用于增加过氧化氢酶的产生或活性的方法

摘要

本发明公开了在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性的方法和组合物。该方法包括以有效增加过氧化氢酶产生或活性的量将维生素D施用给动物。公开了通过维生素D介导的过氧化氢酶产生或活性的增加，用于治疗过氧化氢酶缺乏、延长动物生命的全盛时期、促进动物的健康和保健，以及改善动物的生活质量的方法。还公开了基于维生素D模拟物在细胞中以类似于维生素D的方式增加过氧化氢酶的产生或活性的能力来筛选维生素D模拟物的方法。

说明书

相关申请的交互引用

本申请要求2010年5月26日提交的美国临时申请系列号61/396372 的优先权，所述专利申请的公开在此处引用作为参考。

发明背景

发明领域

本发明一般涉及用于在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性的方 法，并且特别涉及使用维生素D用于在动物中增加过氧化氢酶的产生或 活性的方法。

相关技术描述

过氧化氢酶是在暴露于氧的几乎全部活生物中可见的常见酶。过氧 化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧。过氧化氢酶广泛分布于动物和植物 中，并且可见于许多真菌和一些厌氧微生物中。

在动物和许多其他生物中，氧化应激由于活性氧的产生与生物系统 立即解毒活性中间产物或者顺利修复所导致的损伤的能力之间失衡而产 生。细胞氧化损伤涉及衰老和一系列广泛的临床疾病，包括缺血-再灌注 损伤；神经变性疾病；糖尿病；炎症疾病例如动脉粥样硬化、关节炎和 肝炎；药物诱导的毒性和癌症。

活性氧类别(ROS)(包括超氧化物自由基阴离子和过氧化氢)作 为对细胞因子、生长因子；G蛋白偶联的受体，以及物理或环境应激的 反应而内源性产生。然而，过量ROS导致了所述的多种病理生理学。 为了最小化过量ROS的损伤作用，好氧生物已经进化出了不同种类的 抗氧化防御。其中，一种防御是酶促的，包括过氧化氢酶、过氧化物、 超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶。例如，超氧化物歧化酶(SOD)、 过氧化氢酶和过氧化物通过直接清除超氧化物自由基和过氧化氢，将它 们转化成活性较低的类别来保护细胞。SOD催化超氧化物阴离子(O₂^·)^- 至过氧化氢(H₂O₂)的歧化作用，并且过氧化氢酶和过氧化物将H₂O₂还原成水。

因此，过氧化氢酶在好氧生物中存在的ROS解毒系统中是普遍的 且重要的酶组分。在哺乳动物中，过氧化氢酶缺乏与多种细胞和组织中 解毒ROS的能力降低相关，导致了多种有害病症或者与多种有害病症 相关，包括过早衰老(和一般地衰老；参见，例如Harman D.，2009， Biogerontology10：773-781)、糖尿病、心血管疾病、肾疾病、肿瘤形 成、不育和毛发变灰。关于后者，最近已经确定，在衰老的毛发干中， 过氧化氢的积累和过氧化氢酶的几乎缺失与毛发色素的丢失相关 (Wood JM等人，2009，Faseb J.23：2065-2075)。根据最新的科学 研究，低水平的过氧化氢酶在人类毛发的变灰过程中起作用。过氧化氢 是由人体天然产生的，并且通过过氧化氢酶将其分解。如果过氧化氢酶 水平下降，那么过氧化氢不能被分解。这造成了过氧化氢将毛发从内至 外漂白。科学家认为，可以在某一天将该发现掺入到用于衰老的毛发的 抗变灰(anti-graying)治疗中。

鉴于前述，研发在动物或其他生物中增加过氧化氢酶产生或活性的 方法和组合物明显代表了本领域的发展方向。

发明概述

因此，本发明的目的是提供用于在动物中增加过氧化氢酶的产生或 活性的方法。

本发明的另一目的是提供用于在动物中上调过氧化氢酶基因表达的 方法。

本发明的再一目的是提供用于鉴定在动物中增加过氧化氢酶的产生 或活性的试剂或方案的方法，包括鉴定用于在动物中增加过氧化氢酶的 产生或活性的维生素D模拟物的方法，所述维生素D模拟物例如通过在 动物中上调过氧化氢酶基因的表达而增加过氧化氢酶的产生或活性。

本发明的另一目的是提供用于延长动物生命的健康全盛时期的方 法。

本发明的又另一目的是提供用于促进动物的健康或保健(wellness) 的方法。

本发明的另一目的是提供用于改善动物的生活质量的方法。

本发明的再一目的是提供用于鉴定在细胞中增加过氧化氢酶的产生 或活性的试剂或方案的方法。

可以使用用于在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性的新方法和组 合物来实现一个或多个这些或其他目的。该方法包括以有效增加过氧化 氢酶的产生或活性的量，将维生素D施用给动物。还提供了使用维生素 D的施用来在动物中治疗过氧化氢酶缺乏、延长动物的生命全盛时期、 促进动物的健康和保健，以及改善动物的生活质量的方法。以及使用过 氧化氢酶基因和其他编码涉及抗氧化应答的蛋白质的基因之表达谱来筛 选以类似于维生素D的方式(即通过增加编码过氧化氢酶的基因表达) 调节这些谱的物质的其他方法。还提供了包含试剂组合、探针成分、使 用探针的器械，以及物质的多种试剂盒，以及用于涉及本发明方法的交 流信息的交流介质。

本发明的其他和另外目的、特征，以及优点对本领域技术人员是显 而易见的。

发明详述

定义

术语“动物”意为可以得益于过氧化氢酶的产生或活性增加的任一 动物或其他生物(例如，真菌)，包括人、鸟、牛、犬、马、猫、hicrine、 狼、鼠、绵羊或者猪动物。

术语“过氧化氢酶”指催化反应2H₂O₂＝O₂+2H₂O的包含在 IUBMB酶命名系统EC1.11.1.6中的酶。过氧化氢酶的其他名称包括： equilase、caperase、optidase、过氧化氢酶-过氧化物酶和CAT。过氧化 氢酶还可以作为过氧化物酶(EC1.11.1.7过氧化物酶)发挥作用，其中 可以将几种有机物质，特别是乙醇作为氢供体。典型的过氧化氢酶是4 个多肽链的四聚体，其含有允许酶与过氧化氢反应的4个卟啉血红素 (铁)基团。

术语“伴侣动物”意为家养动物，例如狗、猫、鸟、兔、豚鼠、雪 貂、仓鼠、小鼠、沙土鼠、观赏马、牛、山羊、绵羊、驴、猪，以及由 人类喂养的更多的外来物种，用于陪伴、娱乐、心理支持、外向性格展 示，以及人类需要与其他物种动物共享的全部其他功能。

术语“饮食补充物”意为除动物的正常饮食外拟被消化的产物。饮 食补充物可以以任一形式存在，例如固体、流体、凝胶、片剂、胶囊、 粉末等。优选地，它们以方便的剂型提供。在一些实施方案中，它们以 散装消费包装例如散装粉末或液体提供。在其他实施方案中，补充物以 可以包含到其他食物物品例如点心、加工处理物(treats)、补充棒 (supplement bar)、饮料等中的散装量提供。

术语“延长的全盛时期”意为延长动物过着健康生活的年份数，并 不只是延长动物生存的年份数，例如，动物在其生命的全盛时期中，可 以健康相对更长的时间。因此，动物生命的“全盛时期”可以从成年早 期(“年轻的”，如下所述)延长至老年或者“年老的”群体。事实上， 动物生命的全盛时期可以基本上延长直到动物死亡，假定动物在其老年 期期间是健康且有活力的。

