通过3-羟基链烷酸的组合酶促转化来产生烯

摘要

本发明涉及一种通过生物学过程产生烯的方法。更具体地，本发明涉及一种从3-羟基链烷酸（或其酸根）型分子产生烯(例如丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。

说明书

本发明涉及一种通过生物学过程产生烯的方法。更具体地，本发明涉 及一种用于从3-羟基链烷酸（或其酸根）型分子产生烯(例如丙烯、乙烯、 1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。

众多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的 丁烯、或戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业和在化学工业其 他领域和燃料领域中使用。

乙烯，最简单的烯，在工业有机化学中居核心地位：它是世界上最广 泛产生的有机化合物。它特别用来产生聚乙烯，这是一种主要塑料。乙烯 也可以通过(氧化、卤化)反应转化成许多工业上有用的产品。

丙烯发挥类似重要的作用：其聚合产生塑性材料-聚丙烯。就抵抗性、 密度、实度、可变形性和透明性而言，这种产物的技术特性是无可匹敌的。 自1954年其发明以来，世界范围的聚丙烯产量已经连续增长。

丁烯以四种形式存在，其中之一（异丁烯）进入甲基叔丁基醚 (MTBE)(汽车燃料的抗震添加剂)的组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛 烯，所述异辛烯转而可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高 辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。

根据双键的位置和构型，戊烯、己烯和庚烯以许多形式存在。这些产 物具有实际的工业应用，但是与乙烯、丙烯或丁烯相比较不重要。

全部这些烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭 或天然气中通过Fisher-Tropsch工艺的衍生物)产生。它们的成本因此天然 地与油价挂钩。另外，催化性裂解有时与增加工艺复杂性和生产成本的巨 大技术难题相关。

与上述考虑无关，塑料的生物产生(“生物塑料”)是一个蓬勃兴起的领 域。这种繁荣受与油价相关的经济顾虑并且受既有全球性(碳中和产物)又 有地区性(废物管理)的环境考虑推动。

生物塑料的主要家族是聚羟基链烷酸（或其酸根）(PHA)家族。这些 是通过缩合同时包含酸基和醇基的分子所获得的聚合物。缩合通过在以下 单体的醇上的酯化酸发生。这个酯键不如常规塑料的聚合物中存在的直接 碳-碳键那样稳定，这解释了PHA为何具有若干周至若干个月的生物可降解 性。

PHA家族尤其包括聚-3-羟丁酸（或其酸根）(PHB)，它是3-羟丁酸（或 其酸根）的聚合物；和聚羟丁酸（或其酸根）-戊酸（或其酸根）(PHBV)， 它是3-羟丁酸（或其酸根）和3-羟基戊酸（或其酸根）的交替聚合物。

PHB天然地由一些细菌菌株如真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus) 和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)产生。已经构建了具有集成合成途径 的实验室细菌，如大肠杆菌，所述集成合成途径通常导致PHB或PHA。化 合物或其聚合物可以在某些实验室条件下占据多达80%的细菌质量(Wong  MS等人,Biotech.Bioeng.99(2008),919-928)。在20世纪80年代尝试工业规 模生产PHB，但是在当时认为通过发酵产生这种化合物的成本过高。涉及 在(已经集成了细菌生产者中存在的PHB合成途径关键酶的)遗传修饰植物 中直接生产这些化合物的项目正在推进并且可能意味着较低的运行成本。

在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运行背景中，需要生物学产 生可以用作燃料或用作合成树脂的前体的链烷或其他烃分子。由于发酵和 蒸馏工艺已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料在于乙醇的发酵生 产。第二代生物燃料的生产处于探索期，尤其包括生产长链醇(丁醇和戊 醇)、萜烯、直链链烷和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总 体概述：Ladygina N等人,Process Biochemistry,2006,41:1001；和Wackett  LP,Current Opinions in Chemical Biology,2008,21:187。

在烯化学家族中，异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是经聚合导致橡胶的萜 烯模体。其他萜烯可能通过化学途径、生物学途径或混合途径形成，作为 可用产物如生物燃料或以便制造塑料。最新文献显示，可以利用甲羟戊酸 途径(许多生物的类固醇生物合成中的关键中间体)以便从萜烯家族以工业 产率高效地产生产物(Withers ST等人,Appl.Environ.Microbiol.,2007, 73:6277)。

显然，较少地充分研究烯、尤其终端烯[在位置2处单取代或二取代的 乙烯：H₂C=C(R¹)(R²)]的产生。已经描述通过小红酵母(Rhodotorula minuta) 使异戊酸（或其酸根）转化成异丁烯(Fujii T.等人,Appl.Environ. Microbiol.,1988,54:583)，但是以极低周转次数值为特征的这个反应的效 率(k_cat是1x10^-5sec^-1)远未允许工业应用。反应机理由Fukuda H等人(BBRC, 1994,201(2):516)阐明并且涉及通过还原氧代铁(oxoferryl)基团Fe^V=O使异 戊酸（或其酸根）脱羧的细胞色素P450酶。这个反应绝不涉及异戊酸（或 其酸根）的羟化。异戊酸（或其酸根）也是亮氨酸分解代谢中的中间体。 通过这种途径大规模生物合成异丁烯似乎是高度不利的，因为它将需要合 成和降解一分子的亮氨酸以形成一分子的异丁烯。另外，催化此反应的酶 使用血红素作为辅因子，这不利于细菌中的重组表达和酶参数的改善。出 于全部这些原因，很不可能的是，现有技术的这种途径可以充当工业利用 的基础。已经将其他微生物描述为能够略微地从异戊酸（或其酸根）天然 产生异丁烯；获得的产量甚至低于用小红酵母获得的那些产量(Fukuda H. 等人,Agric.Biol.Chem.,1984,48:1679)。

相同的研究也已经描述丙烯的天然产生：许多微生物能够产生丙烯， 再次说明的是伴随极低产率。植物产生乙烯已经是长久已知的(Meigh等人, 1960,Nature,186:902)。根据阐明的代谢途径，甲硫氨酸是乙烯的前体 (Adams和Yang,PNAS,1979,76:170)。也已经描述了2-酮戊二酸（或其酸 根）的转化(Ladygina N等人,Process Biochemistry2006,41:1001)。由于产 生二碳分子的乙烯消耗一个4碳或5碳分子前体，所以这些途径似乎在物质 上和在能量上不利于它们的工业应用。

因此，需要用于产生烯类如乙烯、丙烯、1-丁烯、异丁烯、1-戊烯或 异戊烯的高效方法。

WO2010/001078描述了一种用于通过采用具有脱羧酶活性的酶以酶 促方式转化3-羟基链烷酸而产生烯的方法。这种方法是有利的，因为它有 助于避免使用石油产物、有助于降低产生塑料和燃料的成本并且可以通过 允许碳以固体形式贮存而产生巨大的全球环境影响。虽然WO2010/001078 中描述的方法允许通过酶促转化3-羟基链烷酸（或其酸根）产生烯，但是 仍需要改善这种方法，尤其在其效率方面，从而使其适合于工业目的。本 申请解决了这种需求。

