质上为具有单一分子量值的单分子，但这些市售的 PAMAM树形分子（由Dendritech公司生产，Sigma-Aldrich公司出售）包 含结构缺陷，且为异质（多分散性指数（PDI），ca.1.01-1.1）并具有不需 要的副产物，这是因为这些市售的PAMAM树形分子通过发散法合成，其 中加入过量的试剂进行反应，且进行粗糙的纯化用于大规模生产。因此， 对具有单一分子量的单分子水平的PAMAM树形分子或其衍生物的结构 分析是不可能的。然而，在设计并合成具有单一分子量值的最佳生物相容 性树形分子之前，使用PAMAM树形分子以便快速检查将树形分子用于特 定生物应用的可能性是合理的。迄今为止，已报道的基于树形分子的含碘 CT造影介质的例子并不多。这可能是因为与小分子含碘造影剂相比，基 于树形分子的含碘CT造影介质的复杂的制备方法涉及许多合成步骤，相 对较高的毒性，较小程度地延长了对比度增强的持续时间，及相对较差的 图像质量（即，对比度增强）（非专利文献10[W.Krause et al,Top.Curr. Chem.2000,210,261-308]，专利文献3[PCT/EP94/04245]，专利文献4 [PCT/EP96/02450]，专利文献5[PCT/FR92/01135]，专利文献6 [PCT/EP94/648203]，专利文献7[PCT/EP95/730573]，专利文献8 [PCT/EP95/78263]，非专利文献11[A.T.Yordanov et al,Nano Lett.2002,2, 595-599]和非专利文献12[Y.Fu et al,Bioconjugate Chem.2006,17, 1043-1056]）。

同时，已经对基于树形分子的MRI造影介质进行了较大量的研究，例 如，开发了当前在医院用于给患者给药的代表性的用于MRI的小分子血管 造影介质钆喷酸葡胺（Gd-DTPA，商品名：马根维显（Magnevist））的拜 耳先灵医药公司（Bayer Schering Pharma AG）已开发出用于MRI的基于 树形分子的血管造影介质（EP430863，WO97/02051，WO98/24775，WO 98/24774及US5911971），且针对“Gadomer-17”（或称为“Gd-DTPA-17” 或“SH L643A”;K.Nael,et al.,J.Magn.Reson.Imaging2007,25,66-72;B. Misselwitz,et al.,Magn.Reson.Mater.Phys.Biol.Med.2001,12,128-134） 的临床试验正在进行。

因此，当前需要开发一种包含具有优良的对比度增强的含碘放射状大 分子的CT造影介质，该造影介质能够克服临床上使用的含碘小分子CT 造影剂目前存在的缺陷。理想情况下，该CT造影介质应通过相对简单的 合成方法制备，且价格低廉，具有足以用于心血管疾病诊断的延长的血管 内循环时间，且大部分可在给药后适当的时间点通过安全途径被排泄。

因此，虽然还在对能够克服上述缺陷的CT造影介质进行研究，但本 发明人证实，与现有的含碘小分子造影介质化合物相比，通过使用以由生 物相容性聚合物制备的保护层（该保护层围绕在核或内部区域中被取代的 含碘化合物的周围）为特征的含碘放射状大分子，对比度增强的持续时间 已被显著提高；体内毒性已通过形成具有相对较长的生物相容性聚合物链 的保护层（该保护层能够阻止在核区域的表面附近被取代的毒性含碘化合 物暴露于外部环境而产生潜在的副作用）而被降低；体内循环时间已通过 阻止被巨噬细胞快速吸收而得到增加，已在血管内注射后的适宜时间点实 现了排泄，且由于制备和纯化方法简单，易于控制高产量且低成本的大规 模生产，由于相对较低的多分散性，在制备和效果上的重现性也较高，且 由于该化合物整体通过共价键形成，能够保证含碘放射状大分子的结构完 整性，从而完成本发明。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种含碘放射状大分子。

本发明的另一目在于提供一种制备所述含碘放射状大分子的方法。

本发明的又一目在于提供一种包含所述含碘放射状大分子的计算机断 层扫描（CT）造影介质组合物。

为实现上述目的，本发明提供一种含碘放射状大分子，包括：由圆形或 球形对称的小分子化合物或由放射状大分子组成的核；直接或通过肽结合至 核的含碘化合物；以及直接或通过肽与核结合，或直接与结合至核的含碘化 合物结合的生物相容性聚合物；其中，含碘放射状大分子具有使生物相容性 聚合物形成保护层以防止核和含碘化合物在体内暴露的结构。

本发明还提供一种制备所述含碘放射状大分子的方法，包括：将生物相 容性聚合物结合至由圆形或球形对称的小分子化合物或由放射状大分子组 成的核的部分表面官能团（步骤1）；以及将含碘化合物直接或通过肽结合至 步骤1中核的未发生反应的表面官能团（步骤2）。

此外，本发明提供一种制备所述含碘放射状大分子的方法，包括：将含 碘化合物结合至由圆形或球形对称的小分子化合物或由放射状大分子组成 的核的部分表面官能团（步骤1）；以及将生物相容性聚合物结合至与步骤1 中的核连接的含碘化合物（步骤2）。

本发明还提供一种制备含碘放射状大分子的方法，包括：将含碘化合物 通过肽结合至生物相容性聚合物（步骤1）；以及将步骤1中通过肽结合至生 物相容性聚合物的含碘化合物结合至由圆形或球形对称的小分子化合物或 由放射状大分子组成的核的表面官能团（步骤2）。

