PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒的制备

摘要

本发明涉及一种PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒的制备方法，包括：（1）将Fe源溶解于超纯水中，然后加入NH3·H2O并于空气中搅拌氧化，再加入聚乙烯亚胺PEI水溶液和Gd(NO3)3水溶液，反应结束后，自然冷却至室温，得到Fe3O4-Gd(OH)3-PEI；（2）将Fe3O4-Gd(OH)3-PEI与甲氧基聚乙二醇羧酸进行PEG化反应，即可。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作分离；制备的四氧化三铁-氢氧化钆纳米颗粒（Fe3O4-Gd(OH)3-PEI-PEG）不仅具有良好的生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫效应，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于模态磁性纳米颗粒的制备领域，特别涉及一种PEI包裹的双模态造影剂四 氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒的制备。

背景技术

目前癌症已成为人类最为致命的“杀手”之一，由于恶性肿瘤的局部浸润和远处转移特 性，癌症的治疗效果和治疗费用与病症的发现时期密切相关。因此，肿瘤的早期检测是治 疗癌症的关键。而分子影像学则可在肿瘤早期还未出现临床症状时检测到病变分子生物学 特性，如癌前分子改变、基因变化等肿瘤标志物，实现肿瘤的早期检测与治疗。近年来， 随着纳米技术的发展，纳米医学（Nanomedicine）这一新兴领域得到了人们广泛的重视和 极大的研究兴趣，例如细胞分离、药物传递、癌症的靶向诊断和治疗、分子手术、医学成 像和纳米机器人等。因此，应用纳米科学与技术发展高准确率的癌症早期诊断分子影像活 体成像技术显得越来越重要。目前最为常用的分子影像学技术有X-射线断层成像（X-ray  computed tomography,CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）、核医学成像 （包括正电子发射断层成像（positron emission tomography,PET）和单光子发射断层成像 (single photon emission computed tomography,SPECT））、光学分子成像（包括激发荧光断 层成像（fluorescence molecular tomography,FMT）和生物发光断层成像（bioluminescence  tomography,BLT））。为达到和体内组织反衬的效果，这些医学成像技术通常需要适当的纳 米颗粒作为造影剂辅助肿瘤的早期诊断。而MRI是上世纪七十年代发展起来的一项先进医 学成像诊断技术，已广泛应用于人体多种疾病的检测与早期诊断。其优势在于它的高分辨 率（已达到μm级），没有放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息。这些正是核 医学、CT成像和光学成像的弱点。MRI造影剂用来缩短成像时间，提高成像对比度和清晰 度，从1988年第一个MRI造影剂Gd-DTPA（钆-二乙烯三胺五乙酸）投入市场以来，人们对 MRI造影剂的研究越来越广泛，逐渐开始研究具有组织或器官靶向的造影剂，使其能适用 于腹部脏器。目前常用的造影剂有两大类，分别为MRI阳性和阴性造影剂。MRI阳性造影 剂除常用的钆Gd³⁺螯合剂外，氢氧化钆（Gd(OH)₃）近年来也被用作MRI阳性造影剂，其 优点在于不仅生物相容，而且具有很好的弛豫率；常用的MRI阴性造影剂为超顺磁性氧化 铁（Fe₃O₄）纳米颗粒。

而超支化聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）不仅能够提高纳米颗粒的水溶液分散 性，稳定纳米颗粒用于医学成像，而且有众多的表面氨基，可用于纳米材料表面的进一步 官能化修饰。例如，Cai等用PEI包裹合成氧化铁磁性纳米颗粒，合成的Fe₃O₄-PEI纳米颗 粒尺寸可控（11-22nm），能够长时间地分散在水溶液中，没有团聚现象发生；而且形成的 Fe₃O₄-PEI表面有众多的氨基，还可进一步功能化和改性，如进行PEG（聚乙二醇）化、 乙酰化和羧基化修饰以提高其稳定性以及生物相容性。得到的Fe₃O₄-PEI-PEG纳米颗粒还 具有很好的弛豫率，因此在MRI成像诊断中有潜在的应用价值（Cai,H.;An,X.;Cui,J.;Li, J.;Wen,S.;Li,K.;Shen,M.;Zheng,L.;Zhang,G.;Shi,X.Facile hydrothermal synthesis and  surface functionalization of polyethyleneimine-coated iron oxide nanoparticles for biomedical  applications.ACS Applied Materials&Interfaces,2013,5,1722）。

检索国内外有关PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒合成的 文献和专利结果表明，用一步水热合成法合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI纳米粒子并对其表面 有效地修饰后用于体内T₁和T₂MRI双模态成像的研究，还未见相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧化 钆磁性纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，制备的四 氧化三铁-氢氧化钆纳米颗粒（Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG）不仅具有良好的生物相容性，而 且具有很好的T₁和T₂弛豫效应，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。

本发明的一种PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒的制备方 法，包括：

（1）将Fe源溶解于超纯水中，然后加入NH₃·H₂O并于空气中搅拌氧化10-15min， 再加入聚乙烯亚胺PEI水溶液和Gd(NO₃)₃水溶液，于134～140℃反应3-3.5小时；反应结 束后，自然冷却至室温，将沉淀洗涤磁分离后，得到PEI包裹的四氧化三铁-氢氧化钆磁性 纳米颗粒Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI；