本发明描述一种通过生物学过程尤其酶促过程从3-羟基链烷酸（或其 酸根）开始而产生烯化合物的方法，其中组合两种类型的酶以增加产生率 这一效率。更具体地，本发明涉及一种用于产生烯的方法，其特征在于它 包括通过以下酶使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成所述烯

(i)具有使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3-膦羧基氧基链 烷酸（或其酸根）（3-phosphonoxyalkanoate）的活性的第一酶；和

(ii)与第一酶不同并且具有使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根） 转化成所述烯的活性的第二酶。

本发明还涉及至少两种酶的用途，其中一种酶选自如上所述的(i)并且 另一种酶选自如上所述的(ii)，或所述酶组合的微生物的用途，用于从3-羟 基链烷酸（或其酸根）产生烯化合物。

本发明还涉及产生至少两种酶的生物，优选地微生物，其中一种酶选 自如上所述的(i)并且另一种酶选自如上所述的(ii)。

如本文所用，“3-羟基链烷酸（或其酸根）”指一种分子，其对应于以 下通式：C_n+1H_2n+2O₃，1<n<7，并且包含3-羟基丙酸（或其酸根）作为共同 模体(图1)和任选地在碳3上的一个或两个烷基取代。所述烷基残基或基团 可以直链或支链的。如本文所用，术语“alkoyl”和“烷基”具有相同的意思 并且是可互换的。同样，术语“残基”和“基团”具有相同的意思并且是可互 换的。甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基是所述烷基的实例。如 果两个烷基取代是不同的，则碳3变成手性中心。这个定义包括两种手性形 式，即便这两种形式中的一种形式(例如R形式)是天然产生的主要形式。图 3中显示3-羟基链烷酸（或其酸根）的实例。任选地，可以在碳2上添加烷 基取代基，所述碳2随后也可以变得手性(如果这两个取代基是不同的)。同 样地，本发明中3-羟基链烷酸（或其酸根）底物的构型包括全部立体异构 体。在一个优选实施方案中，3-羟基链烷酸（或其酸根）对应于3-羟基丙 酸（或其酸根）或对应于3-羟基丙酸（或其酸根）的变体或衍生物，其中 碳3上所携带的两个氢原子之一或两个氢原子被完全由碳和氢原子组成的 模体(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基)取代，所述取代基的 碳原子数目范围是1至5，优选地是1至3。如本文所用，后缀“oate”可以互 换地指羧酸根离子(COO-)或羧酸(COOH)。它不用来指酯。在一个具体实 施方案中，3-羟基链烷酸（或其酸根）由下式代表： HO-CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH或O^--CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH。

“3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）”指一种分子，其对应于以下通式： C_n+1H_2n+3O₆P，其中1<n<7，并且3-膦羧基氧基丙酸（或其酸根）作为共同 模体和任选地在碳3上的一个或两个烷基取代。

如本文所用，术语“烯”指完全由碳和氢组成的分子，所述分子含有一 个碳-碳双键并具有单不饱和烃的化学式C_nH_2n，其中n等于至少2。优选 地，n等于至少3、4、5或6。最优选地，n最多是6。因此，通常，术语 “烯”指对应于C_nH_2n的分子，其中1<n<7。

在一个优选实施方案中，烯由结构式H₂C=C(R¹)(R²)代表，其中R¹和 R²独立地选自氢原子和直链或支链烷基，从而烯分子中碳原子的总数最多 是6。

本发明的烯化合物的优选实例尤其是乙烯、丙烯、异丁烯和异戊烯(图 4)或1-丁烯和1-戊烯。

如本文所用，“碳源”指可以用作本发明生物的底物的任何碳化合物。 该术语包括葡萄糖或任何其他的己糖、木糖或任何其他的戊糖、多元醇如 甘油、山梨醇或甘露醇或聚合物如淀粉、纤维素或半纤维素或聚-3-羟基链 烷酸（或其酸根）如聚-3-羟丁酸（或其酸根）。它可以是允许微生物生长 的任何底物，例如甲酸（或其酸根）。在生物能够实施光合作用的情况下， 它也可以是CO₂。

如本文所用，“重组”指通过添加、移除或修饰染色体基因或染色体外 基因或调节基序(如启动子)或通过生物的融合或通过添加任何类型载体例 (如质粒)，对生物的人工遗传修饰。术语“重组表达”指产生包含遗传修饰 的蛋白质，优选地目的在于产生相对于其宿主而言为外源或异源的蛋白 质，即，所述蛋白质不天然地在生产宿主中存在，或目的在于产生修饰或 突变的内源蛋白质。

如本文所用，“过量表达”指宿主生物中蛋白质的重组表达，优选地所 述重组表达源自与其中表达该蛋白质的那一种生物不同的生物，与该蛋白 质的天然表达相比，在所述宿主生物中的表达增加了至少10%和优选地 20%、50%、100%、500%和可能更多。这个定义也包括其中不存在所述 蛋白质天然表达的情况。

“共底物”是添加至酶促反应，从而改善其某些参数和尤其其活性的化 合物或分子，所述产物和主要底物以相等的量消耗。共底物因此必须按照 与主要底物浓度可比的浓度添加至该反应。取决于酶，可以需要共底物的 存在用于酶促反应。

“辅因子”是添加至酶促反应，从而改善其某些参数并且尤其改善其活 性的产物，所述产物在反应期间不消耗并且因此仅需要以与酶量成正比的 低浓度添加，所述浓度因此被称作“催化性的”。

氨基酸序列的“部分”指一个片段，其包含所述序列的至少10个、优选 地至少20、30、40个或50个连续氨基酸残基。

如本文所用，“同源性”指两个序列之间存在如通过所述两个序列之间 的同一性百分比所度量的相似性。在一个优选实施方案中，术语“同源性” 意指序列同一性。

化学化合物经常通过几种正式名或俗名已知。这里，分子的俗名是优 选的。因此：

-“乙烯”用来指乙烯(ethene)。

-“丙烯”用来指丙烯(propene)。

-“丁烯”用来指丁烯(butene)。

-“异丁烯”用来指2-甲基丙烯或异丁烯(isobutene)。

-“戊烯”用来指戊烯(pentene)。

-“异戊烯”用来指2-甲基-丁-1-烯或异戊烯。

-“丙酸（或其酸根）”用来指丙酸或丙酸根离子。

-“丁酸（或其酸根）”用来指丁酸或丁酸根离子。

-“戊酸（或其酸根）”用来指戊酸或戊酸根离子。

本发明描述一种通过生物学过程尤其酶促过程从3-羟基链烷酸（或其 酸根）开始而产生烯化合物的方法，其中组合两种类型的酶以增加产生率 这一效率。更具体地，本发明涉及一种用于产生烯的方法，其特征在于它 包括通过以下酶使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成所述烯

(i)具有使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3-膦羧基氧基链烷 酸（或其酸根）的活性的第一酶；和

(ii)与第一酶不同并且具有使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根） 转化成所述烯的活性的第二酶。