术语“食物”或“食物组合物”指意图由动物，包括人类消耗的组 合物。“完全的和营养均衡的宠物食物”是以合适的量和比例(例如基 于伴侣动物营养领域中公认的权威机构的推荐)，含有对食物的预期接 受者或消费者所有已知的所需营养物的宠物食物。因此，可以将此类食 物用作为饮食摄入的唯一源以维持生命或促进生产，而无需添加补充营 养源。营养均衡的宠物食物组合物在本领域是广泛已知并广泛使用的。

术语“基因”指参与产生多肽的全部或部分DNA区段，包括在编 码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)和在单个编码区段(外 显子)之间的间插序列(内含子)。该术语包括与基因编码序列的互补 序列(complement)杂交的任一DNA序列。

术语“动物的健康和/或保健”意为动物完全的身体、精神和社会健 康，而不仅仅是不存在疾病或虚弱。

术语“联合(in conjunction)”指将药物、食物或其他物质(1)与组 合物，特别是食物组合物一起施用给动物，或(2)使用相同或不同的施用 途径、在大约相同的时间或周期地、分别以相同的或不同的频率施用给 动物。“周期地”指对于特定物质，以可接受的剂量方案施用物质。“大 约相同的时间”一般指在相同的时间或在彼此间隔约72小时内施用物质 (食物或药物)。“联合”特别包括这样的施用方案，其中将物质例如 药物在规定的时期施用，并将本发明的组合物无限定地施用。

术语“个体”当指动物时，意为任一物种或种类的个体动物。

术语“长期”施用意为超过1个月的时间。包括2、3或者4个月以 上的时间。还包括包含5、6、7、8、9或10个月以上的更长时间。还包 括超过11个月或者1年的时间。本文还考虑超过1、2和3年或者以上 的长期使用。在某些动物的情况下，应当理解，应当基于规律地施用由 本发明方法鉴定的物质。如本文中所用，“基于规律施用(regular basis)” 指至少每周施用。也包括更频繁的施用，例如每周两次或者三次。还包 括了包含每日至少一次、两次、三次或者以上施用的方案。不管在本文 中是否明确示例，认为任一剂量频率都是有用的。本领域技术人员应当 理解，剂量频率应当随所使用的物质而变，并且一些组合物可以需要更 高或者更低的频率施用，以维持期望的生物化学、生理学或者基因表达 作用，即包括食物摄取、饱腹感、脂质代谢和脂肪利用，以及与其相关 的基因表达谱中的一种或多种作用。如本文中所用，术语“延长的基于 规律施用”指长期地施用基于规律施用的物质。

术语“口服施用”意为动物摄取，或者人类被指导而喂饲，或喂饲， 动物一种或多种本文中所述的物质。如本文中所用，术语“摄取”可与 术语“口服施用”互换。其中，人类被指导以口服施用或者喂饲该物质， 此说明可以是指导和/或告知人类使用该物质可以和/或会提供所提及的 益处的说明。该说明可以是口头说明(例如，通过来自例如，医师、兽 医或者其他健康专业人员或者广播或电视媒体(即，广告)的口头说明)、 或者书面说明(例如，通过来自例如，医师、兽医或者其他健康专业人 员(例如，处方)、销售专业人员或者组织(例如，通过例如，销售宣 传册、小册子或者其他说明性附件)、书面媒介(例如、互联网、电子 邮件或者其他计算机相关的介质)和/或与物质相关的包装的书面说明)。

术语“样品”意为含有例如，多核苷酸、多肽、抗体、代谢物等的 任一动物组织或流体，包括细胞和包含DNA和RNA的其他组织。样品 包括脂肪、血液、软骨、结缔组织、上皮的、淋巴的、肌肉、神经、痰 等。样品可以是固体的或流体的，并且可以是DNA、RNA、cDNA、体 液例如血液或尿液、细胞、其细胞制备物或其可溶性组分或者基质整分 试样、染色体、细胞器等。

术语“单独包装”意为试剂盒的组分与一个或一个以上容器物理相 关或包含在其内，并将其作为生产、分配、销售或使用的单位。容器包 括但不限于，包、箱、瓶、热缩塑料包(shrink wrap packages)、主要 的或另外固定的组分或者其组合。单独包装可以是物理相关的单独的食 物组合物的容器，以将它们作为生产、分配、销售或使用的单位。

如本文中所用，术语“局部施用”意为将组合物施用或者应用于毛 发、毛皮、指甲、爪、皮肤、黏膜、眼睛、呼吸道、肺或者任一其他上 皮表面。

术语“维生素D”意为维生素D和其天然或者合成形式的任何形式、 衍生物或功能类似于维生素D的类似物，以影响动物中过氧化氢酶的产 生或活性。在这样的背景下，维生素D可以获自饮食来源或者可以在体 内合成。饮食维生素D可以以两种形式得到：来自植物源的维生素D₂(麦角骨化醇)和来自动物源的维生素D₃(胆钙化醇)，二者都共同称 为维生素D。通过暴露于紫外光，主要来自UVB光谱中的光线，维生 素D₃形式的维生素D可以在皮肤中制备自7-脱氢胆固醇(7-DHC)。 维生素D是激素原，最终转变成活性形式1α，25-二羟基维生素D₃(1，25(OH)₂D₃)，也称为骨化三醇。因此，如本文中所用，术语“维生 素D”包括由生物产生的，并且可以通过天然或合成方法转变成生物活 性形式(骨化三醇)的维生素D形式(例如，维生素D₂、维生素D₃)。 该术语还包括模拟骨化三醇的至少一种生物学活性的天然或合成类似 物。除刺激过氧化氢酶的产生或活性外，骨化三醇和/或其前体的生物学 活性包括但不限于，与维生素D结合蛋白质结合(前体)、与维生素D 受体结合(骨化三醇)和后续的信号转导，以及刺激钙吸收。

术语“虚拟包装(virtual package)”指试剂盒组分通过关于一个 或一个以上物理或虚拟试剂盒组分的说明而联合在一起，其指导用户如 何获取其他组分，例如，在一个包装(bag)中含有一个组分和指导用 户前往网址、联系记录的信息、查看可见信息或者联系医务工作者 (caregiver)或指导者以获取如何使用试剂盒的说明。

“年轻的”一般指处于成年早期的个体，即经过青春期或青少年期 的成熟的个体，如由物种或者由物种内的品系、品种或种群，根据已知 的参数定义的。如本文中所用，“年老的”或“老年的”指身体上或时 间上在其平均预期寿命的最后30％内的个体，如由物种或者由物种内的 品系、品种或种群，根据已知的参数确定的。

在本文中，以速记形式使用范围，以避免不得不列举并描述范围内 的每一个数值。根据需要，可以选择范围内的任一合适的数值，作为范 围的上限值、下限值或者端点。

如在本文中所用，单词的单数形式包括其复数，并且反之亦然，除 非另外清楚指明。因此，指代词“一个”、“一”和“所述”(“a”、 “an”和“the”)一般包括各个术语的复数。例如，提到“化合物”、 “方法”时包括此类“化合物”、“方法”的复数。类似地，应当将词 语“包含”、“包括”和“含有”解释为包含在内而不是不包含。同样 地，应当将术语“包括”、“包括的”和“或者”理解为包含在内，除 非上下文明确禁止此种解释。

术语“包含”或“包括”意图包括由术语“基本上由......组成”和 “由......组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由......组成” 意图包括由术语“由......组成”所涵盖的实施方案。

除非另外清楚指明，本文中所述的全部百分比基于干物质按组合物 的重量计。本领域技术人员应当理解，术语“基于干物质”意为在去除 组合物中的任一游离水分之后测量的组合物中成分的浓度。

此处公开的方法和组合物以及其他益处并不限于本文中所述的特定 方法、步骤和试剂，因为，对于本领域技术人员应当理解，他们是可以 变化的。此外，本文中所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的， 并且并不意图和并非限制公开的或要求保护的本发明的范围。