此外，本发明提供一种包含含碘放射状大分子作为活性成分的CT造影 介质组合物。

针对本发明的含碘放射状大分子，其对比度增强的持续时间与现有的含 碘小分子造影介质化合物相比已被显著提高；体内毒性已通过形成具有相 对较长的生物相容性聚合物链的保护层（该保护层能够阻止在核区域的表 面附近被取代的毒性含碘化合物暴露于外部环境而产生潜在的不利影响） 而被降低；体内循环时间已通过阻止被巨噬细胞快速吸收而得到增加，已 在血管内注射后的适宜时间点实现了排泄，且由于制备和纯化方法简单， 易于控制高产量且低成本的大规模生产，由于相对较低的多分散性，在制 备和效果上的重现性也较高，且由于该化合物整体通过共价键形成，能够 保证含碘放射状大分子的结构完整性。因此，含碘放射状大分子适于制备 CT造影介质。

附图说明

图1示出了使用本发明实施方案（a：实例1；b：实例2；c：实例3； d：实例4）的化合物测定的细胞毒性的曲线图；

图2示出了包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质的二维X射 线快照图像；

图3示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT（micro-CT）在注射后选定的时间点0、1、2和4小时得到 的小鼠的全身冠状面CT图像；

图4示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT在注射后选定的时间点8、24和48小时得到的小鼠的全身冠 状面CT图像；

图5示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT在注射后选定的时间点0、1、2和4小时得到的小鼠的全身 矢状面CT图像；

图6示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT在注射后选定的时间点8、24和48小时得到的小鼠的全身矢 状面CT图像；

图7示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT得到的针对小鼠的胸部和腹部区域的扩大冠状面CT图像， 以比较腔静脉和肝的信号强度（即，对比度增强）；

图8示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT得到的针对小鼠的胸部和腹部区域的扩大冠状面CT图像， 以比较心脏的信号强度（即，对比度增强）；

图9示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药时， 使用显微CT得到的针对小鼠的脑部区域的扩大冠状面CT图像；

图10示出了采用包含本发明实施方案的化合物的CT造影介质给药 时，使用显微CT得到的针对小鼠的脑部区域的扩大矢状面CT图像。

具体实施方式

以下将对本发明进行详细说明。

本发明提供一种含碘放射状大分子，包括：

由圆形或球形对称的小分子化合物或由放射状大分子组成的核；

直接或通过肽结合至核的含碘化合物；以及

直接或通过肽与核结合，或直接与结合至核的含碘化合物结合的生物相 容性聚合物；

其中，含碘放射状大分子具有使生物相容性聚合物形成保护层以防止核 和含碘化合物在体内暴露的结构。

在本发明的含碘放射状大分子中，选自由α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊 精、葡萄糖、半乳糖、甘露糖及其衍生物，卟啉及其衍生物，1,4,7,10-四氮 杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）及其衍生物，通过连接选自由赖氨酸、 天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸组成的组中的2-4个肽形成 的环状肽及其衍生物组成的组中的任一碳水化合物均可作为组成核的圆形 或球形对称的小分子化合物。

选自由聚（酰胺）胺（PAMAM）树形分子、聚赖氨酸树形分子、聚（丙 烯亚胺）（PPI）树形分子、聚酯树形分子、聚谷氨酸树形分子、聚天冬氨酸 树形分子、聚甘油树形分子及聚三聚氰胺树形分子组成的组中的任一树形分 子，选自由聚赖氨酸、聚酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸及聚甘油组成的组中的 任一超支化聚合物，以及选自由聚乙二醇（PEG）及其共聚物衍生物，及这 些化合物的衍生物组成的组中的任一星形聚合物均可作为组成核的放射状 大分子。

在本发明的含碘放射状大分子中，以下化学式2、3、4和10所示的化 合物，可作为优选的含碘化合物的例子。

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[化学式10]

关于化学式2至4或化学式10，

R¹、R²和R³各自独立或选择性地为-NH₂、-NHR⁴、-NR⁴₂、-NHNH₂、 -NHNHR⁴、-NHNR⁴₂、-OH、-OR⁴、-SH、或-SR⁴；

R⁴为-H、-叔丁氧羰基（-Boc）、未被取代或取代的直链或支链C_1-6烷基 或杂烷基、或未被取代或取代的C_5-7芳基或杂芳基；以及

R⁵与R⁴或–(C=O)R⁴、-(C=O)OR⁴、-(C=O)NHR⁴或-(C=O)NR⁴₂相同。

在本文中，化学式2、3和4的含碘化合物可通过使用以下化学式1或9 所示的含碘化合物作为前体制备得到。

[化学式1]

[化学式9]

在本发明的含碘放射状大分子中，PEG、透明质酸、肝素及其衍生物可 作为生物相容性聚合物。

在本发明的含碘放射状大分子中，肽由2-4个氨基酸重复单元组成，并 可选自由二赖氨酸、三赖氨酸、四赖氨酸、二谷氨酸、三谷氨酸、四谷氨酸、 二天冬氨酸、三天冬氨酸、四天冬氨酸、二半胱氨酸、三半胱氨酸、四半胱 氨酸、二丝氨酸、三丝氨酸及四丝氨酸组成的组。

在本发明的含碘放射状大分子中，在核、含碘化合物、肽或生物相容性 聚合物彼此共价连接的情况下，连接基团可为：-NHC(=O)-、-C(=O)O-、 -NHC(=O)NH-、-NHC(=O)O-、-NHC(=S)NH-、-C=N-NH-、-C=N-NHC(=O)-、 -NH-、-S-、-SS-、-NHCH₂CH(OH)-、-O-或

此外，连接基团的两端可通过独立或选择性地选自由–(CH₂)_m-、 -(CH₂)_m(C=O)-、C_3-20环烷基-(CH₂)_m-、C_4-20芳基-(CH₂)_m-及-NH-CH₂CH₂-组 成的组中的任一基团各自另外与核、含碘化合物、肽或生物相容性聚合物结 合，其中，m为0和10之间的整数。

在本发明的含碘放射状大分子中，核具有选自由氨基、羟基、羟氨基， 羧基、羧基酰肼（carboxyhydrazide）、肼、巯基、叠氮基、炔基、卤素、醛、 酮、环氧基、3-甲酯基吡咯烷酮（3-carbomethoxypyrrolidinone）及三-(C_1-4烷氧基）-甲硅烷基组成的组中的一个或多个表面官能团，该表面官能团可 共价连接至含碘化合物、肽或生物相容性聚合物。

