一种提高粳稻花药培养效率的方法

摘要

本发明公开了一种提高粳稻花药培养效率的方法，该方法为：首先按照粳稻花药培养基母液配方配制粳稻花药培养基母液，然后利用各种母液配制不同时期所用的诱导培养基、分化培养基、生根培养基，再将上述不同时期的培养基分别相对应的运用到粳稻花药愈伤组织的诱导、绿苗分化、生根三步成苗过程中。采用本发明后能够提高粳稻花药培养的成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率。

说明书

技术领域

本发明涉及粳稻花药培养领域，具体说是一种提高粳稻花药培养效率的方法

背景技术

花药培养是一种有效快速稳定变异材料的手段，自20世纪70年代开展水稻花药培养育种研究以来，花药培养已经发展成为一种成熟而又实用的水稻育种辅助手段；但同时花药培养存在愈伤组织诱导率和绿苗分化率低、成苗率不高的缺点。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题与不足，本发明的第一目的在于提供一种粳稻花药培养基母液以及利用该母液配制成的诱导培养基、分化培养基、生根培养基。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述各培养基提高粳稻花药培养效率的方法。

为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种粳稻花药培养基母液，包括母液A、母液B、母液C、母液D；其中：

母液A包括如下组分：按10倍浓度（即将母液A用水稀释10倍后母液A工作液浓度）计算，KNO₃30g/L、NH₄NO₃16.5g/L、KH₂PO₄5g/L、MgSO₄·7H₂O3.7g/L、CaCl₂4.4g/L；

母液B包括如下组分：按100倍浓度（即将母液B用水稀释100倍后母液B工作液浓度）计算，ZnSO₄·7H₂O500mg/L、MnSO₄·H₂O1000mg/L、H₃BO₃500mg/L、CuSO₄·5H₂O2.5mg/L、KI83mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O25mg/L、CoCl₂·6H₂O2.5mg/L；

母液C包括如下组分：按100倍浓度（即将母液C用水稀释100倍后母液C工作液浓度）计算，Na₂-EDTA5.6g/L、Fe₂(SO₄)₃·7H₂O4.3g/L；

母液D包括如下组分：按100倍浓度（即将母液D用水稀释100倍后母液D工作液浓度）计算，肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L、甘氨酸0.2g/L。

利用上述粳稻花药培养基母液配成的诱导培养基，包括如下组分：100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，5ml浓度为1mg/ml的2.4-D、蔗糖40g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1g/L、山梨糖醇20g/L、0.1mg/mL的玉米素0.8ml；pH为5.8。

上述诱导培养基的制备方法，具体如下：取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，5ml的浓度为1mg/ml的2.4-D,倒入1000ml的锥型瓶中，加水至600-700ml，混匀；再将水解酪蛋白1g、琼脂6g、蔗糖40g、山梨糖醇20g,倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8，得到混合溶液；用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将上述混合溶液移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，待混合溶液温度降至60-70℃，加入经过过滤除菌的0.1mg/mL玉米素0.8ml，混匀，缓缓倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了诱导培养基的配制。

利用上述粳稻花药培养基母液配成的分化培养基，包括如下组分：100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，2ml浓度为2mg/ml的6-BA、0.5ml浓度为0.5mg/ml的NAA，1ml浓度为2mg/ml的苯乙酸、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1g/L、山梨糖醇10g/L；pH为5.8。

上述分化培养基的制备方法，具体如下：取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，2ml浓度为2mg/ml的6-BA、0.5ml浓度为0.5mg/ml的NAA，1ml浓度为2mg/ml的苯乙酸倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀；然后将蔗糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白1g、山梨糖醇10g倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8；用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将分化培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了分化培养基的配制。

利用上述粳稻花药培养基母液配成的生根培养基，包括如下组分：100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1g/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/L；pH为5.8。

上述生根培养基的制备方法，具体如下：取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀；再将蔗糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白1g、山梨糖醇10g、多效唑2mg倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8；用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将生根培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养瓶中，待其自然凝固就完成了生根培养基的配制。