除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语，专业术语和缩 写具有由本发明领域中或使用该术语的领域中普通技术人员通常理解的 含义。尽管可以将与本文中所述的组合物、方法、生产的物品或其他方 法或材料类似的或等同的那些任一组合物、方法、生产的物品或其他方 法或材料用于本发明的实践，但在本文中描述了优选的组合物、方法、 生产的物品或其他方法和材料。

本文中引用的或提及的所有专利、专利申请、出版物、技术和/或学 术文献、以及其他参考文献在此处以受法律允许的程度引用作为参考。 这些参考文献的讨论仅旨在总结其中所进行的推断。并未做出关于任一 此类专利、专利申请、出版物或参考文献或其任何部分是相关的、重要 的或现有技术的承诺。特别保留了反对此类专利、专利申请、出版物和 其他参考文献为相关的、重要的或现有技术的任一主张的准确性和适用 性的权利。

本发明

在一个方面，本发明提供了在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性的 方法。该方法包括，鉴定需要或者可以受益于过氧化氢酶的产生或活性增 加的动物，并给动物施用可以增加过氧化氢酶产生或活性的量的维生素 D。本发明部分基于以下发现，维生素D可以增加过氧化氢酶的产生或活 性，并且当以合适的量施用是，可以在动物中上调与过氧化氢酶产生相关 的基因的表达。具体而言，如在实施例中所详细描述，骨化三醇和某些维 生素D类似物可以增加过氧化氢酶产生、增加过氧化氢酶活性，并上调 编码过氧化氢酶基因的表达。

动物可以是受益于过氧化氢酶的产生或活性增加的任一动物，例如， 呼吸空气或者生活在含氧环境中的任一好氧动物。例如，动物可以是人 类或者家养动物。更特别地，动物可以是伴侣动物，例如犬科动物或猫 科动物，包括狗或猫。

该方法的第一步涉及鉴定需要或者可以受益于过氧化氢酶的产生或 活性增加的动物。例如，该动物可以是年老的动物、过氧化氢酶缺乏的 动物或者患与过氧化氢酶缺乏相关的疾病或病症(例如无过氧化酶血症、 肝细胞瘤等)的动物。备选地，动物可以是健康动物，其中过氧化氢酶 的产生或活性的增加可以促进动物健康或者保健、延长动物生命的全盛 时期或者改善动物的生活质量。

用于本发明的维生素D是在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性的 任一维生素D。在一个实施方案中，维生素D是骨化三醇(1α，25-二羟 基维生素D₃)。在另一个实施方案中，维生素D是类似物西奥骨化醇 (EB1089，1a，25-二羟基-22，24-二烯-24，26，27-三高维生素D (1a，25-dihydroxy-22，24-diene-24，26，27-trihomovitamin D))。在另一 个实施方案中，维生素D是1α，25-二羟基-16-烯-23-炔-维生素D₃(类似 物V)。其他维生素D的合适形式包括但不限于，维生素D₃、25(OH) 维生素D₃、24，25(OH)₂维生素D₃、帕立骨化醇(一种合成的骨化三醇 的生物学活性维生素D类似物，具有侧链(D₂)和A(19-去甲)环的 修饰)、1，25-二羟基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-D₃、1，25-二羟基-16，23E- 二烯-26，27-六氟-19-正-D₃，22-氧杂-骨化三醇、1α-(OH)D₅、20-表 -1α，25(OH)₂D₃、钙泊三醇、1α24(S)(OH)₂D₂、1α，24(R)(OH)₂D₃和 KH1060。本发明还包括两种或两种以上任意维生素D的组合。在某些 实施方案中，所使用的维生素D形式或类似物拥有骨化三醇的选定生物 学活性，但降低或者缺少骨化三醇的其他生物学活性。例如，适合于在 本发明的多种实施方案中施用的维生素D形式或类似物与维生素D受体 结合，但不刺激钙吸收。

在动物中增加过氧化氢酶产生或活性所需要的维生素D的量根据维 生素D的形式、动物的物种、动物的生物学条件、所处理的组织，以及 本领域技术人员(例如医学药剂师或生物学家)熟知的其他参数变化。适 合于大多数用途的是从每千克体重约1ng(ng/kg)至每千克体重约10mg (mg/kg)，优选地从每千克体重约10ng至每千克体重约5mg，更优选 地从每千克体重约100ng至每千克体重约5mg，最优选地从每千克体重 约1μg(μg/kg)至每千克体重约1mg。在多种实施方案中，以每千克体 重约1、10、50、100、250和500ng；每千克体重约1、10、50、100、 250和500μg；或者每千克体重约1、2、4、6、8和10mg的量施用维生 素D。当有用时，以每千克体重10mg以上的量施用维生素D。可以使用 公式40IU＝1μg的维生素D来进行将这些剂量范围转变成国际单位 (IU)。还可以基于待递送给靶细胞或组织的维生素D的浓度来计算剂 量。合适的浓度包含至少约10^-15M、或至少约10^-14M、或至少约10^-13M、 或至少约10^-12M、或至少约10^-11M、或至少约10^-10M、或至少约10^-9M、 或至少约10^-8M、或至少约10^-7M、或至少约10^-6M、或至少约10^-5M的 供靶细胞摄取的维生素D。

在一个实施方案中，将维生素D口服施用，例如配制成口服施用给 动物的组合物如药片、饮料饮剂、药物或食物组合物的形式口服施用。根 据本发明的施用可以是基于需求或者预期而变化的或者是规律频率的。规 律摄入的目的是给动物提供规律的和恒定剂量的组合物或者由于该摄入 所产生的直接或间接代谢物。该规律的和恒定剂量倾向于产生组合物的组 分或者其直接或间接代谢物的恒定血液水平。因此，规律施用可以是每月 一次、每周一次、每日一次或者每日一次以上。类似地，施用可以是隔一 天一次、隔一周一次或者隔一月一次、隔三天一次、隔三周一次或者隔三 个月一次、隔四天一次、隔四周一次或者隔四个月一次等等。施用可以是 每天多次。当用作为常规饮食需求的补充剂时，可以将组合物直接施用给 动物。可以将组合物备选地与每日饲料或者食物(包括流体，例如饮用水) 接触或者混合或者与接受该治疗的动物静脉内连接。当用作为每日饲料或 者食物时，施用对本领域技术人员而言是熟知的。

还可以将施用作为动物的饮食方案的一部分实施。例如，饮食方案可 以包含以可以有效增加动物中过氧化氢酶产生或活性的量，使动物规律地 摄入本文中所述的维生素D或维生素D组合物。

根据本发明方法，维生素D的施用(包括为饮食方案的一部分施用) 可以跨度从动物分娩到成年的时间段。在某些实施方案中，动物是年轻的 或者正在成长的动物。在其他实施方案中，动物是成年的或者成熟的动物。 在其他实施方案中，动物是年老的动物。通常合适的是已经达到其预计寿 命的约35％的动物。在某些实施方案中，当动物已经达到其预计或者预 期寿命的约30％、40％或50％时，开始例如，规律或者延长的规律施用。 在一些实施方案中，动物已经达到其预计寿命的40、45或50％。又在其 他实施方案中，动物是已经达到其可能寿命的60、66、70、75或80％的 老年动物。寿命的测定可以基于保险统计员计算出来的表格、计算、估计 等，并且可以考虑已知的正面或者负面影响寿命的过去的、当前的、和未 来的影响或因素。当测定寿命时，物种、性别、大小、遗传因素、环境因 素和应激物、当前和过去的健康状况、过去和当前的营养状况等考虑因素 也可以影响寿命，并可以纳入考虑事项。