本发明的含碘放射状大分子的优选平均分子量在8,000-150,000Da（道 尔顿）的范围内。如果平均分子量低于8000Da，可能达不到较长时间的血 管内循环，且含碘放射状大分子可类似于小分子化合物通过肾相对较快地排 出。如果平均分子量高于150,000Da，可能会出现诸如由于高粘度难以进行 血管内注射、高风险的副作用（休克、过敏等）、由于高毒性引起的肝内不 断积累及难以排出（相对较长的半衰期）等问题。

根据对由分别作为实例1至4中核的G1、G2、G3和G4PAMAM树形 分子制备的大分子1c、2c、3c和4c的¹H核磁共振（NMR）谱和碘含量（由 电感藕合等离子体质谱（ICP-MS）确定）的积分值的分析，本发明的含碘 放射状大分子的理论平均分子量分别约为10,000Da、18,000Da、40,000Da 和86,000Da。因此，考虑到最终得到的化合物含多分散性PAMAM树形分 子和PEG链，选择优选的平均分子量为8,000-150,000Da是合理的。

作为参考，对于在实例中具有最低分子量的实例1的化合物1c，在注射 造影介质后相对较短的时期内（参见1小时后拍摄的图像）在肾内发现相当 量的化合物1c，如图3所示。对于具有最高分子量的实例4的化合物4c， 在注射期间其造影介质溶液比实例2的化合物2c或实例3的化合物3c更粘 稠，将化合物4c在缓冲溶液中溶解比将化合物1c、2c或3c在缓冲溶液中溶 解更加困难，需要较更长时间的超声处理，同时产生了相对较多的热。因此， 认为采用与本发明方法相似的方法制备分子量高于化合物4c的分子量的化 合物作为CT造影介质是不恰当的。

事实上，制备了基于G5PAMAM树形分子的造影介质，并完成了其合 成与表征。然而，不可能使用该化合物用于实际的血管内注射实验，因为难 以将该化合物溶解于缓冲溶液中形成适于CT成像的浓度。此外，由于该化 合物具有相对较高的多分散性指数（PDI）的异质性，认为该化合物的用处 不大。

以下化学式5至8所示的化合物可作为本发明的含碘放射状大分子的优 选例子。

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

关于化学式5至8，

核为以下物质：选自由α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、葡萄糖、半乳 糖、甘露糖及其衍生物，卟啉及其衍生物，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10- 四乙酸（DOTA）及其衍生物，通过连接选自由赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸及其衍生物组成的组中的2-4个肽形成的环状肽 及其衍生物组成的组中的任一碳水化合物；选自由聚（酰胺）胺（PAMAM） 树形分子、聚赖氨酸树形分子、聚（丙烯亚胺）（PPI）树形分子、聚酯树形 分子、聚谷氨酸树形分子、聚天冬氨酸树形分子、聚甘油树形分子及聚三聚 氰胺树形分子组成的组中的任一树形分子；选自由聚赖氨酸、聚酯、聚谷氨 酸、聚天冬氨酸及聚甘油组成的组中的任一超支化聚合物；选自由聚乙二醇 （PEG）及其共聚物衍生物，及这些化合物的衍生物组成的组中的任一星形 聚合物。

T¹和T²为含碘化合物，其中T¹为或 T²为或其中，R¹和R³各自独立或选择性地 为-NH-、-NR⁴-、-NNH₂-、-NNHR⁴-、-NNR⁴₂-、-O-、或-S-；R²为-NH₂、-NHR⁴、 -NR⁴₂、-NHNH₂、-NHNHR⁴、-NHNR⁴₂、-OH、-OR⁴、-SH或-SR⁴；R⁴为-H， -叔丁氧羰基、直链或支链C_1-6烷基、或者未被取代或取代的C_5-7芳基或杂芳 基；且R⁵与R⁴或-(C=O)R⁴、-(C=O)OR⁴、-(C=O)NHR⁴或-(C=O)NR⁴₂相同。

D为由2-4个氨基酸重复单元组成的肽，并可选自由二赖氨酸、三赖氨 酸、四赖氨酸、二谷氨酸、三谷氨酸、四谷氨酸、二天冬氨酸、三天冬氨酸、 四天冬氨酸、二半胱氨酸、三半胱氨酸、四半胱氨酸、二丝氨酸、三丝氨酸 及四丝氨酸组成的组。

P为PEG、透明质酸、肝素及其衍生物。

X为核的表面官能团，且可为氨基、羟基、羟氨基、羧基、羧基酰肼、 肼、巯基、叠氮基、炔基、卤素、醛、酮、环氧基、3-甲酯基吡咯烷酮及三 -(C_1-4烷氧基）-甲硅烷基；

L¹和L²为核、含碘化合物（T¹或T²）、肽（D）或生物相容性聚合物（P） 之间的连接基团，且可为-NHC(=O)-、-C(=O)O-、-NHC(=O)NH-、 -NHC(=O)O-、-NHC(=S)NH-、-C=N-NH-、-C=N-NHC(=O)-、-NH-、-S-、-SS-、 -NHCH₂CH(OH)-、-O-或连接基团的两端可通过独立或选择性地选 自由–(CH₂)_m-、-(CH₂)_m(C=O)-、C_3-20环烷基-(CH₂)_m-、C_4-20芳基-(CH₂)_m-及 -NH-CH₂CH₂-组成的组中的任一基团各自另外与核、含碘化合物、肽或生物 相容性聚合物结合，其中，m为0和10之间的整数。