如上文提到，WO2010/001078描述了一种用于通过采用具有脱羧酶活 性的酶以酶促方式转化3-羟基链烷酸而产生烯的方法。已经在 WO2010/001078中描述，通常，借助具有脱羧酶活性的酶(例如甲羟戊酸 二磷酸(MDP)脱羧酶(E.C.4.1.1.33))使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成烯 的转化通过以下方式发生：使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3- 膦羧基氧基链烷酸（或其酸根），所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根） 随后脱羧以导致相应的烯。在图2B中描述使用多种3-羟基链烷酸（或其 酸根），由MDP脱羧酶实施的类属反应。

现在已经发现，不同脱羧酶、尤其甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，以不同效 率催化以上提到的两个步骤，即，一些脱羧酶以比其他脱羧酶更高的效率 催化第一步骤并且一些脱羧酶对第二步骤(即脱羧步骤)显示优选性，并且 因此，可以通过组合相应酶显著地增加如WO2010/001078中所述的3-羟 基链烷酸（或其酸根）转化成烯的效率。因此，本发明尤其涉及一种用于 从3-羟基链烷酸（或其酸根）中酶促产生烯时实现更高效率的方法，即一 种用于改善这种酶促生产的效率的方法。

术语“具有使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3-膦羧基氧基 链烷酸（或其酸根）的活性的酶”意指可以使3-羟基链烷酸（或其酸根） 磷酸化成相应3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的酶。磷酸基团优选地来 自ATP分子。

这种活性例如可以如所附实施例、尤其实施例5中所述那样测量。一种 可能性因此是将相应的酶与3-羟基链烷酸（或其酸根）和ATP孵育并且测 量ADP的产生(其反映相应3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的产生)。用 于测量ADP产生的测定法是本领域技术人员已知的。这些方法之一是实施 例5中描述的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶测定法。在这种情况下，该测定法在 340nm处测量与ADP量成正比的NADH吸光度下降率。在一个优选实施方 案中，术语“具有使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3-膦羧基氧基 链烷酸（或其酸根）的活性的酶”意指可以使3-羟基异戊酸（或其酸根）和 ATP转化成3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）和ADP的酶。甚至更优选地， 这种酶可以按10mM或更低的K_M，例如以5mM或更低、优选地1mM或更 低和甚至更优选地0.1mM或更低的K_M催化3-羟基链烷酸（或其酸根）转化 成相应的3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的反应，优选地催化3-羟基异 戊酸（或其酸根）和ATP转化成3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）和ADP 的反应。在一个特别优选的实施方案中，这种酶可以按至少0.2s^-1的k_cat， 优选地按至少0.5s^-1的k_cat，特别优选按至少1.0s^-1、更优选地至少2.0s^-1的 k_cat和甚至更优选地按至少5.0s^-1的k_cat催化3-羟基链烷酸（或其酸根）转化 成相应的3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的反应，优选地催化3-羟基异 戊酸（或其酸根）和ATP转化成3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）和ADP 的反应。

在一个特别优选的实施方案中，在如实施例5中所述那样的测定法中测 量使3-羟基异戊酸（或其酸根）和ATP转化成3-膦羧基氧基异戊酸（或其 酸根）和ADP的能力。

术语“具有使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化成所述烯的活 性的酶”意指可以催化下述反应的酶，其中通过所述反应，存在3-膦羧基氧 基链烷酸（或其酸根）的脱羧和去磷酸化，从而导致相应的烯。

这种活性例如可以如所附实施例中、尤其在实施例8中所述那样测量。 一种可能性因此是将相应的酶与相应的膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）在 原则上允许脱羧和去磷酸化的条件下孵育并且(例如通过气相色谱)检测相 应烯的产生。在一个优选实施方案中，术语“具有使所述3-膦羧基氧基链烷 酸（或其酸根）转化成所述烯的活性的酶”意指可以使3-膦羧基氧基异戊酸 （或其酸根）转化成异丁烯(优选地在实施例8中描述的条件下)的酶。甚至 更优选地，这种酶可以按100mM或更低的K_M，例如按75mM或更低的K_M、 或按50mM或更低、优选地按10mM或更低的或5mM或更低或1mM或更 低并且甚至更优选地0.1mM或更低的K_M催化3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸 根）(通过脱羧和去磷酸化)转化成相应的烯的反应。在一个特别优选的实 施方案中，这种酶可以按至少10^-6s^-1的k_cat，优选地按至少10^-4s^-1的k_cat，例 如按10^-3s^-1的k_cat或按10^-2s^-1的k_cat，如按10^-1s^-1的k_cat，例如按0.2s^-1的k_cat、 优选地按0.5s^-1的k_cat、特别优选按至少1.0s^-1、更优选地至少2.0s^-1的k_cat和 甚至更优选地按至少5.0s^-1的k_cat催化3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转 化成相应的烯的反应，优选地催化3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）转化 成异丁烯的反应。

在一个特别优选的实施方案中，在如实施例8中所述那样的测定法中测 量使3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）转化成异丁烯的能力。

在一个优选的实施方案中，上文在(i)和(ii)中提到的酶是由NCBI或等 同引擎视为具有COG3407结构域的酶。

在本发明方法的一个优选实施方案中，具有使3-羟基链烷酸（或其酸 根）转化成相应的3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的活性的第一酶(i)选 自

(A)包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3- 膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质的相应活性同样高；

(B)包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3- 膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO: 2中所示氨基酸序列的蛋白质的相应活性同样高；

(C)包含如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3- 膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO: 3中所示氨基酸序列的蛋白质的相应活性同样高；和

(D)包含如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3- 膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的蛋白质的相应活性同样高。

SEQ ID NO:1显示来自干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)DSM9790的 酶的氨基酸序列(GenBank登录号AAT43941；Swissprot/TrEMBL登录号 Q6KZB1)。

SEQ ID NO:2显示来自嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)的酶 的氨基酸序列(GenBank登录号CAC12426；Swissprot/TrEMBL登录号 Q9HIN1)。

SEQ ID NO:3显示来自火山热原体(Thermoplasma volcanium)的酶的 氨基酸序列(GenBank登录号BAB59465；Swissprot/TrEMBL登录号 Q97BY2)。

SEQ ID NO:4显示来自Ferroplasma acidarmanus fer1的酶的氨基酸 序列(GenBank登录号ZP_05571615)。

在本发明方法的又一个优选实施方案中，具有使所述3-膦羧基氧基链 烷酸（或其酸根）转化成所述烯的活性的第二酶(ii)选自

(a)包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:5中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(b)包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:6中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(c)包含如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:7中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(d)包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(e)包含如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:9中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(f)包含如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:10中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(g)包含如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:11中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(h)包含如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:12中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(i)包含如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:13中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；

(j)包含如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:14中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高；和

(k)包含如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的蛋白质或这样的蛋 白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列至少15% 同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化 成所述烯的活性，所述活性至少与具有如SEQ ID NO:15中所示氨基酸序 列的蛋白质的相应活性同样高。