在本发明的多个实施方案中，以食物组合物例如人类食物组合物、宠 物食物组合物或者饮食补充剂施用维生素D。例如，组合物可以另外包含 约15％至约50％蛋白质、约5％至约40％脂肪、约5％至约10％灰分含 量，并具有约5％至约20％的水分含量的食物组合物。如下文更详细的描 述，组合物可以含有其他成分，包括维生素、矿物质、益生菌、益生元或 者它们的组合。如下文更详细的描述，本文中所述的方法还可以使用配制 的用于通过任一选定途径施用的药物或营养组合物。

在其他实施方案中，将维生素D与一种或多种益生菌、益生元或其 组合联合施用，以受益动物，例如治疗动物过氧化氢酶缺乏、延长动物的 生命全盛时期、促进动物健康和保健或者改善动物的生活质量。

在本发明的其他实施方案中，通过局部施用维生素D，优选地以含维 生素D的组合物来增加靶上皮细胞和组织的过氧化氢酶产生或活性。可 以以该方式靶向细胞和组织，包括皮肤、毛发、毛皮、指甲、爪、口腔、 肛门或阴道黏膜、胃肠道黏膜/上皮、眼睛表面、耳喉(otolaryngeal)和 呼吸道表面，包括支气管表面和肺泡表面。可以将该方法用于补充那些 细胞和组织中的过氧化氢酶缺乏，所述过氧化氢酶缺乏由于过氧化氢的 积累加重了损伤。例如，将维生素D局部施用给毛发和头皮可以降低或 者预防由于与毛发生长相关的组织中过氧化氢的积累和过氧化氢酶缺乏 导致的毛发变灰。

在任一方法中，可以将维生素D与一种或多种在动物中用于增加过 氧化氢酶产生或活性或者用于降低或去除活性氧类别的添加剂联合。例 如，可以在使用维生素D之前、期间或之后施用添加剂。如果将添加剂 与维生素D一起施用，那么可以例如，在单个组合物中或者在单独的组 合物中一起或者单独地施用它们。

在一个实施方案中，添加剂是一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂可以是 适合于施用给动物的任一抗氧化剂。抗氧化剂是本领域，特别是食品工艺 和食品配制领域熟知的。天然的抗氧化剂化合物包括维生素(如A、C和 E，及其衍生物、缀合物或类似物)，以及植物提取物，包括来自水果、 蔬菜、草本、种子和植物的其他类型和/或部分的提取物。化合物，如α- 硫辛酸、叶绿素及其衍生物、谷胱甘肽、泛醌醇(例如，辅酶Q10)、类 胡萝卜素(例如，番茄红素)、类黄酮、酚酸和多酚和碧萝芷都是已知的 极好抗氧化剂。植物来源的抗氧化剂的一些实例包括那些来自水果例如浆 果(樱桃、黑莓、草莓、覆盆子、岩高兰、蓝莓、欧洲越橘/短毛蓝果忍 冬(wild blueberry)、红醋栗)、石榴、葡萄、橘子、李子、凤梨、猕 猴桃和葡萄柚的提取物；那些来自蔬菜包括，羽衣甘蓝、红辣椒、红甘 蓝、胡椒、欧芹、菜蓟、球芽甘蓝、菠菜、柠檬、姜、大蒜和红甜菜的 提取物；那些来自干果如杏、梅干和枣的提取物；来自豆类包括蚕豆、 黑白斑豆和大豆的提取物。还有坚果和种子，例如美洲山核桃、核桃、 榛子、花生和向日葵籽；谷物，例如大麦、小米、燕麦和玉米。还可以 从大量的物种，包括丁香、肉桂、迷迭香和牛至中获得许多天然的抗氧 化剂。较不广泛已知的抗氧化剂的来源包括银杏和热带植物，例如uyaku 和番木瓜。多种茶和绿茶，以及发酵产品例如红酒的抗氧化特性在近年 来引起了很大的兴趣，并且其适合于本文中的用途。硒是极好的氧清除 剂并且非常有效，特别是与维生素或相关的生育酚化合物一起。合成的 饮食抗氧化剂包括通常用于食物产品的丁羟茴醚(BHA)和丁羟甲苯 (BHT)。单独的或者组合的任一前述抗氧化剂都适合于本文中的用途， 例如天然的和合成的抗氧化剂的组合物。在一个实施方案中，抗氧化剂 包含单独的或者与其他抗氧化剂组合的虾青素。

在另一方面，本发明提供了用于预防或者治疗动物中由于过氧化氢酶 缺乏引起的疾病或病症的方法。该方法包括(1)确定过氧化氢酶缺乏或者 可能过氧化氢酶缺乏的动物和(2)以可以有效增加动物中过氧化氢酶的产 生或活性的量，将维生素D施用给动物，从而预防或者治疗疾病或病症。 疾病是由于过氧化氢酶缺乏引起的任一疾病，例如无过氧化酶血症、肝 细胞瘤。

在另一方面，本发明提供了延长动物生命的全盛时期的方法。该方法 包括(1)鉴定处于其生命的全盛时期的动物或者鉴定期望延长生命的全盛 时期的动物；(2)测定动物过氧化氢酶产生或活性的增加可以增加动物生 命的全盛时期；和(3)以可以有效增加动物中过氧化氢酶的产生或活性的 量，将维生素D施用给动物，从而延长动物生命的全盛时期。

在另一方面，本发明提供用于促进动物的健康或保健的方法。该方法 包括(1)鉴定可以通过增加其过氧化氢酶的产生或活性来改善其健康或保 健的动物和(2)以可以有效增加动物中过氧化氢酶的产生或活性的量，将 维生素D施用给动物，从而促进动物的健康或保健。

在另一方面，本发明提供用于改善动物的生活质量的方法。该方法包 括(1)鉴定可以通过增加其过氧化氢酶的产生或活性来改善其生活质量的 动物和(2)以可以有效增加动物中过氧化氢酶的产生或活性的量，将维生 素D施用给动物，从而提高动物的生活质量。

在另一方面，本发明提供用于在动物中增加过氧化氢酶的产生或活性 的组合物。这些组合物包含维生素D和至少一种用于在动物中增加过氧 化氢酶产生或活性或者用于减少或去除活性氧类别的添加剂。

组合物中的维生素D是增加动物中过氧化氢酶的产生或活性的任一 维生素D。在一个实施方案中，维生素D是骨化三醇(1α，25-二羟基维 生素D₃)。在另一个实施方案中，维生素D是类似物西奥骨化醇(EB1089， 1a，25-二羟基-22，24-二烯-24，26，27-三高维生素D)。在另一个实施方案 中，维生素D是1α，25-二羟基-16-烯-23-炔-维生素D₃(类似物V)。其 他维生素D的合适形式包括但不限于，维生素D₃、25(OH)维生素D₃、 24，25(OH)₂维生素D₃、帕立骨化醇(一种合成的骨化三醇的生物学活性 维生素D，具有侧链(D₂)和A(19-去甲)环的修饰)、1，25-二羟基-16，23Z- 二烯-26，27-六氟-D₃、1，25-二羟基-16，23E-二烯-26，27-六氟-19-正-D₃，22- 氧杂-骨化三醇、1α-(OH)D₅、20-表-1α，25(OH)₂D₃、卡泊三醇、 1α24(S)(OH)₂D₂、1α，24(R)(OH)₂D₃和KH1060。本发明还包括两种或两 种以上任意维生素D的组合。在某些实施方案中，所使用的维生素D形 式或类似物拥有骨化三醇的选定生物学活性，但降低或者缺少骨化三醇 的其他生物学活性。例如，适合于在本发明的多种实施方案中使用的维 生素D形式或类似物与维生素D受体结合，但不刺激钙吸收。