a和b各自独立或选择性地为0或1的整数；

c为2和4之间的整数；

d、e、f、g、h和i各自独立或选择性地为2和60之间的整数；及

j为1和10之间的整数。

本文中，关于化学式7和8，在生物相容性聚合物为PEG的情况下，优 选使用C_1-4烷氧基作为PEG的端基，其中该端基朝向核外侧。

为了具体描述作为本发明的含碘放射状大分子的优选实例的化学式5至 8所示的化合物，以下示出了化学式5至8所示的化合物的示意图。

在上述示意图中，

A为化学式5的化合物，其中，含碘化合物（红色小圆圈）和生物相容 性聚合物（绿色长波浪线）独立地与核（灰色大圆圈）结合；

B为化学式6的化合物，其中，生物相容性聚合物与结合至核的含碘化 合物结合；

C为化学式7的化合物，其中，生物相容性聚合物和取代含碘化合物中 2-4个单元的肽（蓝色短波浪线）独立地与核结合；及

D为化学式8的化合物，其中，生物相容性聚合物与结合至核且取代含 碘化合物中的2-4个单元的肽结合。

针对本发明的含碘放射状大分子，其对比度增强的持续时间与现有的含 碘小分子造影介质化合物相比已被显著提高；体内毒性已通过形成具有相 对较长的生物相容性聚合物链的保护层（该保护层能够阻止在核区域的表 面附近被取代的毒性含碘化合物暴露于外部环境而产生潜在的不利影响） 而被减少；体内循环时间已通过阻止被巨噬细胞快速吸收而得到增加，已 在血管内注射后的适宜时间点实现了排泄，且由于制备和纯化方法简单， 易于控制高产量且低成本的大规模生产，由于相对较低的多分散性，在制 备和效果上的重现性也较高，且由于该化合物整体通过共价键形成，能够 保证含碘放射状大分子的结构完整性。因此，含碘放射状大分子适于制备 CT造影介质。

另外，本发明还提供一种制备上述含碘放射状大分子的方法，包括：

将生物相容性聚合物结合至由圆形或球形对称的小分子化合物或由放 射状大分子组成的核的部分表面官能团（步骤1）；及

将含碘化合物直接或通过肽结合至步骤1中核的未发生反应的表面官能 团（步骤2）。

本发明进一步提供一种制备上述含碘放射状大分子的方法，包括：

将含碘化合物结合至由圆形或球形对称的小分子化合物或由放射状大 分子组成的核的部分表面官能团（步骤1）；及

将生物相容性聚合物结合至与步骤1中的核连接的含碘化合物（步骤 2）。

本发明还提供一种制备上述含碘放射状大分子的方法，包括：

将含碘化合物通过肽结合至生物相容性聚合物（步骤1）；及

将步骤1中通过肽结合至生物相容性聚合物的含碘化合物结合至由圆形 或球形对称的小分子化合物或由放射状大分子组成的核的表面官能团（步骤 2）。

在本发明的含碘放射状大分子的制备方法中，圆形或球形对称的小分子 化合物、放射状大分子、表面官能团、含碘化合物、肽及生物相容性聚合物 的例子与上文描述的相同。

在本发明的实施例的制备方法中，采用生物相容性聚合物对约15-50% 的核表面官能团进行衍生化，然后将过量的含碘化合物进行处理，以与核的 剩余官能团反应。因此，放射状大分子中的碘含量可控制在约15-50%的范 围内。

另外，本发明还提供一种包含含碘放射状大分子作为活性成分的CT造 影介质组合物。

本发明中，含碘放射状大分子的优选的碘含量为15-50%。如果含碘放 射状大分子的碘含量低于15%，由于必须给药过量的造影介质才能达到适当 水平的对比度增强，因此在血管内注射过程中诱发副作用的概率较高。如果 含碘放射状大分子的碘含量高于50%，造影介质由于高毒性可能不适于在体 内应用。

下文中提供了本发明的优选实施方案的实例及实验例，以帮助理解本发 明。然而，以下实例及实验例仅用于说明的目的，其不应以任何方式限制本 发明的范围。

【制备实例1】环化中性邻苯二甲酰亚胺衍生物（8）的制备

将三乙胺（0.50mL，3.59mmol）加入化合物6（4,5,6,7-四碘代苯并呋 喃-1,3-二酮（TIPN），2.40g，3.68mmol）和化合物7（N-叔丁氧羰基-乙二 胺（N-tert-Boc-ethylenediamine），200mg，1.22mmol）的二甲亚砜（DMSO） （5mL）溶液中。在40℃下加热反应，并在干燥的氩气气氛中搅拌16小时。 将反应混合物在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中通过尺寸排阻色谱（SEC， Size-Exclusion Chromatography）柱（型号：Bio-Beads S-X1，H36cm×O.D. 4.5cm，制造商：Bio-Rad公司）以去除DMSO，并在减压下进行浓缩，将 粗产物在硅胶上（10:1的二氯甲烷（CH₂Cl₂）/丙酮）进行色谱分离，得到 60.1mg呈黄色粉末的化合物8（75.7μmol，6%）。

R_f：0.63[硅胶，10:1CH₂Cl₂/丙酮]；

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ6.89(t,1H,J=6.4Hz,H₃)，3.60(t,2H, J=5.6Hz,H₁)，3.14(q,2H,J=5.8Hz,H₂),1.29(s,9H,H₄)；

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ164.1,155.7,135.4,134.4,104.0,77.7, 38.9,37.5,28.1；

HRMS(ESI)C₁₅H₁₄N₂O₄I₄Na(M+Na)⁺计算值:816.7030,实测值： 816.7028。

【制备实例2】环化中性邻苯二甲酰亚胺衍生物（10）的制备

将三乙胺（0.82mL，5.88mmol）加入化合物6（TIPN，3.84g，5.89mmol） 和化合物9（乙醇胺，300mg，4.91mmol）的DMSO（8mL）溶液中。在 50℃下加热反应，并在干燥的氩气气氛中搅拌19小时。将反应混合物在DMF 中通过SEC柱（型号：Bio-Beads S-X1，H36cm×O.D.4.5cm，制造商： Bio-Rad公司）以去除DMSO，在减压下进行浓缩，将粗产物在硅胶（10:1 的CH₂Cl₂/丙酮）进行色谱分离，得到1.11g呈黄色粉末的化合物10（1.6 mmol，33%）。