为了解决上述第二目的，申请人经过多年反复试验，在诸多花药培养方案中发现，以下方法可以很好地实现发明目的，具体如下：

一种提高粳稻花药培养效率的方法，该方法包括以下步骤：

1）按照上述粳稻花药培养基母液配方配制粳稻花药培养基母液；备用；

2）取孕穗期剑叶叶枕距2-5cm的幼穗，在8～10℃预处理7-10d，消毒；取花粉处于单核时期的花药接种在上述诱导培养基上进行离体培养；接种结束后将述诱导培养基移至智能光照培养箱，关闭培养箱中所有灯管，并用报纸或黑布遮盖培养箱透光处，防止外界光线射入，设定箱内温度为24-26℃，进行为期21-35天的暗处理，形成了愈伤组织；

3）将步骤2）中得到的愈伤组织转接到上述分化培养基上；智能光照培养箱，设定温度为24-26℃，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天；

4）愈伤组织在上述分化培养基上经过15天的分化形成根和芽，长出绿色小苗，将绿色小苗从分化培养基中转接到生根培养基上；智能光照培养箱，设定温度为27℃，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天，得到试管苗；

5）炼苗移植：绿色小苗转入上述生根培养基培养3日后,所有试管苗均开始发根，当试管苗绿苗长至7～8cm,，具有5～10条长约0.5～1cm长的根时,从试管中取出绿苗,洗去根部培养基,清水培养；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮阳网遮盖；一周后移种大田。

本发明具有以下有益效果：本发明方法适用于常规粳稻花药愈伤组织的诱导、绿苗分化、生根三步成苗过程，能够提高粳稻花药培养的成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率。

具体实施方式

本发明一种提高粳稻花药培养效率的方法包括以下步骤：

（1）粳稻花药培养基母液的配制

花药培养所使用的培养基母液主要包括四个部分：母液A、母液B、母液C、母液D，此外还包括一些植物生长调节剂。下表是其主要成分及其浓度：

表1：母液A：大量元素，按10倍浓度计算

表1中10倍MS培养基母液浓度作为对照组。10倍母液A浓度指的是母液A用水稀释10倍后的母液A工作液浓度。

表2母液B：微量元素，按100倍浓度计算

表2中100倍MS培养基母液浓度作为对照组。100倍母液B浓度指的是母液B用水稀释100倍后母液B工作液浓度。

表3母液C：铁盐，按100倍浓度计算

表3中100倍MS培养基母液浓度作为对照组。100倍母液C浓度指的是母液C用水稀释100倍后母液C工作液浓度。

表4母液D：有机元素，按100倍浓度计算

表4中100倍MS培养基母液浓度作为对照组。100倍母液D浓度指的是母液D用水稀释100倍后母液D工作液浓度。

植物生长调节剂在培养基中的使用情况：

植物生长调节剂本发明培养基类型MS培养基2.4-D诱导培养基MS培养基

玉米素诱导培养基无6-BA分化培养基MS培养基萘乙酸（NAA）分化培养基MS培养基苯乙酸分化培养基无

诱导培养基、分化培养基、生根培养基中所用的母液A、母液B、母液C、母液D均为未稀释过的母液。

（2）诱导培养基的配制及使用

取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，5ml的2.4-D（1mg/ml）,倒入1000ml的锥型瓶中，加水至600-700ml，混匀。用天平称取CH1g、Agar6g、Sugar40g、Sorbitol20g,倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节PH=5.8。用玻璃纸密封锥型瓶口，放入立式压力蒸汽灭菌器中灭菌。灭菌结束以后，将诱导培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，待培养基温度降至60-70℃，加入经过过滤除菌的0.1mg/mL玉米素0.8ml，混匀，缓缓倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了诱导培养基的配制。

取孕穗期剑叶叶枕距2-5cm的幼穗，在8～10℃预处理7-10d，消毒；取花粉处于单核时期的花药接种在上述诱导培养基上进行离体培养；接种结束后将述诱导培养基移至智能光照培养箱，关闭培养箱中所有灯管，并用报纸或黑布遮盖培养箱透光处，防止外界光线射入，设定箱内温度为24-26℃，进行为期21-35天的暗处理，形成了愈伤组织；