组合物中维生素D的量是增加动物中过氧化氢酶产生或活性所需的 任一量。所述量根据维生素D的形式、动物的物种、动物的生物学条件、 所处理的组织，以及本领域技术人员，例如医学药剂师或生物学家熟知的 其他参数变化。递送每千克体重约1微克至每千克体重约1,000微克之间 剂量的配制组合物适用于大多数用途。更特别地，可以使用每千克体重至 少约1μg、或每千克体重至少约5μg、或每千克体重至少约10μg、或每千 克体重至少约20μg、或每千克体重至少约30μg、或每千克体重至少约 40μg、或每千克体重至少约50μg、或每千克体重至少约100μg、或每千 克体重至少约200μg、或每千克体重至少约300μg、或每千克体重至少约 400μg、或每千克体重至少约500μg。可以使用公式40IU＝1μg的维生素 D来进行将这些剂量范围转变成国际单位(IU)。还可以基于待递送给靶 细胞或组织的维生素D的浓度来计算配制的组合物的递送剂量。合适的 浓度包含至少约10^-10M、或至少约10^-9M、或至少约10^-8M、或至少约 10^-7M、或至少约10^-6M、或至少约10^-5M的供靶细胞摄取的维生素D。

添加剂可以是用于增加过氧化氢酶的产生或活性或者增加体内抗氧 化系统的产生或活性或者用于解毒一种或多种活性氧类别的任一试剂。在 一个实施方案中，添加剂是一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂可以是适合于 施用给动物的任一抗氧化剂。抗氧化剂是本领域，特别是食品工艺和食品 配制领域熟知的。天然的抗氧化剂化合物包括维生素(如A、C和E，及 其衍生物、缀合物或类似物)，以及植物提取物，包括来自水果、蔬菜、 草本、种子和植物的其他类型和/或部分的提取物。化合物，如α-硫辛酸、 叶绿素及其衍生物、谷胱甘肽、泛醌醇(例如，辅酶Q10)、类胡萝卜素 (例如，番茄红素)、类黄酮、酚酸和多酚和碧萝芷都是已知的极好抗氧 化剂。上文列出了植物来源的抗氧化剂的一些实例。硒是极好的氧清除 剂并且非常有效，特别是与维生素或相关的生育酚化合物一起。合成的 饮食抗氧化剂包括通常用于食物产品的丁羟茴醚(BHA)和丁羟甲苯 (BHT)。单独的或者组合的任一前述抗氧化剂都适合于本文中的用途， 例如天然的和合成的抗氧化剂的组合物。在一个实施方案中，抗氧化剂 包含单独的或者与其他抗氧化剂组合的虾青素。

组合物还可以包含物质，例如矿物质、其他维生素、盐、功能性添加 剂包括，例如palatants、着色剂、乳化剂、抗菌剂或其他防腐剂。可用 于此类组合物的矿物质包括，例如钙、磷、钾、钠、铁、氯、硼、铜、锌、 镁、锰、碘、硒等。本文中所用的其他维生素的实例包括，例如脂溶性维 生素A、E和K。在多种实施方案中，可用的包括菊粉、氨基酸、酶、辅 酶等。

可以将组合物配制成人类食物组合物、宠物食物组合物或饮食补充 剂。此类组合物包括旨在给动物提供必需饮食需求的食物、动物的加工处 理物(例如，饼干)或饮食补充剂。组合物可以是干组合物(例如，(磨 成粗粒的)食物(kibble))、半湿组合物、湿组合物或者它们的任一混合。 在另一个实施方案中，组合物是饮食补充剂，例如肉汁、饮用水、饮料、 酸奶、粉剂、颗粒、糊剂、悬浮液、咀嚼物、morsel、零食(treat)、点 心、糖丸、丸剂、胶囊、片剂或者任一其他合适的递送形式。饮食补充剂 可以包含高浓度的维生素D。其允许将补充剂少量施用给动物，或者备选 地，可以在施用给动物之前进行稀释。在施用给动物之前，可能需要将饮 食补充剂进行混合，或者优选地与水或者其他稀释液混合。

在一个实施方案中，组合物是冷藏的或者冷冻的组合物。在另一个实 施方案中，维生素D是与其他组分预混合的，以提供所需的有益量。又 在其他实施方案中，将维生素D用于包被食物、点心、宠物食物组合物 或者宠物零食。在一个实施方案中，在将其提供给动物之前，例如使用喷 洒粉(sprinkled powder)或者混合物，立即将维生素D加入到组合物中。

如本领域技术人员所理解，组合物可以任选地包含一种或多种促进或 者维持一般健康的补充物质。

在多种实施方案中，宠物食物或宠物零食组合物包含约15％至约 50％的粗蛋白质。粗蛋白质物质可以包含蔬菜蛋白质例如大豆粉、大豆蛋 白质浓缩物、玉米谷蛋白粉、小麦谷蛋白、棉籽和花生粉或者动物蛋白质， 例如酪蛋白、白蛋白和肉蛋白质。用于本文中的肉蛋白质的实例包括，猪 肉、羔羊肉、马肉、禽肉、鱼肉及其混合物。

组合物还可以包含约5％至约40％的脂肪。组合物还可以包含碳水化 合物源。组合物可以包含约15％至约60％的碳水化合物。此类碳水化合 物的实例包括谷物或谷类，例如稻、玉米、蜀黍、高粱、苜蓿、大麦、 大豆、卡诺拉(canola)、燕麦、小麦及其混合物。组合物还可以任选 地包含其他物质，例如干乳清和其他乳制副产品。

在一些实施方案中，组合物的灰分含量为小于1％至约15％，优选地 约5％至约10％。

水分含量可以根据组合物的性质而变。在优选的实施方案中，组合物 是完全的和营养均衡的宠物食物。在该实施方案中，宠物食物可以是“湿 食物”、“干食物”或者具有中等水分含量的食物。“湿食物”描述了通 常以罐头或箔袋销售的宠物食物，并且其通常具有约70％至约90％的水 分含量。“干食物”描述了组成类似于湿食物的宠物食物，但其含有有限 的水分含量，通常为约5％至约15％或20％，并因此其表现为例如，小 饼干样(磨成粗粒的)食物。在一个当前优选的实施方案中，组合物具有约 5％至约20％的水分含量。干食物产物包括多种水分含量的多种食物，以 使它们相对贮存稳定并且抗微生物或真菌致劣或者污染。还优选的干食物 组合物是挤压的食物产物，例如宠物食物或者人类或伴侣动物的点心食 物。

组合物还可以包含一种或多种纤维源。术语“纤维”包括食物中“体 积(bulk)”的全部来源，无论其是可消化的或者不可消化的、可溶的或 者不溶的、可发酵的或者不可发酵的。优选的纤维来自植物来源，例如海 生植物，但也可以使用微生物来源的纤维。如本领域普通技术人员所已知， 可以使用多种可溶性或不溶性纤维。纤维来源可以是甜菜渣(来自甜菜)、 阿拉伯树胶、塔哈树胶、洋车前草(psyllium)、米糠、角豆胶、柑桔渣、 低聚果糖、果胶、短链低聚果糖、甘露聚糖低聚果糖、大豆纤维、阿拉 伯半乳聚糖、低聚半乳糖、阿糖基木聚糖或其混合物。

备选地，纤维源可以是可发酵的纤维。前面已经描述了可发酵的纤维 为伴侣动物的免疫系统提供益处。可以将本领域技术人员已知的可发酵纤 维或其他组合物(其可以提供增强肠道内益生菌生长的益生作用)掺入到 本组合物中，以帮助增强由本发明提供给动物的免疫系统的益处。