R_f：0.37[硅胶，10:1CH₂Cl₂/丙酮]；

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ3,62(t,2H,J=5,8Hz,H₁)，3.55(q,2H, J=5.8Hz,H₂)；

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ164.2,135.5,134.4,104.0,57.5,41.3。

【实例1】G1PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（1c）的制备

步骤1：G1PAMAM-mPEG₂₀₀₀共轭物（1b）的制备

将购自西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich）公司的商业化G1PAMAM树 形分子（化合物1a）在真空中干燥以去除甲醇。向溶于DMSO（100mL）的 化合物1a（1.31g，0.916mmol）的搅拌溶液中一次性地加入mPEG碳酸化 合物5（4.95g，2.27mmol）。室温下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅 拌2天，然后通过搅拌采用甲醇（×2，每次6小时）进行透析（型号：Spectra/Por 再生纤维素（RC，Regenerated Cellulose）膜，截留分子量（MWCO）1000， 制造商：Spectrum Laboratories公司）。在减压下去除溶剂后，利用制备性SEC （型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm，制造商：Bio-Rad公司） 在DMF中对粗产物进行纯化，并在真空中干燥，得到5.65克化合物1b。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.12-7.87(m,NH_G0及NH_G1),7.22(br s, 2.94H,主异构体NH_PEG),6.80(br s,0.34H,次异构体NHPEG),4.04(t,6.17H,J =4.7Hz,H_h),3.62-3.39(m,667.57H,H_i,H_j及H_k),3.24(s,H_l),3.10-2.99(m, 33.53H,H_d,H_f,H_fPEG及H_gPEG),2.66-2.58(m,33.08H,H_b及H_g),2.43(m,11.86H, H_e及H_a),2.19(m,24.00H,H_c)；

MS(MALDI-TOF,DHB基质)M_n7698.11,M_w7747.40,PDI1.01；

MS(MALDI-TOF,THAP基质)M_n7757.35,M_w7795.41,PDI1.00。

步骤2：G1PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（1c）的制备

向步骤1中得到的化合物1b（5.65g）和化合物6（TIPN，5.90g，9.05 mmol）的DMSO（100mL）溶液中加入N，N-二异丙基乙胺（DIEA，2.40mL， 13.8mmol）。室温下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天。接着， 将TIPN（3.00g，4.60mmol）另外一次性地加入到混合物中，并在室温下 搅拌另外24小时继续进行反应。将反应混合物通过搅拌采用甲醇（×2，每 次6小时）进行透析（型号：Spectra/Por RC膜，MWCO1000，制造商：Spectrum  Laboratories公司）。在减压去除溶剂后，利用制备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm，制造商：Bio-Rad公司）在DMF中对粗产物 进行纯化。利用SEC柱（Sephadex LH-20,H40cm×O.D.3.0cm）对合并的 残余物进行过滤以去除残余的DMF。随后，将产物在乙醇（80mL）中溶解， 并通过针头式过滤器（型号：Puradisc25针头式过滤器，孔径为0.45μm，聚 四氟乙烯（PTFE），制造商：沃特曼（Whatman）公司）对上述得到的乙醇 溶液进行无菌过滤。将过滤产物在真空中深度干燥3天，得到3.89g化合物 1c。

碘含量（电感耦合等离子体质谱仪，ICP-MS）：20.7%。

【实例2】G2PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（2c）的制备

步骤1：G2PAMAM-mPEG₂₀₀₀共轭物（2b）的制备

将购自Sigma-Aldrich公司的商业化G2PAMAM树形分子（化合物2a） 在真空中干燥以去除甲醇。向溶于DMSO（90mL）的化合物2a（1.32g，0.405 mmol）的搅拌溶液中一次性地加入mPEG碳酸化合物5（3.94g，1.81mmol）。 室温下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天，然后通过搅拌采用甲 醇（×2，每次6小时）进行透析（型号：Spectra/Por RC膜，MWCO3500， 制造商：Spectrum Laboratories公司）。在减压下去除溶剂后，利用制备性SEC （型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm，制造商：Bio-Rad公司） 在DMF中对粗产物进行纯化，并在真空中干燥，得到5.20g化合物2b。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.03-7.83(m,NH_G0,NH_G1和NH_G2),7.21 (br s,4.50H,主异构体NH_PEG),6.80(br s,0.60H,次异构体NH_PEG),4.04(t, 8.61H,J=4.6Hz,H_h),3.62-3.39(m,925.04H,H_i,H_j及H_k),3.24(s,H_l), 3.10-3.00(m,70.07H,H_d,H_f,H_fPEG及H_gPEG),2.65(m,52.49H,H_b),2.57(m, 19.21H,H_g),2.43(m,27.58H,H_e及H_a),2.20(m,56.00H,H_c);

MS(MALDI-TOF,THAP基质)M_n11742.14,M_w11785.30,PDI1.00。

步骤2：G2PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（2c）的制备

将步骤1中得到的化合物2b（5.20g）和化合物6（TIPN，1.89g，2.90 mmol）的DMSO（94mL）溶液中加入DIEA（0.80mL，4.6mmol）。室温 下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天。接着，将TIPN（990mg， 1.52mmol）另外一次性地加入到混合物中，并在室温下搅拌另外24小时继 续进行反应。将反应混合物通过搅拌采用甲醇透析（型号：Spectra/Por RC 膜，MWCO8000，制造商：Spectrum Laboratories公司）6小时。在减压去 除溶剂后，利用制备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm， 制造商：Bio-Rad公司）在DMF中对粗产物进行纯化。利用SEC柱（Sephadex  LH-20,H40cm×O.D.3.0cm）对合并的残余物进行过滤以去除残余的 DMF。随后，将产物在乙醇（80mL）中溶解，并通过针头式过滤器（型号： Puradisc25针头式过滤器，孔径为0.45μm，PTFE，制造商：Whatman公司） 对上述得到的乙醇溶液进行无菌过滤。将过滤产物在真空中深度干燥3天， 得到3.04g化合物2c。