SEQ ID NO:5显示从戈登链球菌(Streptococcus gordonii)克隆的酶的 氨基酸序列。SEQ ID NO:6显示来自戈登链球菌菌株Challis亚株CH1的酶 的氨基酸序列(GenBank登录号AAT43941；Swissprot/TrEMBL登录号 A8UU9)。SEQ ID NO:7显示来自婴儿链球菌婴儿亚种(Streptococcus  infantarius subsp infantarius)ATCC BAA-102的酶的氨基酸序列 (GenBank登录号EDT48420.1；Swissprot/TrEMBL登录号B1SCG0)。SEQ  ID NO:8显示来自智人(Homo sapiens)的酶的氨基酸序列(GenBank登录号 AAC50440.1；Swissprot/TrEMBL登录号P53602.1)。SEQ ID NO:9显示来 自德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的酶的氨基酸序列(GenBank登录 号CAI97800.1；Swissprot/TrEMBL登录号Q1GAB2)。SEQ ID NO:10显示 来自缓症链球菌(Streptococcus mitis)(菌株B6)的酶的氨基酸序列 (GenBank登录号CBJ22986.1)。SEQ ID NO:11显示来自解没食子酸链球菌 (Streptococcus gallolyticus)UCN34的酶的氨基酸序列(GenBank登录号 CBI13757.1)。SEQ ID NO:12显示来自血链球菌(Streptococcus  sanguinis)SK36的酶的氨基酸序列(GenBank登录号ABN43791.1)。SEQ ID  NO:13显示来自链球菌属物种M143的酶的氨基酸序列(GenBank登录号 EFA24040.1)。SEQ ID NO:14显示来自猪链球菌(Streptococcus  suis)89/1591的酶的氨基酸序列(GenBank登录号EEF63672.1)。SEQ ID NO: 15显示来自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)SK126的酶的氨基酸序列 GenBank登录号EEK09252)。

在本发明方法的一个优选实施方案中，第一酶(i)如上文(A)中定义并且 第二酶(ii)如上文提到的(a)或(b)中定义，甚至更优选地，第二酶如上文提 到的(f)、(g)、(h)、(i)、(j)或(k)中定义。如实施例中所示，这些酶的组合 在产生本发明烯化合物方面是特别高效。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，具有使所述3-膦羧基氧基链 烷酸（或其酸根）转化成所述烯的活性的第二酶(ii)选自以下蛋白质的任一 种，所述蛋白质在下表中列出或来自包含与这种蛋白质的氨基酸序列至少 15%同一的氨基酸序列并且显示使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根） 转化成所述烯的活性的蛋白质，其中所述活性至少与所述蛋白质的相应活 性同样高。

表1

生物 参考序列GenBank 马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei) AAM31457.1 詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii) AAB98390.1 腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus) BAE19266.1 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) EAO73731.1 粪肠球菌(Enterococcus faecalis) AAO80711.1 约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae) ABQ04421.1 噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus) CAE79505.1 橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus) A9WEU8.1 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) CAH13175.1 单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) EAL09343.1 勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula) ABP95731.1 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) AAO03959.1 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) AAV60266.1 凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans) EAY45229.1 Chloroflexus aggregans EAV09355.1 短乳杆菌(Lactobacillus brevis) ABJ64001.1 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) BAG27529.1 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CAD64155.1 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius) ABD99494.1 乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis sp.lactis) AAK04503.1 结节双螯菌(Dichelobacter nodosus) ABQ14154.1 嗜冷黄杆菌(Flavobacterium psychrophilum) CAL42423.1

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) EDT95457.1 化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) AAT86835.1 猪链球菌 ABP91444.1 溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) BAE05710.1 马链球菌(Streptococcus equi) ACG62435.1 拟南芥(Arabidopsis thaliana) AAC67348.1 阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii) ABH01961.1 兔脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi) CAD25409.1 链霉菌属物种 BAB07791.1 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) EAO73731.1 乳房链球菌 CAR41735.1 原鸡(Gallus gallus) XP_423130 Salmo salmar ACI34234 Natromonas pharaonis CAI48881.1 死海盐盒菌(Haloarcula marismortui) AAV46412.1 Haloquadratum walsbyi CAJ51653.1

如上文提到，不仅可以使用具有特别提到的以相应SEQ ID NO或在表 1中列出的氨基酸序列的蛋白质，还可以使用由NCBI或等同引擎视为具有 COG3407结构域的蛋白质并且更优选地使用包含下述氨基酸序列的蛋白 质，其中所述氨基酸序列与特别提到的氨基酸序列显示至少15%同源性并 且具有至少与具有特别提到的氨基酸序列的蛋白质同样高的相应酶活性。 优选的酶有利地具有至少x%同源性，其中x选自20、25、20、35、40、45、 50、55和60。在又一个优选的实施方案中，该酶与SEQ ID NO:1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示的序列之一或表1中所 示的序列之一具有至少65%序列同源性，优选地至少70%、更优选地至少 75%、甚至更优选地至少80、85、90、95、96、97、98或99%同源性。可 以通过不同方法和通过本领域技术人员已知的软件程序，如例如 CLUSTAL方法或BLAST和衍生软件或通过使用序列比较算法如由 Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.,1970,48:443)或Smith和Waterman(J. Mol.Biol.,1981,147:195)描述的那种算法确定序列同源性的百分比。

显示所示程度同源性的这类蛋白质例如可以是天然存在或已经以合 成方式制备的其他酶。它们尤其包括可以就其产生本发明烯的能力进行选 择的酶。因此，选择试验包括使纯化的酶或产生这种酶的微生物与反应的 底物接触并且测量相应的化合物(即3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）或烯) 的产生。在实验部分描述这类试验。这类选择试验也可以用来筛选对待转 化成3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）或烯的底物具有优化的酶活性，即 针对一种或多种3-羟基链烷酸（或其酸根）或3-膦羧基氧基链烷酸（或其 酸根）具有优化活性的酶。

这类筛选方法是本领域熟知的并且例如包括蛋白质工程技术如随机 诱变、大规模诱变(massive mutagenesis)、位点定向诱变、DNA改组、合 成性改组、体内进化或基因的完全合成并随后筛选所需的酶活性。

本发明中所用的酶因此可以是天然的或合成的，并且通过化学手段、 生物学手段或遗传手段产生。它也可以经化学修饰，例如旨在改善其活性、 抵抗性、特异性、纯化或旨在使其固定在支持物上。

已经发现，能够催化3-羟基链烷酸（或其酸根）经3-膦羧基氧基链烷 酸（或其酸根）转化成烯的上述反应的酶经常是可以分类于甲羟戊酸二磷 酸(MDP)脱羧酶(酶命名EC4.1.1.33)的系统发育超家族中的酶。MDP脱羧 酶是参与胆固醇生物合成的酶。这种酶已经从多种生物(包括动物、真菌、 酵母和一些细菌)分离。它也可以由一些植物表达(Lalitha等人, Phytochemistry24(11),(1985),2569-2571)。已经克隆和测序了编码这种酶 的许多基因。这些酶是通常由300至400个氨基酸组成并且使用ATP作为共 底物，所述ATP在反应期间转化成ADP和无机磷酸。磷酸基团从ATP分子 转移至甲羟戊酸二磷酸的叔醇，释放ADP。在3-羟基上磷酸化的反应中间 体随后经历磷酸基团的消去，在生理情况下释放异戊烯基二磷酸(图2)。