在多种实施方案中，组合物还包含一种或多种益生菌。在多种实施 方案中，组合物含有(1)一种或多种已杀死的或者已灭活的益生菌，(2) 促进与活的益生菌相似或相同的健康益处的已杀死的或者已灭活的益生 菌的组分，或(3)它们的组合。可以将益生菌或它们的组分掺入到组合 物中(例如，均一的或者不均一的分散在组合物中)或者应用于食物组 合物(例如，应用载体的局部应用或者不应用载体的局部应用)。在一 个实施方案中，益生菌在载体中是胶囊化的。一般的益生菌包括但不限 于，选自乳杆菌属(Lactobacilli)、双岐杆菌属(Bifidobacteria)或肠球菌属 (Enterococci)，例如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteii)、嗜酸乳 杆菌(Lactobacillus acidophilus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、 瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、约氏乳杆菌(Lactobacillus  johnsonii)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和双歧杆菌属物种、屎链球菌 (Enterococcus faecium)和肠球菌属物种的益生菌菌株。在一些实施方 案中，益生菌菌株选自罗伊氏乳杆菌(NCC2581；CNCM I-2448)、罗 伊氏乳杆菌(NCC2592；CNCM I-2450)、鼠李糖乳杆菌(NCC2583； CNCMI-2449)、罗伊氏乳杆菌(NCC2603；CNCM I-2451)、罗伊氏 乳杆菌(NCC2613；CNCM I-2452)、嗜酸乳杆菌(NCC2628；CNCM  I-2453)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(例如NCC2627)、 双歧杆菌属物种NCC2657或屎链球菌SF68(NCIMB 10415)。组合物 含有足以提供约10⁴至约10¹²cfu/动物/天，优选地10⁵至约10¹¹cfu/动物 /天，更优选地10⁷至10¹⁰cfu/动物/天的量的益生菌。当益生菌是已杀死 的或者已灭活的时候，已杀死的或者已灭活的益生菌或其组分的量应当 产生与活的微生物类似的有益作用。许多此类益生菌及其益处是本领域 技术人员已知的，例如EP1213970B1、EP1143806B1、US7189390、 EP1482811B1、EP1296565B1和US6929793。

在多种实施方案中，可食用的组合物还包含一种或多种益生元，例 如低聚果糖、低聚葡萄糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、大 豆低聚糖、低聚乳果糖(lactosucrose)、乳果糖和异麦芽酮糖 (isomaltulose)。在某些实施方案中，益生元是菊苣、菊苣根提取物、 糊粉、菊粉或其组合物。如本文中所述，将益生元掺入到组合物中(例 如均一的或者不均一的分散在组合物中)或者应用于食物组合物(例如， 应用载体的局部应用或者不应用载体的局部应用)。通常，以足以确实 刺激消化道中健康微生物群的量施用益生元。一般量为一次约1至约10 克或者动物的推荐每日饮食纤维的约5至约40％。

在多种实施方案中，可食用的组合物还包含一种或多种益生菌和一 种或多种益生元的组合。

可以特别地配制组合物和饮食补充剂，用于指定的接受者或消费者， 例如用于成年动物或者用于老年或年轻动物。例如，可以制备适合于幼犬、 小猫或者适合于活跃(active)、怀孕、授乳或者老年动物的组合物。总 之，特定的组合物包含适合于不同发育阶段或年龄的动物的能量和营养需 求。

本发明的某些方面优选地与完全的和均衡的食物组合使用。根据本文 中所提供的某些实施方案，包含维生素D的组合物优选地与高质量的市 售食物一起使用。如本文中所用，“高质量的市售食物”指生产的饮食， 以产生80％或者以上消化率的关键营养物，关键营养物如例如上述国家 研究委员会对狗的推荐中所述或者在美国饲粮管理协会(the Association  of American Feed Control Officials)的指南中所述。

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含如上所述的 本发明组合物和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。通常，通过将 化合物或组合物与赋形剂、缓冲液、粘合剂、成型剂、着色剂、稀释剂、 浓缩剂(compressing agents)、润滑剂、调味剂、湿润剂等(包括本领 域技术人员已知的用于产生适合于作为药物施用给动物的药物和配制组 合物的其他成分)混合，来制备药物组合物。可以配制药物组合物用于 任一模式的施用。在一个实施方案中，配制的药物组合物用于如上所述 的口服施用。在另一个实施方案中，配制的组合物用于局部施用。合适 的局部制剂可以包括溶液、乳剂、乳膏、软膏、凝胶、脂质体、生物可 降解的微粒，以及药物化学家所熟知的其他此类递送载体。

在另一方面，本发明提供了试剂盒，用于将包含一种或多种形式的维 生素D的组合物施用给动物。根据试剂盒组分的需要，试剂盒以单独容 器的单独包装或者以单独容器的虚拟包装包括，(a)一种或多种形式的维 生素D，(b)一种或多种(1)适合于动物消耗的一种或多种其他成分；(2) 用于增加过氧化氢酶的产生或活性的一种或多种其他试剂，(3)一种或多 种抗氧化剂；(4)用于降低活性氧类别的一种或多种试剂；(5)一种或多 种益生菌；(6)一种或多种益生元；(7)适合于测定动物是否受益于用于 增加过氧化氢酶的产生或活性的组合物和方法的一种或多种诊断装置；(8) 如何合并或者制备维生素D，以及试剂盒中提供的用于给动物施用的任意 其他成分的说明；(9)如何使用组合的试剂盒组分、制备的试剂盒组分或 者其他试剂盒组分受益动物的说明；和(10)用于将组合的或者制备的试剂 盒组分施用给动物的装置。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定在细胞或动物中增加过氧化氢酶 的产生或活性的试剂或方案的方法，特别是鉴定以与维生素D(例如维生 素D的模拟物)的方式类似的方式在细胞或动物中增加过氧化氢酶的产 生或活性的试剂或方案的方法。该方法包括(a)在试剂或方案不存在的情 况下，通过测量细胞样品中编码过氧化氢酶、锰超氧化物歧化酶、铜-锌 超氧化物歧化酶和任选地，一种或多种谷胱甘肽过氧化物酶、甲状旁腺激 素相关的蛋白质、转化生长因子-β1和维生素D受体的基因的转录和翻 译产物，来测定第一基因表达谱；(b)在试剂或方案存在的情况下，通过 测量细胞样品中编码过氧化氢酶、锰超氧化物歧化酶、铜-锌超氧化物歧 化酶和任选地，一种或多种谷胱甘肽过氧化物酶、甲状旁腺激素相关的蛋 白质、转化生长因子-β1和维生素D受体的基因的转录和翻译产物，来 测定第二基因表达谱，和(c)将第一基因表达谱与第二基因表达谱比较， 其中第二基因表达谱中过氧化氢酶转录或翻译产物，而不是其他基因的转 录或翻译产物的增加表示该试剂或方案可能以与维生素D的方式类似的 方式增加细胞中过氧化氢酶的产生或活性。

用于测量基因表达或酶活性改变的测定法是本领域技术人员熟知的。 通常，基因表达测定法(1)通过测量转录的RNA，例如通过使用核酸探针 或引物的杂交或扩增测定，或者(2)通过测量蛋白质，例如通过免疫结合 测定，例如使用抗体探针的蛋白质印迹或ELISA测定，来测量选定基因 的转录或者翻译产物的改变。此外，用于测量一种或多种上面所列出的酶 的活性的测定法也是本领域熟知的。用于测量过氧化氢酶活性的测定法描 述于本文中实施例3中。

该类型的方法还可以包括将至少第二基因表达谱与参照基因表达谱 比较，所述参照基因表达谱通过在参照物质(例如骨化三醇，已经证明其 增加过氧化氢酶的产生或活性，即通过上调过氧化氢酶基因表达来实现) 存在的情况下，测量编码前述蛋白质的一种或多种基因的转录或翻译产物 获得。

测试基因表达谱和参照谱之间的比较可以是相对同时的，即并列地测 定细胞或组织。然而备选地，用于比较的参照可以是基于使用该方法以前 所获得的数据。

在一个实施方案中，在培养的细胞群体上进行该方法。在一个实施方 案中，在测试化合物或者参照化合物存在或者不存在的情况下，测量细胞 的转录或者翻译产物，即通过用与由上面所列的基因编码的mRNA特异 性杂交的探针或扩增引物检测，或者通过用与由该基因编码的蛋白质特异 性结合的抗体检测。备选地，可以在重组系统中使用报告基因。在任一个 实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞系，优选地起源于人类或者伴 侣动物，例如犬科动物或猫科动物。备选地，可以在新鲜分离自对象的细 胞或组织上进行该方法。