碘含量（ICP-MS）：23.0%。

【实例3】G3PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（3c）的制备

步骤1：G3PAMAM-mPEG₂₀₀₀共轭物（3b）的制备

将购自Sigma-Aldrich公司的商业化G3PAMAM树形分子（化合物3a） 在真空中干燥以去除甲醇。向溶于DMSO（112mL）的化合物3a（1.16g， 0.168mmol）的搅拌溶液中一次性地加入mPEG碳酸化合物5（3.27g，1.50 mmol）。室温下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天，然后通过搅 拌采用甲醇（×2，每次6小时）进行透析（型号：Spectra/Por RC膜，MWCO 1000，制造商：Spectrum Laboratories公司）。在减压下去除溶剂后，利用制 备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm，制造商：Bio-Rad 公司）在DMF中对粗产物进行纯化，并在真空中干燥，得到3.29g化合物 3b。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.13-7.83(m,NH_G0,NH_G1,NH_G2和 NH_G3),7.22(br s,8.98H,主异构体NH_PEG),6.80(br s,1.16H,次异构体 NH_PEG),4.04(t,17.51H,J=4.5Hz,H_h),3.62-3.39(m,1846.66H,H_i,H_j及H_k), 3.24(s,H_l),3.10-2.99(m,149.85H,H_d,H_f,H_fPEG及H_gPEG),2.66-2.59(m, 146.61H,H_b及H_g),2.43(m,56.55H,H_e及H_a),2.20(m,120.00H,H_c);

MS(MALDI-TOF,DHB基质)M_n21045.06,M_w22307.71,PDI1.06。

步骤2：G3PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（3c）的制备

将步骤1中得到的化合物3b（3.24g）和化合物6（TIPN，3.86g，5.92 mmol）的DMSO（100mL）溶液中加入DIEA（1.50mL，8.61mmol）。室温 下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天。接着，将TIPN（1.93g， 2.96mmol）另外一次性地加入到混合物中，并在室温下搅拌另外24小时继 续进行反应。将反应混合物通过搅拌采用甲醇透析（型号：Spectra/Por RC 膜，MWCO1000，制造商：Spectrum Laboratories公司）6小时。在减压去 除溶剂后，利用制备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm， 制造商：Bio-Rad公司）在DMF中对粗产物进行纯化。利用SEC柱（Sephadex  LH-20,H40cm×O.D.3.0cm）对合并的残余物进行过滤以去除残余的 DMF。随后，将产物在乙醇（80mL）中溶解，并通过针头式过滤器（型号： Puradisc25针头式过滤器，孔径为0.45μm，PTFE，制造商：Whatman公司） 对上述得到的乙醇溶液进行无菌过滤。将过滤产物在真空中深度干燥3天， 得到3.32g化合物3c。

碘含量（ICP-MS）：26.5%。

【实例4】G4PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（4c）的制备

步骤1：G4PAMAM-mPEG₂₀₀₀共轭物（4b）的制备

将购自Sigma-Aldrich公司的商业化G4PAMAM树形分子（化合物4a） 在真空中干燥以去除甲醇。向溶于DMSO（27mL）的化合物4a（579mg， 0.0407mmol）的搅拌溶液中一次性地加入mPEG碳酸化合物5（1.94g，0.890 mmol）。室温下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天，然后通过搅 拌采用甲醇（×2，每次6小时）进行透析（型号：Spectra/Por RC膜，MWCO 1000，制造商：Spectrum Laboratories公司）。在减压下去除溶剂后，利用制 备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm，制造商：Bio-Rad 公司）在DMF中对粗产物进行纯化，并在真空中干燥，得到1.67g化合物 4b。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.04-7.81(m,NH_G0,NH_G1,NH_G2, NH_G3及NH_G4),7.22(br s,20.62H,主异构体NH_PEG),6.81(br s,2.90H,次异构 体NH_PEG),4.03(t,39.80H,J=4.5Hz,H_h),3.62-3.39(m,4330.96H,H_i,H_j及H_k), 3.24(s,H_l),3.11-2.99(m,310.94H,H_d,H_f,H_fPEG及H_gPEG),2.68-2.61(m, 299.21H,H_b及H_g),2.43(m,104.94H,H_e及H_a),2.20(m,248.00H,H_c)；

MS(MALDI-TOF,DHB基质)M_n44435.05,M_w46195.16,PDI1.04.

步骤2：G4PAMAM-mPEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（4c）的制备

将步骤1中得到的化合物4b（1.63g）和化合物6（TIPN，1.35g，2.07 mmol）的DMSO（32mL）溶液中加入DIEA（0.54mL，3.10mmol）。室温 下，将反应混合物在干燥的氩气气氛中搅拌2天。接着，将TIPN（677mg， 1.04mmol）另外一次性地加入到混合物中，并在室温下搅拌另外24小时继 续进行反应。将反应混合物通过搅拌采用甲醇透析（型号：Spectra/Por RC 膜，MWCO1000，制造商：Spectrum Laboratories公司）6小时。在减压去 除溶剂后，利用制备性SEC（型号：Bio-Beads S-X1，H40cm×O.D.4.5cm， 制造商：Bio-Rad公司）在DMF中对粗产物进行纯化。利用SEC柱（Sephadex  LH-20,H40cm×O.D.3.0cm）对合并的残余物进行过滤以去除残余的 DMF。随后，将产物在乙醇（80mL）中溶解，并通过针头式过滤器（型号： Puradisc25针头式过滤器，孔径为0.45μm，PTFE，制造商：Whatman公司） 对上述得到的乙醇溶液进行无菌过滤。将过滤产物在真空中深度干燥3天， 得到1.27g化合物4c。