因此，在一个优选的实施方案中，以上(i)或(ii)中定义的酶是MDP脱羧 酶。在本发明的上下文中，MDP脱羧酶定义为可以至少催化5-二磷酸-3- 磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯基-5-二磷酸和CO₂或可以至少催化甲羟戊酸二 磷酸和ATP转化成5-二磷酸-3-磷酸甲羟戊酸和ADP的反应的酶。优选地， 这种酶可以催化这两种反应。

在另一个优选实施方案中，以上(i)中定义的酶是如(i)(B)中所定义的 酶。SEQ ID NO:2中所示的序列代表在嗜酸热原体中鉴定的酶。在 Genbank中，这种酶划归为甲羟戊酸二磷酸脱羧酶。然而，从Chen和 Poulter(Biochemistry49(2010),207-217)已知，在嗜酸热原体中，存在参与 甲羟戊酸-5-单磷酸脱羧酶的作用的备选甲羟戊酸途径。因此，可能的是， 由SEQ ID NO:2代表的酶实际上代表甲羟戊酸-5-单磷酸脱羧酶。

这对于其他古细菌可能也是如此。因此，在另一个优选的实施方案中， 以上(i)或(ii)中定义的酶是甲羟戊酸-5-单磷酸脱羧酶。这种酶能够使甲羟戊 酸-5-单磷酸转化成异戊烯基焦磷酸。

在本发明的优选实施方案中：

-3-羟基丙酸（或其酸根）经3-膦羧基氧基丙酸（或其酸根）转化乙烯； 或

-3-羟丁酸（或其酸根）经3-膦羧基氧基丁酸（或其酸根）转化丙烯； 或

-3-羟基戊酸（或其酸根）经3-膦羧基氧基戊酸（或其酸根）转化1- 丁烯；或

-3-羟基-3-甲基丁酸（或其酸根）(或者3-羟基异戊酸（或其酸根）) 经3-膦羧基氧基-3-甲基丁酸（或其酸根）(3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）) 转化成异丁烯；或

-3-羟基-3-甲基戊酸（或其酸根）经3-膦羧基氧基-3-甲基戊酸（或其 酸根）转化异戊烯。

本发明的方法可以在分离的酶(或额外包含一种或多种辅因子的酶系 统)存在情况下体外实施。体外优选地意指在无细胞系统中。

在一个实施方案中，该方法中所用的酶以纯化形式用来使3-羟基链烷 酸（或其酸根）转化成烯。然而，这种方法可能是昂贵的，因为酶及底物 的生产和纯化成本高昂。

因此，在另一个优选实施方案中，该方法中所用的酶在反应中作为非 纯化的提取物或以未裂解的细菌形式存在，从而节省蛋白质纯化成本。然 而，与这种方法相关的成本可能仍因产生和纯化底物的成本而相当高昂。

因此，在一个优选的实施方案中，使用天然或重组、纯化或未纯化的 酶使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成烯。为此目的，将酶在底物存在时 在允许酶有活性的物理化学条件下孵育，并且允许孵育继续进行足够长的 时间。在孵育结束时，任选地通过使用本领域技术人员已知的(如用于测量 烯产物或游离磷酸形成或用于测量3-羟基链烷酸（或其酸根）底物或ATP 消失的气相色谱试验或比色试验)的任何检测系统测量烯的存在。

在一个优选实施方案中，添加辅因子从而最佳模拟天然反应或从而在 催化裂口中提供立体或电子互补作用。例如，如果本发明方法中所用的酶 之一是天然使用甲羟戊酸二磷酸(MDP)作为底物的酶，则3-羟基链烷酸（或 其酸根）的结构在酶-底物结合期间在催化裂口清空时留下大的空间，因为 3-羟基链烷酸（或其酸根）通常对应于MDP的片段。用辅因子填充这个空 间以替代底物丢失部分具有最逼真模拟MDP分子的目的。由于辅因子在反 应期间不受修饰，因此将仅以催化量添加它。在反应底物是3-羟基丙酸（或 其酸根）的情况下，互补性辅因子将是丙基二磷酸。在反应底物是3-羟丁 酸（或其酸根）或3-羟基-3-甲基丁酸（或其酸根）的情况下，互补性辅因 子将是乙基二磷酸。在反应底物是3-羟基戊酸（或其酸根）或3-羟基-3-甲 基戊酸（或其酸根）的情况下，互补性辅因子将是甲基二磷酸。图5中显 示这些不同的分子。偶尔可能出现的是，反应的互补性辅因子对另一种底 物的反应具有积极影响。一般地，辅因子可以是包含磷酸酐并因此具有总 体通式R-PO₂H-O-PO₃H₂的任何分子，其中R尤其是H、直链、支链或环状 烷基，其优选地具有1至10个或1至5个碳原子，或任一其他一价有机基团。 与具有通式R-O-PO₂H-CH₂-PO₃H₂的其中磷酸酐由亚甲基桥替换的亚甲 基二磷酸单酯相对应的类似模体也是本发明的部分，所述亚甲基桥具有不 被水解的优点。更一般地，辅因子可以是单磷酸或甚至前述分子的无磷酸 类似物或可以通过在酶催化位点提供立体或电子互补作用而改善反应产 率的任何其他分子。辅因子有利地选自焦磷酸离子、二磷酸甲酯、二磷酸 乙酯或二磷酸丙酯。

在一个优选实施方案中，转化在共底物存在的情况下发生，所述共底 物优选是含有磷酸酐的化合物，并且优选地是ATP、rNTP、dNTP或这些 分子中几种的混合物、多磷酸或焦磷酸。共底物通常存在于宿主中。然而， 在另一个具体实施方案中，可以将共底物添加至反应，所述共底物优选地 选自ATP、rNTP、dNTP、几种rNTP或dNTP的混合物、多磷酸和优选地 焦磷酸或含有磷酸酐的化合物(由图2的通式X-PO₃H₂代表)。

虽然脱羧步骤，即如上文(ii)中定义的反应，不需要ATP消耗，但是 可以显示，ATP在反应中的存在可能是有益的。使用3-膦羧基氧基异戊酸 （或其酸根）作为底物，已经在实施例7中展示这一点。认为ATP可能通 过ATP与二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的ATP结合位点结合而对蛋白质的折叠 产生影响。实际上，可以通过肉眼观察到这一点：纯化的酶具有沉淀的倾 向，并且添加ATP防止这种效应。认为不仅是ATP，其他相似的化合物 如dATP、ADP、AMP或其他NTP或dNTP也具有这种作用。因此，在 一个优选的实施方案中，本发明的方法用ATP、dATP、ADP、AMP或 NTP而非ATP或dNTP作为共底物来实施。

在另一个优选实施方案中，本发明的方法在产生酶的生物，优选微生 物存在的情况下在培养物中实施。因此，在本发明的这种实施方案中，使 用产生上文(i)和(ii)中所述酶的生物，优选地是微生物。在一个优选实施方 案中，这种(微)生物是重组的，因为由宿主产生的在上文(i)和(ii)中所述的 酶相对于生产宿主是异源的。这种方法因此可以在培养基中直接实施，无 需分离或纯化酶。在一个特别有利的方式中，使用这样的(微)生物，它具 有内源产生一种或多种3-羟基链烷酸（或其酸根）的天然或人为特性并且 也表达或过量表达天然或修饰的在上文(i)和(ii)中所述的酶，从而从溶液中 存在的碳源直接产生烯。