在另一个实施方案中，在动物上进行该方法。通常，将测试化合物或 者测试方案(饮食、训练等)施用给对象，并分析对象的选定组织中的基 因表达谱，以测定测试化合物对前述基因的转录或翻译的作用。可以原位 地或者离体外地分析基因表达，以测定测试化合物的作用。在另一个实施 方案中，将测试化合物或方案施用给对象，并根据本领域合适的任一方法 原位地或者离体外地分析基因所表达的蛋白质的活性，以测定测试化合物 对目的蛋白质的活性的作用。此外，在将测试化合物施用给对象的情况下， 还可以评价化合物的生理学作用、全身性作用和物理作用，以及化合物的 可能毒性。

在另一方面，本发明提供了通过本方法鉴定的物质或方案，所述方法 用于将当施用给个体时增加过氧化氢酶的产生或活性的试剂或方案鉴定 为可能增加过氧化氢酶的产生或活性的试剂或方案。归因于鉴定的方式， 所以至少就以与维生素D的方式类似的方式增加过氧化氢酶产生而言， 此类物质应当作为维生素D模拟物起作用。

在其他方面，本发明提供了试剂盒，其用于鉴定以与维生素D的方 式类似的方式，在细胞中增加过氧化氢酶的产生或活性的试剂或方案。该 类型的试剂盒包含：(1)适合于测量编码过氧化氢酶、锰超氧化物歧化酶、 铜-锌超氧化物歧化酶和任选地，一种或多种谷胱甘肽过氧化物酶、甲状 旁腺激素相关的蛋白质、转化生长因子-β1和维生素D受体的两种或两 种以上基因的转录和翻译产物的试剂，和(2)如何使用基因表达的测量来 测定试剂或方案是否以与维生素D的方式类似的方式，在细胞中增加过 氧化氢酶的产生或活性的说明。此类试剂盒还包含一种或多种：(1)维生 素D的样品；和(2)在预计细胞暴露于维生素D的情况下，交流编码过氧 化氢酶、锰超氧化物歧化酶、铜-锌超氧化物歧化酶和任选地，一种或多 种谷胱甘肽过氧化物酶、甲状旁腺激素相关的蛋白质、转化生长因子-β1 和维生素D受体的基因的表达水平的信息。

在另一方面，本发明提供了用于有关以下一种或多种信息或说明的 交流的手段：(1)在动物中增加过氧化氢酶产生或活性的益处；(2)将维 生素D的类型、用于增加过氧化氢酶的产生或活性的其他试剂、抗氧化 剂、用于降低活性氧类别的试剂、益生菌、益生元和适合于动物消耗的其 他成分中的一种或多种混合，以产生用于在动物中增加过氧化氢酶的产生 或活性的组合物，(3)用于将组合物施用给动物的说明，(4)用于测定动 物是否受益于增加的过氧化氢酶产生或活性的信息，和(5)涉及筛选维生 素D种类增加过氧化氢酶的产生或活性的能力的信息，用于交流的手段 包括含有信息或说明的物理或电子文件、数字存储介质、光学存储介质、 声学报告、视听显示、可视显示的一种或多种。这些交流手段可以包括 显示的网址、可视显示kiosk、小册子、产品标签、包装说明书、广告、 散发材料、公告、录音带、录影带、DVD、CD-ROM、计算机可读芯片、 计算机可读卡、计算机可读盘、USB装置、FireWire装置、计算机存储 器和它们的任一组合的一种或多种。此外，交流手段用于说明使用本发 明的益处和为本发明的消费者或使用者提供联系信息，以在使用或者解 释本发明结果时获得帮助。

在另一方面，本发明提供了包含本发明组合物和贴在包装上的标签 的包装，所述标签含有文字、图片、设计、缩写、标语、短语或者其他 装置或者它们的组合，其表明该包装的内含物含有适合用于在动物中增 加过氧化氢酶的量或活性的组合物。通常，在包装上，该装置包含词语 “改善抗氧化应答”、“减轻氧化应激”、“帮助动物保持在其全盛时 期”、“促进健康和保健”或类似的词语。可以将适合于含有该组合物 的任一包装或包装材料用于本发明，例如生产自纸、塑料、箔、金属等 的包、箱、瓶、罐、袋等。在优选的实施方案中，根据标签，包装含有 适合于特定动物，例如人类、犬科动物或猫科动物的食物组合物，优选 地伴侣动物食物组合物。

在另一方面，本发明提供维生素D制备药物的用途。药物用于在动 物中增加过氧化氢酶的产生或活性、促进动物的健康和保健、延长动物的 全盛时期，以及提高动物的生活质量。在多种实施方案中，药物还包含在 动物中用于增加过氧化氢酶产生或活性或者用于降低或去除活性氧类别 的一种或多种其他试剂。通常，通过将维生素D与赋形剂、缓冲液、粘 合剂、成型剂、着色剂、稀释剂、浓缩剂、润滑剂、调味剂(flavorant)、 湿润剂，以及本领域技术人员已知的用于产生适合于作为药物施用给动 物的药物和配制组合物的其他成分混合，来制备药物。在多种实施方案 中，药物还包含益生菌、益生元或其组合。

在另一方面，本发明提供了用于产生包含至少一种维生素D和用于 在动物中增加过氧化氢酶产生或活性或者用于降低或去除活性氧类别的 一种或多种其他试剂的组合物的方法。该方法包括将维生素D与一种或 多种其他试剂混合。试剂是用于在动物中增加过氧化氢酶产生或活性或者 用于降低或去除活性氧类别的任一化合物或其他物质。当组合物是食物 时，组合物可以包含适合于被动物消耗的一种或多种其他成分，例如，蛋 白质、脂肪、碳水化合物、纤维、维生素、矿物质、益生菌、益生元等。 备选地，该方法包括根据需要，将维生素D、试剂和其他成分单独地或者 以任意组合应用于食物上，例如作为涂层或糕点上的装饰配料(topping)。 在食物的生产和/或加工期间，可以在任一时间加入维生素D。这包括， 例如将维生素D和其他选定的成分混合，作为食物组合物“主体”的核 心配方的一部分或者将它们用作为涂层，即主要在其生产后用于食物的表 面。可以根据本领域适合的任一方法制备组合物。

实施例

通过以下实施例可以进一步说明本发明，但是应当理解，除非另外特 别指出，包括的这些实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。

实施例1

在37℃，在5％CO₂的湿度环境中，将犬膀胱移行细胞癌(cbTCC) 细胞培养于补充了5％FBS、5％新生小牛血清和青霉素-链霉素(GIBCO BRL，Grand Island，NY，USA)的DMEM培养基中。将细胞以50,000 个细胞/ml接种在6孔培养板(Corning Incorporated Life Sciences，Acton， MA，USA)中，并在处理前温育24小时。对于蛋白质印迹分析，将细 胞用10^-7M和10^-9M的骨化三醇(1α，25-二羟基维生素D₃)和10^-9M的 西奥骨化醇(EB1089，1a，25-二羟基-22，24-二烯-24，26，27-三高维生素D) 处理24个小时。对于酶活性分析，将细胞用10^-7M和10^-9M的骨化三醇， 以及10^-9M的西奥骨化醇和10^-9M的类似物V(1α，25-二羟基-16-烯-23- 炔-维生素D₃)处理24个小时。对于基因表达分析，将细胞用10^-7M和 10^-9M的骨化三醇和10^-7M和10^-9M的西奥骨化醇处理24个小时。处理 进行至少3次重复。全部对照中运载体(乙醇)的终浓度为不到培养基 的0.1％。