碘含量（ICP-MS）：25.2%。

【实验例1】细胞毒性试验

从美国模式培养物保藏所（ATCC（American Type Culture Collection）， 马纳萨斯，弗吉尼亚州）获得人上皮宫颈癌（HeLa）细胞株，在37℃、5% 二氧化碳（CO₂）气氛中，将获得的上皮宫颈癌（HeLa）细胞株保存在含10% 牛胎儿血清（FBS）、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的达尔伯克（氏） 改良伊格尔培养基（DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium），Gibco公 司）中。将各个真空干燥后的固体样品10mg溶解于1.0mL去离子水 （Milli-Q，Millipore公司）中以制备10mg/mL的PAMAM-PEG₂₀₀₀-TIPAA 共轭化合物1c-4c原液。将各个原液简单地进行超声处理以确保均匀性。使 用无血清DMEM进行一系列稀释以制备以下浓度的样品：1、5、10、50、 100和500μg/mL。将HeLa细胞株接种于密度为1×10³细胞/孔的平底96孔 板（Corning Costar公司，剑桥，麻萨诸塞州（MA））中，并在37℃、5%CO₂ 气氛中培养24小时以使细胞附着。用每孔100μL各个稀释液或100μL无血 清DMEM（作为对照）处理细胞，并在37℃、5%CO₂气氛中培养24、48 或72小时。用含5mg/mL3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐 （MTT）的无血清DMEM替换上述培养液，并另外培养细胞4小时。通过 抽吸去除MTT，并将DMSO（100μL）加入到各孔中，以溶解甲瓒晶体 [Mosmann,T.,J.Immunol.Methods1983,65,55-63]。使用BioRad公司的酶标 仪（microplate reader）在570nm处测定吸收度，结果示于图1中。一式四 份进行试验。

如图1所示，在最苛刻的条件下（在造影介质的浓度为500μg/mL下培 养72小时），测试得到实例1至4中制备的4个CT造影介质化合物1c、2c、 3c和4c分别表现出88.5%、88.4%、88.4%和87.9%的较高的细胞存活率， 因此，CT造影介质化合物1c、2c、3c和4c几乎没有表现出细胞毒性。

因此，上述结果表明本发明包含含碘放射状大分子的CT造影介质具有 优异的安全性。

【实验例2】体外显微-CT成像评价

为了分别研究包含实例1、2、3和4中制备的化合物1c、2c、3c和4c 作为用于CT成像的活性成分的造影介质组合物的对比度增强程度，进行以 下的实验。

制备步骤：CT造影介质组合物的制备

将各个PAMAM-PEG₂₀₀₀-TIPAA共轭物（化合物1c、2c、3c或4c）以 250mg/mL溶解于20mM无菌Tris缓冲溶液（在100mL去离子水（Milli-Q， Millipore公司，pH7.4）中溶解242mg氨丁三醇和10mg EDTA）以制备用 于体内注射的作为CT造影剂的样品溶液。将产生的溶液进行简单的超声处 理以确保均匀性并在4℃下保存（如果不立即使用）。在给动物注射前，将造 影剂溶液从冰箱中取出，温热至室温，并进行涡旋搅拌。

下表1中总结了本发明的CT造影介质溶液的粘度（30℃）和渗透压的 测量结果。

表1

化合物 粘度（mPa·s,30℃） 渗透压（mOsm/kg） 实例1 15.32±0.39 464.75±3.59 实例2 16.47±0.80 233.50±9.75

实例3 16.15±0.53 225.75±1.26 实例4 16.31±0.61 242.00±4.08

表1中的值表示为平均值〒标准偏差。在相同的条件下对每个化合物进 行5次独立的测量，然后在排除最高值和最低值（即，3个数据）后，计算 平均值和标准偏差。

体外显微-CT成像评价

在将制备步骤中制备的包含实例1至4的化合物1c、2c、3c或4c的CT 造影介质（250mg/mL）进行体内注射前，利用显微-CT得到分别用于人或 动物的这些溶液及两个市售的CT造影介质的二维X射线快照图像，以比较 相同条件下上述溶液在管中的相对X射线吸收度，作为初步评价。

本文中，“Iobrix”（泰俊制药（TAEJOON PHARM）有限公司），即用于 人体且在血管内注射后迅速排出的基于小分子的CT造影介质，及“Fenestra  VC”（ART公司，加拿大），即用于动物且在血管内注射后能够相对延长循 环时间的基于纳米粒子的乳液CT造影介质，均被用作阳性对照组。总体而 言，分别制备包含以下物质的8个250μL管：制备步骤中制备的均为250μL 的4种CT造影介质、250μL的“Fenestra VC”，250μL的“Iobrix”、作为 阴性对照组的250μL的20mM Tris缓冲溶液（pH7.4，包含0.1mg/mL  EDTA），以及作为阴性对照组的一个空管。然后将这8个管平行并排排列在 NFR Polaris-G90体内显微-CT扫描仪（制造商：NanoFocusRay）的成像床 上，并拍摄二维X射线快照图像[成像参数：60kVp，60μA，曝光时间： 500ms，视场（FOV）80.00×83.71mm²，放大1.4×]。其结果示于图2中。

如图2所示，所有的CT造影介质的X射线透射率（与X射线的吸收度 成反比）均远低于作为阴性对照组的20mM Tris缓冲溶液（X射线透射强度： 1359.5）和空管（X射线透射强度：1676.5）的X射线透射率。在这些溶液 中，“lobrix”，即用于人体且被快速排放的CT造影介质，显示出最高的X 射线吸收度（X射线透射强度：198.0）。“Fenestra VC”（X射线透射强度： 866.0），即用于动物的CT造影介质，以及包含实例1至4中制备的化合物 1c、2c、3c和4c的CT造影介质（X射线透射强度依次为：904.5、838.0、 826.5和827.0）均在管中二维X射线快照图像中表现出相似的X射线吸收 度值。