例如，可以通过使用下述微生物实施本发明的方法，所述微生物产生 一种或多种3-羟基链烷酸（或其酸根）[例如(真养产碱杆菌(Alcaligenes  eutrophus)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或经遗传修饰从而产生 所述产物的大肠杆菌菌株]并且已经被遗传工程化，从而它们过量表达如上 文(i)和(ii)中所定义的酶，所述酶优选地源自与宿主微生物不同的生物。遗 传修饰可以在于例如整合编码酶的相应基因至染色体中，从含有酶编码序 列上游的启动子的质粒表达所述酶，其中所述启动子和编码序列优选地源 自不同生物；或本领域技术人员已知的任何其他方法。备选地，其他细菌 或酵母可以具有特定优点并且可以进行选择。例如，可以使用酵母如酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)、极端嗜热性细菌如嗜热栖热菌(Thermus  thermophilus)或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌、微藻或光合细菌。

本发明中所用的生物可以是原核生物或真核生物，优选地，它们是微 生物如细菌、酵母、真菌或霉菌或植物细胞或动物细胞。在一个特定实施 方案中，微生物是细菌，优选地来自埃希氏菌属(Escherichia)、产碱杆菌 属(Alcaligenes)或芽孢杆菌属(Bacillus)和甚至更优选地是大肠杆菌、真养 产碱杆菌或巨大芽孢杆菌。

在另一个优选实施方案中，微生物是埃希氏菌属的重组细菌，优选地 是大肠杆菌的重组细菌，其已经被修饰从而内源地产生一种或多种3-羟基 链烷酸（或其酸根）并且使它们转化成烯。

在又一个优选的实施方案中，微生物是真菌，更优选地是的酵母属、 裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属 (Trichoderma)的真菌和甚至更优选地是以下物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵 母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)或里氏木霉 (Trichoderma reesei)。在一个特别优选的实施方案中，微生物是因表达上 文(i)和(ii)中所述的酶而产生3-羟基链烷酸（或其酸根）并使它们转化成烯 的重组酵母。

在另一个优选实施方案中，本发明的方法利用表达如上文(i)和(ii)中所 述的酶的光合微生物。优选地，微生物是光合细菌或微藻。甚至更优选地， 这种微生物具有内源产生一种或多种3-羟基链烷酸（或其酸根）的天然或 人工特性。在这种情况下，微生物将能够从溶液中存在的CO₂直接产生烯。

也可构思在本发明的方法中使用一种产生如上文(i)中所定义的酶的 微生物和另一种产生如上文(ii)中所定义的酶的微生物。另外，在又一个实 施方案中，至少一种微生物能够产生一种或多种3-羟基链烷酸（或其酸根）， 或者在一个备选实施方案中，将能够产生一种或多种3-羟基链烷酸（或其 酸根）的其他微生物用于方法中。

在另一个优选实施方案中，本发明的方法利用表达如上文(i)和(ii)中所 定义的酶的多细胞生物。这类生物的实例是植物或动物。

在一个特定的实施方案中，该方法涉及在标准培养条件(在1大气压 30-37°C，在允许细菌有氧生长的发酵罐中)或非标准条件(例如对应于嗜热 生物培养条件的较高温度)下培养微生物。

在又一个优选的实施方案中，本发明的方法在微需氧条件下实施。这 意指注入空气的量是有限的，从而使含有烯烃的气体流出物中的残留氧浓 度最小化。

在另一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：收集从反应中 脱气的气态烯，即回收例如从培养物中脱气的产物。因此在一个优选的实 施方案中，在反应期间收集气体形式的烯的系统存在下实施这种方法。

作为事实，短链烯且特别是乙烯、丙烯和丁烯异构体在室温和大气压 采取气态。本发明的方法因此不需要从液体培养基提取产物，其中所述从 液体培养基提取产物是一个以工业规模进行时总是非常昂贵的步骤。可以 根据本领域技术人员已知的何方法进行气体烃的排出和储存，以及它们可 能的后续物理分离和化学转化。

在一个特定的实施方案中，所述方法也包括检测气相中存在的烯(例如 丙烯、乙烯或异丁烯)。可以通过使用多种技术并且尤其通过使用伴随红外 或火焰电离检测的气相色谱系统或通过偶联于质谱法检测待产生的化合 物在空气或另一种气体的环境中的存在，甚至以小量存在。

在一个特定的实施方案中，通过使用本领域技术人员已知的技术，将 本发明方法所产生的烯缩合，随后任选地还原，以产生较长链的烯或较长 链的链烷。例如，异丁烯可以用来合成异辛烷：已经充分描述了用于成功 实施这种反应的催化方法。

在另一个实施方案中，本发明的方法以碳源(如葡萄糖)转化成3-羟基 链烷酸（或其酸根），随后所述3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的 烯为特征。图6中概述了这种方法的不同步骤。

在一个特定的实施方案中，这种方法以通过使用酶或合适的物理化学 方法使多羟基链烷酸（或其酸根）转化成3-羟基链烷酸（或其酸根），随 后使所述3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成所述烯为特征。任选地，多羟 基链烷酸（或其酸根）已经由已修饰其代谢途径以至于产生高产量多羟基 链烷酸（或其酸根）的微生物或植物产生。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括从大气CO₂或从人工添加至 培养基的CO₂产生烯。在这种情况下，在能够实施光合作用的生物(例如微 藻)中实施该方法。

本发明还涉及一种用于产生烯的方法，其包括通过使用酶以酶促方式 使3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）转化成相应的烯的步骤，所述酶可以 通过脱羧和去磷酸化催化这种转化。

就这种方法中待使用的优选酶而言，这些酶如已经与如本文所述的本 发明方法的(ii)相联系时的上文所述那样适用。

另外，还就上文对本发明方法描述的其他优选实施方案而言，同样适 用于从3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根）产生烯的方法。

本发明还涉及产生至少两种酶的生物，优选地微生物，其中一种酶选 自如上所述的(i)并且另一种酶选自如上所述的(ii)。在一个优选实施方案 中，这种生物是重组生物，其意义在于，它因导入编码至少一种上文提到 的酶的至少一种核酸分子而受到遗传修饰。优选地，这种核酸分子相对于 这种生物是异源的，其意指它不天然地存在于所述生物中。

因此，本发明还涉及生物，优选地是微生物，其包含编码如上文(i)中 所定义的酶的核酸分子并且包含编码如上文(ii)中所定义的酶的核酸分子。 在一个优选实施方案中，至少一种所述核酸分子相对于这种生物是异源 的，其意指它不天然地存在于所述生物中。微生物优选地是细菌、酵母或 真菌。在另一个优选实施方案中，生物是植物或非人类动物。至于其他优 选的实施方案而言，这些实施方案如已经与本发明方法相联系时的上文所 述那样适用。

