一种植物组培过程中染菌试管苗的生根方法及其应用

摘要

本发明涉及一种植物组培过程中染菌试管苗的生根方法及其应用。该方法将植物组培过程中染菌试管苗直接浸泡在浓度为0.1～0.3mg/mL的生根诱导剂水溶液中进行浸泡处理，然后将经过生根诱导剂浸泡处理的染菌试管苗直接移栽到装有含水量大约为55%～70%（体积）左右的蛭石炼苗钵中，并用一次性透明塑料杯反过来扣在炼苗钵中的苗上；在蛭石炼苗钵中生根2～4周后再移栽到土壤中。本发明方法可以使原来只能丢弃的染菌的组培试管苗长出根，从而实现了拯救染菌的试管苗的目的，这对解决现有的植物组培研究中，因为解决因染菌造成的试管苗大量损失提供了一种新的手段。

说明书

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，涉及一种拯救植物组培过程中染菌试管苗的 方法，具体说来，涉及一种植物组培过程中染菌试管苗的生根方法及其应用。

背景技术

甘蓝型油菜转基因过程中通常采用下胚轴或子叶柄为外植体，将外植体与根 癌农杆菌共培后，通过组培和抗性筛选来获得试管苗，然后将试管苗转到生根培 养基上诱导生根。只有在抗性苗分化出根后，移栽到土壤里才能成活。

在组培过程中，因为操作和环境中微生物含量的原因，时常发生霉菌污染， 特别是在我国南方地区的雨季，试管苗污染经常发生。试管苗一旦被细菌或真菌 污染，再转到生根培养基上就难以再生根，现有的处理方法是将被污染的苗灭菌 后丢弃。尤其是被细菌或霉菌污染严重的时候，一批组培苗要全部丢弃。

为了提高获得转基因植株的概率，如果能够找到一种方法能让已经被霉菌污 染了的试管苗也能及时长出不定根，这样就可以大大降低试管苗的损失，极大地 提高试管苗的成活率和获得转基因甘蓝型油菜植株的概率。

但是，现有技术中还没有拯救植物组培过程中染菌试管苗的技术。因此，目 前存在的问题是需要研究开发一种使植物组培过程中染菌试管苗生根的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用高浓度生 根诱导剂水溶液直接处理染菌的试管苗，并将经生根诱导剂处理的试管苗直接转 移到蛭石中进行生根，从而实现拯救染菌的试管苗的目的，这对解决现有的植物 组培研究中，因为解决因染菌造成的试管苗大量损失提供了一种新的手段。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种植物组培过程中染菌试管苗的生 根方法，包括：

步骤A，将植物组培过程中染菌试管苗的基部浸入生根诱导剂水溶液进行浸 泡处理；

步骤B，将经过生根诱导剂浸泡处理的试管苗移栽至炼苗装置中；

步骤C，用罩体罩住经过生根诱导剂处理的试管苗进行生根培养。

本发明中所述用语“染菌”是指试管苗的基部被细菌或霉菌污染，出现变质的 现象。

本发明所述用于“染菌试管苗”是指基部被被细菌或霉菌污染，甚至因此发生 变质的无根试管苗。

本发明中所述用语“组培”是指植物组织培养，具体说来，是指在含有营养物 质及植物生长物质的培养基的无菌器皿中，培养离体植物组织（器官或细胞）并 诱导使其长成完整植株的技术。

本发明中所述用语“试管苗”是指在试管等容器内经无菌培养获得的完整植株 小苗。

所述用语“抗性试管苗”是指能在含有抗生素或除草剂的培养基上正常生长的 试管苗。

本发明中所述用语“炼苗”是指在适当控制温度、湿度、气体交换等条件下， 使试管苗从完全人工控制的条件下逐步适应大气环境的过程。

本发明中所述用语“不定根”是指不是直接或间接由胚根所形成，而是从茎、 叶、愈伤组织或其它部位生长出来，没有固定的生长部位的根。

本发明所述用语“罩体”是指所有能实现透光、透气和保湿的具有覆盖和保护 作用的罩体，例如，其可以是塑料杯、带孔玻璃杯等。

根据本发明，在步骤A中，所述浸泡处理的时间为3～10秒。

根据本发明，在步骤A中，所述生根诱导剂水溶液的浓度为0.1～0.3mg/mL； 优选为0.1～0.2mg/mL。

本发明中，所述生根诱导剂包括吲哚乙酸和/或吲哚丁酸。

根据本发明，在步骤B中，炼苗装置中含有蛭石和水。

根据本发明，所述炼苗装置中含水量为55～70%（体积）；优选为65%（体 积）。

根据本发明，在步骤C中，生根培养时间为2～4周；优选为2周。

在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括在步骤A之前切除染菌试管苗 的基部的变成褐黑色的部分。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在步骤C之后，将生根培养 后的试管苗移栽到土壤中的步骤。

本发明还提供了一种根据本发明上述生根方法在油菜组培过程中的染菌试 管苗生根中的应用。

在本发明的一个具体实施例中，用蒸馏水洗去在甘蓝型油菜转基因组培过程 中被霉菌污染的试管苗基部的霉菌污染物，切除试管苗基部变褐黑色的部分，但 是要避免伤到绿色组织；然后将试管苗基部直接浸在高浓度吲哚丁酸（0.1～ 0.3mg/mL）溶液中3～10秒，不需经过在生根培养基上生根的阶段，直接将经过 吲哚丁酸浸泡处理的试管苗移栽到装有含水量大约为55%～70%（体积）的蛭石 炼苗钵中，用一次性透明塑料杯反过来扣在炼苗钵中的苗上；然后在蛭石炼苗钵 中生根2～4个星期后再移栽到土壤中。