诱导培养基中植物生长调节剂成分对比

诱导培养基MS培养基蔗糖(sucrose)40g/L30g/L琼脂(agar)6g/L7g/L水解酪蛋白（CH）1g/L无山梨糖醇（sorbitol）20g/L无

（3）分化培养基的配制及使用

取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、2ml的6-BA(2mg/ml)、0.5ml的NAA(0.5mg/ml)，1ml的苯乙酸(2mg/ml)倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀。用天平称取CH1g、Agar6g、Sugar30g、Sorbitol10g,倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节PH=5.8。用玻璃纸密封锥型瓶口，放入立式压力蒸汽灭菌器中灭菌。灭菌结束以后，将分化培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了分化培养基的配制。

花药在经过诱导培养基21-35天的离体培养，形成了愈伤组织，将愈伤组织转接到分化培养基上。智能光照培养箱，设定温度为24-26℃，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天。

分化培养基植物生长调节剂成分对比

分化培养基MS培养基蔗糖(sucrose)30g/L30g/L琼脂(agar)6g/L7g/L水解酪蛋白（CH）1g/L无山梨糖醇（sorbitol）10g/L无

（4）生根培养基的配制

取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D，倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀。用天平称取CH1g、Agar6g、Sugar30g、Sorbitol10g,多效唑2mg，倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节PH=5.8。用玻璃纸密封锥型瓶口，放入立式压力蒸汽灭菌器中灭菌。灭菌结束以后，将生根培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养瓶中，待其自然凝固就完成了生根培养基的配制。

生根培养基植物生长调节剂成分对比

生根培养基MS培养基蔗糖(sucrose)30g/L30g/L琼脂(agar)6g/L7g/L水解酪蛋白（CH）1g/L无山梨糖醇（sorbitol）10g/L无多效唑2mg/L无

（5）愈伤组织在上述分化培养基上经过15天的分化形成根和芽，长出绿色小苗，将绿色小苗从分化培养基中转接到生根培养基上；智能光照培养箱，设定温度为27℃，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天，得到试管苗；

(6）炼苗移植：绿色小苗转入上述生根培养基培养3日后,所有试管苗均开始发根，当试管苗绿苗长至7～8cm,，具有5～10条长约0.5～1cm长的根时,从试管中取出绿苗,洗去根部培养基,清水培养；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮阳网遮盖；一周后移种大田。

通过以上本发明和MS培养基的对比结果来进一步阐述本发明的有益效果，结果如下：

1.同MS培养基相比，在诱导培养基、分化培养基中添加了水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇这2种成分。水解酪蛋白（CH)是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，能提高诱导分化的效率；山梨糖醇能够改善愈伤组织的质量，使绿苗分化率显著提高。通过试验发现，在普通MS培养基的条件下，接种1000份花药，未添加水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇的培养基出愈率为12.5%,绿苗分化率为16.1%;添加水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇的培养基的出愈率为17.3%,绿苗分化率为21.6%。

2.同MS培养基相比，在诱导培养基中添加了玉米素，玉米素在与植物激素2.4-D混用的条件下，快速促进了愈伤组织的诱导。通过试验发现，在普通MS培养基的条件下，接种1000份花药，未添加玉米素的培养基出愈率为12.5%，添加玉米素的培养基的出愈率为14.7%。

3.同MS培养基相比，在分化培养基中添加了苯乙酸，苯乙酸在与植物激素6BA、NAA混用的条件下，快速促进了愈伤组织的分化。通过试验发现，在普通MS培养基的条件下，接种1000份花药，未添加苯乙酸的培养基绿苗分化率为16.1%，添加玉米素的培养基的出愈率为18.7%。

4.根系发达,移栽后成活率高。本发明中所使用的生根培养基中添加了2mg/L多效唑（三唑类植物生长调节剂，是内源赤霉素合成的抑制剂，可明显减弱顶端生长优势，促进侧芽滋生，茎变粗，植株矮化紧凑），能克服组织培养中试管苗长势较弱,根系不发达的缺点,具有降低苗高,促进根系发育,健壮幼苗的作用，移栽后成活率极高。

5.使用三步成苗法，对诱导、分化、生根三个不同发育阶段的营养成分及浓度进行精细的调整和量化，更加有利于愈伤组织的诱导、分化，花药培养成苗、壮苗。