因此，结果表明，包含本发明含碘放射状大分子的CT造影介质具有足 够的对比度增强。

【实验例3】体内显微-CT成像评价

为了研究在给药包含实例1至4中制备的化合物1c至4c作为活性成分 的造影介质组合物后，体内对比度增强随时间的变化，使用小动物进行显微 -CT实验，如下文所述。

具体地，使用重量通常为15-22g的6至8周龄的健康雄性C57BL/6小 鼠（东方生物（Orient Bio），韩国）作为小动物。从注射造影介质前约12 小时开始直至注射后4小时完成CT成像，不对每只小鼠喂食水和食物。在 注射后4小时完成CT成像后立即对小鼠喂食水和食物。在注射造影介质之 前，对每只小鼠给药3%异氟烷（在氧气中）约5分钟使每只小鼠在感应室 中麻醉。随后，将小鼠放置到处于俯卧位置的NFR Polaris-G90体内显微-CT 扫描仪（NanoFocusRay，韩国）的成像床上，然后在给药1.5%的异氟烷（在 氧气中）使小鼠麻醉的同时，进行基线（即预对比度）扫描，以作为阴性对 照组[成像参数为：60kVp，60μA，曝光时间为500ms，360°扫描角度，扫 描数量为600，512片（即图像数量）；FOV：对于低分辨率全身成像（放大 1.4×）为80.00×83.71mm²；对于中分辨率胸部和腹部成像（放大3.3×） 为33.94×35.52mm²；对于高分辨率脑成像（放大4.2×）为26.67×27.90 mm²]。接着，通过给药1.5%的异氟烷（在氧气中）保持小鼠处于麻醉状态 的同时，将小鼠的尾巴在温水中浸渍约30-60秒使小鼠的尾静脉扩张，将相 应量的各个造影介质（对于包含实例1-4的化合物的造影介质为15mL/kg； 对于“Fenestra VC”为10mL/kg；及对于“Iobrix”为2.5mL/kg）缓慢注入 各个小鼠的尾静脉中。注射造影介质后，立即将小鼠放到处于俯卧位置的显 微-CT扫描仪的成像床上，在给药1.5%的异氟烷（在氧气中）麻醉的同时， 以相应的分辨率（低、中或高）进行CT扫描。这对应于在0小时（即，立 即）注射后的CT成像。

此后，在不另外注射造影介质的情况下，以相同的方式在注射后1、2、 4、8、24和48小时的时间点对每只小鼠进行CT扫描。每次扫描后，将小 鼠转移至处于恒定温度和湿度（22-25℃和50-60%湿度）的严格受控的环境 的独立的笼子中使小鼠恢复。对于每个造影介质，在上述时间点使用3-6只 小鼠进行全身CT扫描，并使用小鼠在注射后7天再进行CT扫描以观察是 否大部分的造影介质被排出。

此外，对于本发明的CT造影介质，使用1或2只小鼠在相同的参数设 置条件下进行更高分辨率的CT扫描以得到扩大的CT图像，从而比较对比 度增强：对于胸部和腹部区域进行中分辨率设置，对于大脑区域进行高分辨 率设置。在每次CT扫描后，立即将原始图像文件重建为512×512像素的医 学数字影像和通讯（DICOM）文件格式，以确定是否在轴位图像中存在任 何缺陷（即错误）。另外，利用Lucion软件（英飞达保健（Infinitt Healthcare） 公司，韩国）从DICOM文件中获得3D-渲染的图像。

图3、图4（冠状）、图5和图6（矢状）示出了在将本发明的4个CT 造影介质及作为阳性对照组的“Fenestra VC”和“Iobrix”注射入每只小鼠 的尾静脉后，在选定的时间点拍摄的全身冠状和矢状CT图像。

此外，图7、图8（胸部和腹部）、图9、图10（大脑）示出了在将本发 明的4个CT造影介质注射入每只小鼠的尾静脉后在选定的时间点拍摄的胸 部和腹部区域（中分辨率）和脑部区域（高分辨率）的扩大的CT图像。

如图3至图6所示，注射CT造影介质的小鼠的血管区域显示为浅灰色 （骨头示为非常亮的白色）。本发明中，可以理解，“lobrix”，即用于人类的 基于小分子的CT造影介质（作为阳性对照组），在注射后几分钟内通过肾以 相对较快的速度排出（参见0小时注射后的CT图像）。此外，可以理解， “Fenestra VC”，即用于动物的基于纳米粒子的乳液CT造影介质，最初表现 出与包含实例1至4中制备的化合物的CT造影介质相类似的生物分布剖面 （profile）（表现为在注射后高至2-4小时内具有相似水平的对比度增强）； 然而，与本发明的CT造影介质相比，在注射后24小时时，对于“Fenestra VC”， 在肝脏中观察到相对较高的对比度增强，表明“Fenestra VC”具有较高的毒 性。

正如图7至图10所示，对于包含本发明实例1-4中制备的化合物的CT 造影介质，血管内循环时间随着分子量（即，尺寸）的增大而增大。另外， 对于包含具有相对较低的分子量的实例1中制备的化合物1c的造影介质， 排泄的路线主要是通过肾排至膀胱（参见注射后1小时的CT图像）。相比之 下，随着分子量的增大（实例2<实例3<实例4），与肾（或膀胱）相比， 肝中的相对分布增加。此外，与注射“Fenestra VC”相比，在注射包含实例 1至4中制备的化合物的CT造影介质后长达24小时的时间内在心脏区域中 观察到相对较高水平的对比度增强。此外，在CT实验期间，注射有本发明 的CT造影介质的小鼠并无死亡，且根据尸检结果和组织学分析确定，也没 有显示对器官如肝和肾的任何损害。

因此，上述结果表明，包含本发明的含碘放射状大分子的CT造影介质 有足够的对比度增强、较长的循环时间和适当的排出率。