现有技术中上没有拯救组培过程中染菌试管苗的技术，而且，在现有技术组 培过程中，将组培过程中染菌试管苗的基部浸入生根诱导剂水溶液进行浸泡处理 后，经过吲哚丁酸浸泡处理的试管苗需要经过在生根培养基上生根的阶段，才能 移栽到炼苗钵中炼苗。本发明采用高浓度生根诱导剂水溶液直接处理染菌的试管 苗，并将经生根诱导剂处理的试管苗直接转移到蛭石中进行生根，从而实现拯救 染菌的试管苗的目的，这对解决现有的植物组培研究中，因为解决因染菌造成的 试管苗大量损失提供了一种新的拯救手段。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施 例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体 实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：0.1mg/mL吲哚丁酸处理真菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自甘蓝型油菜湘油15号下胚轴的32颗真菌 污染的无根试管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的真菌污染物，切除试管苗基 部变褐黑色的部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.1mg/mL的吲哚丁酸水溶液中浸 泡3秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为65%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗15天后，32颗无根试管苗有31颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥2.5厘米，每个试管苗不定根数平均为3.5根，将31株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

由此可见，来自甘蓝型油菜湘油15号下胚轴的试管苗，受真菌污染后，经 0.1mg/mL吲哚丁酸处理后成活。

实施例2：0.2mg/mL吲哚丁酸处理细菌污染试管苗的生根试验

1.细菌污染试管苗的处理。将来自甘蓝型油菜GX27下胚轴的21颗细菌污染 的无根试管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的霉菌污染物，切除试管苗基部变 褐黑色的部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.2mg/mL的吲哚丁酸水溶液中浸 泡10秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭 石的含水量为65%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米 左右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗15天后，21颗无根试管苗有21颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥2.7厘米，每个试管苗不定根数平均为3.8根，将21株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

由此可见，来自甘蓝型油菜GX27下胚轴的试管苗，受细菌污染后，经 0.2mg/mL吲哚丁酸处理后成活。

实施例3：0.1mg/mL吲哚乙酸处理真菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自甘蓝型油菜湘油15号下胚轴的37颗真菌 污染的无根试管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的真菌污染物，切除试管苗基 部变褐黑色的部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.1mg/mL的吲哚乙酸水溶液中浸 泡5秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为65%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗15天后，37颗无根试管苗有35颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥2.9厘米，每个试管苗不定根数平均为3.3根，将35株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

由此可见，来自甘蓝型油菜湘油15号下胚轴的试管苗，受真菌污染后，经 0.1mg/mL吲哚乙酸处理后成活。

实施例4：0.1mg/mL吲哚乙酸处理真菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自白菜B1下胚轴的30颗真菌污染的无根试 管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的真菌污染物，切除试管苗基部变褐黑色的 部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.1mg/mL的吲哚乙酸水溶液中浸 泡5秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为65%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗15天后，30颗无根试管苗有30颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥2.6厘米，每个试管苗不定根数平均为3.2根，将30株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

由此可见，来自白菜B1下胚轴的试管苗，受真菌污染后，经0.1mg/mL吲哚 丁酸处理后成活。

实施例5：0.2mg/mL吲哚丁酸处理细菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自甘蓝G3下胚轴的41颗细菌污染的无根试 管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的细菌污染物，切除试管苗基部变褐黑色的 部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.2mg/mL的吲哚丁酸水溶液中浸 泡5秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为65%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗15天后，41颗无根试管苗有38颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥2.1厘米，每个试管苗不定根数平均为3.8根，将38株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

来自甘蓝G3下胚轴的试管苗，受细菌污染后，经0.2mg/mL吲哚丁酸处理后 成活。

实施例6：0.3mg/mL吲哚丁酸处理细菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自甘蓝G3下胚轴的33颗细菌污染的无根试 管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的细菌污染物，切除试管苗基部变褐黑色的 部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.3mg/mL的吲哚丁酸水溶液中浸 泡5秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为55%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗21天后，33颗无根试管苗有30颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥3.1厘米，每个试管苗不定根数平均为3.2根，将30株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

来自甘蓝G3下胚轴的试管苗，受细菌污染后，经0.3mg/mL吲哚丁酸处理后 成活。

实施例7：0.3mg/mL吲哚乙酸处理真菌污染试管苗的生根试验

1.真菌污染试管苗的处理。将来自白菜B1下胚轴的26颗细菌污染的无根试 管苗取出，用蒸馏水洗去试管苗基部的细菌污染物，切除试管苗基部变褐黑色的 部分，但是要避免伤到绿色组织。

2.浸泡与炼苗，将清理好的试管苗的基部在0.3mg/mL的吲哚乙酸水溶液中浸 泡5秒后，迅速将浸泡过的试管苗转移到装有蛭石的直径为8厘米小钵中，蛭石 的含水量为70%左右，每钵移一颗无根试管苗。再用一个底部开有2个3毫米左 右小孔的一次性透明塑料反扣在试管苗上，让其炼苗的同时生长出不定根。

3.移栽，炼苗28天后，26颗无根试管苗有24颗试管苗生长出了不定根，平 均根长≥3.7厘米，每个试管苗不定根数平均为2.9根，将24株带根的苗移栽到带 有营养土的直径为30厘米的钵中。

来自白菜B1下胚轴的试管苗，受真菌污染后，经0.3mg/mL吲哚乙酸处理后 成活。

通过上述实施例可以看出，本发明方法可以使原来只能丢弃的染菌的组培试 管苗长出根，从而实现了拯救染菌的试管苗的目的，这对解决现有的植物组培研 究中，因为解决因染菌造成的试管苗大量损失提供了一种新的手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。例如，本发明同样适用于染菌的抗性试管苗。