实施例2

均化收获的细胞，并分析生产的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、铜/ 锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧 化物酶(GPX)。离心后收集细胞裂解物，并定量总蛋白质。在预制的 10％聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的总蛋白质(20或40μg)，并电转移至 硝酸纤维素膜。在4℃，通过添加Tris缓冲液(TBS)中的5％脱脂乳， 过夜封闭转印的(transblotted)膜。在37kD(绿色带)和25kD(粉红 带)分子量处切割膜。将膜的上部进行CAT、GPX和β-肌动蛋白染色， 并且将膜的下部进行MnSOD和Cu/ZnSOD染色。按以下稀释度使用针 对特定蛋白质的初级抗体：1∶2000的兔抗人MnSOD(Upstate Biotech)； 1∶2000的绵羊抗人Cu/ZnSOD(Calbiochem)；1∶1000的绵羊抗人过氧 化氢酶(Bidesign)；和1∶500的绵羊抗人GPX(Biodesign)。按1∶2000 使用其各自的IgG-HRP缀合的第二抗体。数据报告为相对于对照的蛋白 质条带的强度(与β-肌动蛋白水平归一化)(将对照看作百分之一百)。 CAT、MnSOD和Cu/ZnSOD，n＝7；GPX，n＝4。在将数据转变成对照 的百分比之前，进行假定方差均等的单尾配对的t检测，以测定显著性差 异。结果显示于表1中。

表1

通过蛋白质印迹分析测定的蛋白质表达

数值表示为相对于对照的蛋白质条带的平均百分比强度±标准 差。与对照比较的显著性差异：^＊＝p＜0.05。

实施例3

根据厂商说明，使用来自Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI 的测定试剂盒测定过氧化氢酶的酶活性。该测定法基于最佳浓度H₂O₂存 在的情况下酶与甲醇的反应，使用CAT的过氧化功能测定酶活性。用4- 氨基-3-联氨基-5巯基-1，2，4-三唑(Purpald)作为发色团，分光度测定法 测量所产生的甲醛。Purpald与醛特异性形成二环杂环，其基于一旦氧 化其从无色改变从无色变成紫色。使用分光光度板读取器在540nm读 取吸收吸光度。从来自已知样品的标准曲线并通过提供的等式计算结果。 据此，将CAT的酶活性推导为nmol/min/ml CAT。样品进行三次重复。 进行假定方差均等的单尾t检测，以测定显著性差异。结果显示于表2中。

表2

过氧化氢酶的酶活性

数值表示为nmol/min/ml CAT的平均值±标准差。与对照比较的 显著性差异：^＊＝p＜0.05和^＊＊＝p＜0.01。

实施例4

使用来自Ambion Inc.(Austin，TX，USA)的试剂盒 分离总RNA。简言之，胰蛋白酶化经处理的细胞(在恒温箱中在37℃)， 并通过手持式电子匀浆器(在4℃)均化。然后根据试剂盒 提供的方法，将细胞裂解物进行总RNA分离，并储存于-80℃。纯化得到 的RNA并使用乙醇沉淀浓缩至～1000ng/ul。将RNA重悬于DEPC水， 并通过DNAse I处理去除残留的DNA。根据厂商说明，将来自Ambion (货号1906)的DNA-free^TM DNAse处理试剂盒用于DNAse I处理。使 用NanoDrop分光光度计定量纯化的RNA，并按照RNA nano chip试剂 盒(货号5067-1511)方法，使用Agilent2100生物分析仪检查完整性。

定量PCR。进行定量PCR，以测定相对于对照(n＝5)，经10^-7M (n＝5)和10^-9M(n＝5)的骨化三醇，以及10^-7M(n＝3)和10^-9M(n＝3) 的西奥骨化醇处理细胞24小时的RNA表达改变。根据厂商说明，使用 RT-PCR的Super第一链合成系统(Invitrogen#11904-018) 进行反转录酶反应。对于每一样品反应，将1μg的RNA加入到DEPC处 理的&无核酸酶的H₂O(Fisher#BP561-1)中，至11.4uL的终体积。 使用每一反应(样品)1.5μL10mM dNTP、1.5μL随机六聚物和0.6μL Oligo  dT引物制备主混合物。将3.6uL的主混合物加入到每一样品中。使用 GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)，在68℃温育样品10 分钟，并然后降低到4℃至少1分钟。移去部分(0.25X)上述反应物， 并用作为负RT反应(含No Super Script反转录酶的阴性对照)。使 用相同的SuperScript反转录酶试剂盒，制备含3μL的10X RT缓冲 液、6μL的25mM MgCl2、3μL0.1M DTT和1.5μL RNA酶抑制剂的主 混合物。每一样品移去一部分(0.25X)，并加入0.375μL H₂O，作为负 RT主混合物。将3.75μL加入到每一负RT样品中。对于剩余的主混合物， 每一样品加入1.125μL Super Script反转录酶，作为正RT主混合物。 将11.25μL加入到每一正RT样品中。然后使用GeneAmp PCR System  9700，在42℃温育全部反应1小时，在95℃煮沸5分钟，并降低至4℃。 然后稀释样品，将1份RT反应物加入到29份TE缓冲液PH＝8.0(Ambion  #9858)中，以产生用于实验的cDNA的储液。

基于选定的序列，用标准的厂商默认值，使用Primer ExpressTM版 本3.0设计引物和5’核酸酶测定探针(Applied Biosystems Primer  实时定量PCR引物指南和探针设计指南)。小沟结合探针(ABI  Custom Oligo Synthesis Factory)订购自ABI。用DEPC H₂O重构全部寡 聚物至100μM的储存浓度，并然后用DEPC H₂O稀释成5μM的工作储 液浓度。根据厂商说明，将Fast Universal PCR主混合物(2X) (Applied Biosystems#4352042)用于定量PCR反应。最终引物浓度为 每一种300μM，并且最终探针浓度为200μM(根据早期实验最佳测定的)。 将3.2μl的正RT和负RT反应物用于终体积为20μL的定量PCR反应。 全部阳性反应进行三次重复，并且单独进行阴性反应。在20μL终体积中， 所使用的标准qPCR条件如Fast Universal主混合物(Applied  Biosystems，95.0℃持续20秒和40-50循环的95℃持续3秒然后60℃持 续30秒)中所述。使用ABI SDS软件版本1.3。在ABI Prism7500Fast 实时PCR系统上运行样品。

针对每一引物/探针组，特殊地运行全部样品，以测定应当将哪个样 品用作为标准曲线。使用连续稀释的RNA产生标准曲线，所述RNA来 自对大多数目标都显示出最低CT(循环阈值)的实验样品。将低CT样 品再反转录，并将1∶10连续稀释用作为全部引物/探针组的标准曲线。然 后通过使用标准曲线和平均输入量，将循环阈值用于计算输入量。将数值 与通过定量PCR所测定的亲环蛋白A(肽基脯氨酰异构酶A)水平归一 化。Induction计算自每一最低样品的归一化值。在无效假设上进行 Dunnett’s检验，其中每一处理组的平均值在99％置信区间(α＝0.01)等 于其共同的对照组的平均值。结果显示于表3中

表3

通过定量PCR测定的基因表达值

数值表示为平均值±平均值的标准误差。

^＊＊表示与对照比较，在99％置信区间的显著性差异。

在本说明书中，已经公开了本发明的一般优选实施方案。尽管使用 特定的术语，它们仅用于概括性或描述性目的，并不用于限制的目的。 本发明的范围将在权利要求中叙述。显然考虑到上述教导，本发明的许 多修饰和变化都是可能的。因此，应当理解，在所附的权利要求的范围 内，本发明可以以与具体描述不同的方式实施。