另外，本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含本发明的微生物、 合适的培养基和3-羟基链烷酸（或其酸根）化合物或可以由所述微生物转 化成3-羟基链烷酸（或其酸根）化合物的碳源。

本发明还涉及至少两种酶的组合的用途，其中一种酶选自以下(i)并且 另一种酶选自以下(ii)，或本发明生物、优选地微生物的用途或本发明组合 物的用途，用于从3-羟基链烷酸（或其酸根）产生烯化合物，其中(i)和(ii) 如下：

(i)具有使3-羟基链烷酸（或其酸根）转化成相应的3-膦羧基氧基链 烷酸（或其酸根）的活性的第一酶；和

(ii)与第一酶不同并且具有使所述3-膦羧基氧基链烷酸（或其酸根） 转化成所述烯的活性的第二酶。

就所述不同组分的优选实施方案而言，这些实施方案如已经与本发明 方法相联系时的上文所述那样适用。

将在以下实施例中描述本发明的其他方面和优点，所述实施例出于说 明目的并且不以限制目的给出。

附图描述

图1：3-羟基丙酸（或其酸根）模体。

图2：由甲羟戊酸二磷酸脱羧酶催化的反应

图3：3-羟基链烷酸（或其酸根）的实例

图4：通过组合两个酶促步骤从3-羟基链烷酸（或其酸根）产生烯。

图5：可以在反应中用于在甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的催化位点中提供 结构性互补作用的辅因子。

图6：用于从葡萄糖产生烯的集成方法。

图7：在互补测定法中筛选MDP脱羧酶。以仅由干热嗜酸菌(P. torridus)酶(0.1mg)而无第二酶催化的反应作为参考。

图8：来自干热嗜酸菌和戈登链球菌的MDP脱羧酶用于使3-羟基异戊 酸（或其酸根）(HIV)转化成异丁烯(IBN)的组合作用。将IBN产生测量为 戈登链球菌MDP脱羧酶的浓度的函数，其中将所述戈登链球菌MDP脱羧 酶添加至HIV与100μg干热嗜酸菌MDP脱羧酶预孵育的反应混合物。

图9：筛选戈登链球菌MDP脱羧酶的酶同源物。使用对仅采用嗜酸 热原体(0.1mg)酶的反应(无第二酶)所获得的异丁烯的峰面积作为参考(比 率=1)。

与干热嗜酸菌门的酶组合使用时，来自链球菌属的MDP脱羧酶是特 别高效的。

图10：通过340nm处吸光度的下降监测NADH消耗量的ADP定量测定 法的方案。

图11：速度的曲线，所述速度作为由干热嗜酸菌MDP脱羧酶所催化的 磷酸转移酶反应的底物浓度的函数。从反应的头30分钟范围内的动力学计 算初始速率。

图12：在以下测定法中来自3-羟基异戊酸（或其酸根）的异丁烯产生：

无酶

在缓症链球菌MDP脱羧酶存在下

在嗜酸热原体MDP脱羧酶存在下

在嗜酸热原体酶和缓症链球菌酶均存在下。

图13：化学合成3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）的方案

图14：在ATP不存在和存在下来自3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根） 的异丁烯产生的测定法的GC分析

测定法：

1.无酶，0mM ATP

2.2mg/ml酶，0mM ATP

3.无酶，10mM ATP

4.2mg/ml酶，10mM ATP

以下实施例起到说明本发明的作用。

实施例

实施例1：MDP脱羧酶文库的克隆、表达和纯化

构建并测试编码跨越真核生物、原核生物和古菌生物的二磷酸甲羟戊 酸脱羧酶(MDP脱羧酶)家族代表的55个基因的文库，以便鉴定最有活性 的候选者以改善异丁烯(IBN)产生。

克隆、细菌培养物和蛋白质的表达

在真核基因情况下，将编码甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶EC4.1.1.33 的基因克隆于pET25b载体(Novagen)中，并且在原核基因情况下，克隆 于pET22b(Novagen)中。将一段6个组氨酸密码子插入甲硫氨酸起始密码 子后以提供用于纯化的亲和标签。根据热休克方法，用这些载体转化感受 态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。转化的细胞在37°C在ZYM-5052 自诱导培养基(Studier FW,Prot.Exp.Pur.41,(2005),207-234)上培育6小 时，伴以振摇(160转/分钟)，并且蛋白质表达在28°C继续过夜(大约16小 时)。通过在4°C，10,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且将沉淀物在-80°C 冷冻。

蛋白质纯化和浓缩

来自200ml培养细胞的沉淀物在冰上融化并且重悬于含有300mM  NaCl、5mM MgCl₂和1mM DTT的5ml Na₂HPO₄pH8中。添加20微升 lysonase(Novagen)。将细胞在室温孵育10分钟并且随后返回冰上20分钟。 通过超声波处理3x15秒完成细胞裂解。随后通过在4°C，10,000转/分钟 离心20分钟使细菌提取物澄清。将澄清的细菌裂解物加载于允许吸附加 6-His标签的蛋白质的PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上。将 柱子洗涤并且目的酶用含有300mM NaCl、5mM MgC₂、1mM DTT、250 mM咪唑的4ml50mM Na₂HPO₄pH8洗脱。洗脱物随后在Amicon  Ultra-410kDa滤器装置(Millipore)上浓缩和脱盐并且重悬于含有0.5mM  DTT和5mM MgCl₂的0.25ml50mM Tris-HCl pH7.4中。根据Bradford 方法将蛋白质浓缩物定量。如此纯化的蛋白质的纯度从40%至90%变动。

实施例2：MDP脱羧酶文库的筛选

使用互补测定法评价MDP脱羧酶。干热嗜酸菌MDP脱羧酶与来自 文库的每种测试的酶一起孵育。

在以下条件下实施这种酶促测定法。

50mM Tris HCl pH7.0

10mM MgCl₂

20mM KCl

40mM ATP

50mM3-羟基异戊酸（或其酸根）(HIV)

将pH调节至7.0

将100μg来自干热嗜酸菌的MDP脱羧酶和待测试的1mg MDP脱羧 酶添加至1ml反应混合物。使用仅含有100μg干热嗜酸菌MDP脱羧酶的 反应混合物作为参考。这种混合物随后在45°C无振摇时在密封小瓶 (Interchim)中孵育90小时。

收集1ml气相并注射入配备有FID检测仪和CP SilicaPlot柱(Varian) 的HP5890气相色谱仪(HP)中。使用商业异丁烯作为参考。

这种筛选程序导致鉴定到增加异丁烯产生率的几种MDP脱羧酶酶。 如图7中所示，对以下MDP脱羧酶观察到较高的异丁烯生产量。

候选物1：

登录号Genbank:CAI97800

登录号SwissProt/TrEMBL:Q1GAB2

生物:德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)ATCC11842

候选物2：

登录号Genbank:AAC50440.1

登录号SwissProt/TrEMBL:P53602.1

生物:智人

候选物3:

登录号Genbank:ABV09606

登录号SwissProt/TrEMBL:A8AUU9

生物：戈登链球菌Challis菌株CH1亚株

用纯化的戈登链球菌MDP脱羧酶观察到异丁烯的最高生产量。

这表明，测定法中存在的两种酶(一种来自干热嗜酸菌和另一种来自戈 登链球菌)以互补方式进行从HIV产生IBN的反应的两个步骤：从ATP 转移末端磷酰基至3-羟基异戊酸（或其酸根）的C3-氧，随后使中间体3- 膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）组合去磷酸化-脱羧。

实施例3：酶浓度对异丁烯生产量上的影响

在以下条件下评估戈登链球菌MDP脱羧酶浓度的影响：

50mM Tris-HCl pH7.0

10mM MgCl₂

20mM KCl

40mM ATP

50mM3-羟基异戊酸（或其酸根）(HIV)

将pH调节至7.0

将100μg来自干热嗜酸菌的MDP脱羧酶和不同量(0至1mg)的纯化 的来自戈登链球菌的MDP脱羧酶添加至1ml反应混合物。这种混合物随 后在45°C无振摇时在密封小瓶(Interchim)中孵育90小时。

收集1ml顶空相并注射入配备有FID检测仪和CP SilicaPlot柱 (Varian)的HP5890气相色谱仪(HP)中。使用商业异丁烯作为参考。

增加戈登链球菌酶浓度导致产生的异丁烯的量增加(图8)。

实施例4：筛选戈登链球菌MDP脱羧酶同源物文库

使用由NCBI维护的BLAST在线程序，针对非冗余蛋白质序列数据库 检索序列以产生与戈登链球菌酶具有高度序列相似性(>40%同一性)的酶 名单。所得到的名单包括18个候选物。

从以上物种的基因组以及从戈登链球菌基因组推导的MDP脱羧酶的 酶序列通过寡核苷酸拼接(concatenation)产生，以符合大肠杆菌的密码子 选择。将一段6个组氨酸密码子插入甲硫氨酸起始密码子后以提供用于纯 化的亲和标签。在pET25b表达载体(该载体由GENEART AG构建)中克 隆如此合成的基因。在转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后，根据实施例1中 描述的操作方案产生蛋白质。随后使用实施例2中描述的方法，使用嗜酸 热原体MDP脱羧酶替代干热嗜酸菌酶分析这些酶。这个筛选程序导致鉴 定到比戈登链球菌酶的MDP脱羧酶更高效产生异丁烯的酶(图9)，特别地 是来自婴儿链球菌、解没食子酸链球菌、链球菌属物种M143、唾液链球 菌、猪链球菌、血链球菌和缓症链球菌的MDP脱羧酶。

实施例5：磷酸转移酶活性的表征

使用丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联的测定法，对与从HIV产生IBN相 关的ADP释放定量(图10)。评估来自干热嗜酸菌、嗜酸热原体、婴儿链球 菌、缓症链球菌的MDP脱羧酶使HIV脱磷酸，释放ADP的能力。

在40°C在以下条件实施所研究的酶促反应：

50mM Tris-HCl pH7.0

10mM MgCl₂

100mM KCl

5mM ATP

0.2mM NADH

0.5mM磷酸烯醇丙酮酸

3U/ml乳酸脱氢酶

1.5U/ml丙酮酸激酶

0-50mM3-羟基异戊酸（或其酸根）(HIV)

将pH调节至7.0

通过添加特定酶(以0.05至1mg/ml的浓度)启动每个测定法并且通过 跟踪340nM处的吸光度监测NADH的消失。

采用来自干热嗜酸菌门以及来自链球菌属的MDP脱羧酶的测定法在 HIV存在的情况下引起ADP产生的可重复性增加。图11显示与针对干热 嗜酸菌酶所收集的数据相对应的Michaelis-Menten曲线的实例。下表中显 示动力学参数。

来自干热嗜酸菌门的酶比来自链球菌属的那些酶显示更高的磷酸转 移酶活性。

实施例6：通过组合两种酶从3-羟基异戊酸（或其酸根）产生异丁烯

在以下条件实施所需的酶促反应：

50mM Tris HCl pH7.5

10mM MgCl₂

20mM KCl

40mM ATP

50mM HIV

将pH调节至7.5

将100μg来自嗜酸热原体的MDP脱羧酶和500μg来自缓症链球菌的 MDP脱羧酶添加至1ml反应混合物。平行进行仅采用这两种酶之一的对 照反应。所述测试法在37°C无振摇时在密封小瓶(Interchim)中孵育。

通过分析在142小时孵育时间期间采样的等分试样测量IBN生产量。

收集1ml气相并注射入配备有FID检测仪和CP SilicaPlot柱(Varian) 的HP5890气相色谱仪(HP)中。使用商业异丁烯作为参考。

图12中显示异丁烯产生的动力学。来自嗜酸热原体的MDP脱羧酶催 化从HIV产生异丁烯。在孵育142小时后，添加来自缓症链球菌的MDP 脱羧酶导致异丁烯生产增加3倍。

在孵育6日后，来自仅有缓症链球菌的MDP脱羧酶仅产生少量异丁 烯，表明磷酸转移酶活性低。

可以因此通过组合以互补方式进行两个反应步骤的两个类型的酶增 加异丁烯产生。

实施例7：ATP对3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）(PIV)产生异丁烯的影 响

根据SYNTHEVAL(法国)在图13中所述的方案从3-羟基异戊酸（或 其酸根）化学地合成化合物3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）(PIV)。

在以下条件下实施异丁烯产生的测定法：

50mM Tris-HCl pH7.5

10mM MgCl₂

20mM KCl

0mM ATP(测定法No1和No2)

10mM ATP(测定法No3和No4)

25mM3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）

将pH调节至7.5

通过添加2mg纯化的来自缓症链球菌的MDP脱羧酶至0.5ml反应混 合物启动反应。在不存在酶的情况下进行对照反应(测定法No1和No3)。

这种混合物在37°C无振摇时在2ml密封小瓶(Interchim)中孵育26 小时。

收集1ml气相并注射入配备有FID检测仪和CP SilicaPlot柱(Varian) 的Varian430-GC气相色谱仪中。使用商业异丁烯作为参考。

添加10mM ATP至反应混合物增加从3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸 根）(PIV)产生异丁烯120倍(图14)。

实施例8：从3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）(PIV)产生异丁烯的动力学 参数

在以下条件下测量异丁烯产生的动力学参数：

50mM Tris-HCl pH7.5

10mM MgCl₂

50mM KCl

40mM ATP

0-100mM3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸根）

将pH调节至7.5

通过添加1mg纯化的来自缓症链球菌的MDP脱羧酶至0.5ml反应混 合物启动反应。这种混合物随后在37°C无振摇时在2ml密封小瓶 (Interchim)中孵育44小时。

收集1ml气相并注射入配备有FID检测仪和CP SilicaPlot柱(Varian) 的Varian430-GC气相色谱仪中。使用商业异丁烯作为参考。

在ATP作为辅因子存在时的背景水平(3-膦羧基氧基异戊酸（或其酸 根）自发分解)上，采用来自缓症链球菌的MDP脱羧酶的测定法显示IBN 产生量增加160-400倍(见以下表)。

发现来自缓症链球菌的MDP脱羧酶具有高于60mM的K_M和至少1.3 x10^-3秒^-1的k_cat。