（2）将Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI与甲氧基聚乙二醇羧酸进行PEG化反应：

将甲氧基聚乙二醇羧酸和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐分别溶解于3-6 mL DMSO中，搅拌活化后，加入步骤（1）制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI，振荡反应2-5天， 用水磁分离洗涤，再分散入水或PBS中，即得PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢氧 化钆磁性纳米颗粒（PEG化的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒）。

所述步骤（1）中的Fe源为FeCl₂·4H₂O。

所述步骤（1）中的Fe源、超纯水、NH₃·H₂O的配比为1.25g:10-20mL:6.25mL，其 中NH₃·H₂O质量百分比浓度为25-28%。

所述步骤（1）中的聚乙烯亚胺PEI的分子量Mw=25000。

所述步骤（1）中的Fe源与超支化聚乙烯亚胺PEI质量比为2-2.5：1。

所述步骤（1）中的聚乙烯亚胺PEI水溶液的配制方法为将0.51g PEI溶于3mL水中； Gd(NO₃)₃水溶液的配制方法为将2.83g Gd(NO₃)₃溶于6mL水中。

所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸的分子量为2000。

所述步骤（2）中的甲氧基聚乙二醇羧酸与Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI表面氨基的摩尔比为1: 5-10。

本发明利用聚乙烯亚胺进行一步水热法合成PEI包裹的双模态造影剂四氧化三铁-氢 氧化钆磁性纳米颗粒，并进一步对其表面进行修饰。首先将FeCl₂·4H₂O溶于超纯水中，加 入6.25mLNH₃·H₂O于空气中搅拌氧化10-15min，再加入PEI和Gd(NO₃)₃水溶液，于 134～140℃反应3-3.5小时得到PEI包裹的四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI；然后对Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI纳米颗粒进一步进行表面修饰PEG，增加 其生物相容性用于MRI成像诊断（参考图1）。制备的四氧化三铁-氢氧化钆纳米颗粒 （Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG）不仅具有良好的生物相容性，而且具有很好的T₁和T₂弛豫效 应，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。

本发明使用透射电子显微镜（TEM）、能量分散谱（EDS）、X-射线衍射（XRD）、热 重分析（TGA）以及电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）等方法表征制备的磁 性纳米颗粒，纳米颗粒的T₁和T₂弛豫性能通过磁共振成像仪测得。同时利用MTT法来检 验纳米颗粒的细胞毒性，最后通过磁共振成像仪检测纳米颗粒Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG的 体内双模态造影性能。具体测试结果如下：

（1）X-射线衍射（XRD）和电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）的测试结果

通过分析Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI的X-射线衍射图谱（图2），所合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI 材料的X-射线衍射图谱中标出的峰（100）、（110）、（101）、（200）、（201）、（210）、 （300）、（211）、（220）和Gd(OH)₃的图谱(JCPDS83-2037)一致；而图谱中标出的峰（220）、 （311）、（400）、（422）、（511）、（440）和Fe₃O₄的图谱(ICSD20-596)一致，证明PEI包 裹的产物为四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒。电感耦合等离子体原子发射光谱 （ICP-AES）的测试结果表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的Gd和Fe的摩尔比为 0.25。

（2）热重分析（TGA）测试结果

为了对Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒表面PEI和PEG的修 饰量进行定量，我们对水热法合成的Fe₃O₄和一步法合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI以及 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒进行了TGA测试。由图3可以看出，跟纯氧化铁比较， Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI失重为7.78%，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒失重为9.15%。因此 可计算出，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒上PEI和PEG的质量 分数分别为7.78%和1.37%，由此表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒成功地被PEI包 裹和PEG修饰。

（3）透射电子显微镜（TEM）和能量分散谱（EDS）的测试结果

TEM测试结果（图4）显示Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI（4a和4b）和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG （4d和4e）纳米颗粒的形貌为球形或准球形，从4b和4e高分辨TEM图中可以看出纳米颗 粒外围有一层大分子壳层包围，表明PEI和PEG均匀地修饰在Fe₃O₄-Gd(OH)₃纳米颗粒表面。 图4c和4f分别为Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的能量分散谱 （EDS），进一步地证实了纳米颗粒中元素Fe和Gd的共同存在。

（4）T₁和T₂弛豫率测量结果

Gd(OH)₃纳米材料为一种MRI阳性造影剂，能增强T₁信号强度；而Fe₃O₄纳米材料作 为一种MRI阴性造影剂，能降低T₂信号强度。弛豫率(r₁和r₂)反映了纳米粒子作为MRI 造影剂的效率，为每毫摩尔铁或钆的弛豫时间，可通过弛豫时间（T₁和T₂）的倒数计算得 到。图5和6分别为Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒随Gd或Fe浓度变化的灰白图和线 性拟合图，从图5a灰白图看出，随着Gd浓度的增加，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒 的信号增强，从5b线性关系图可知，其具有良好的r₁弛豫率（5.63mM^-1s^-1）；从图6a灰 白图看出，随着Fe浓度的增加，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的信号减弱，从6b线 性关系图可以看出Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料的T2弛豫时间倒数随着铁浓度的增 加（在0-0.16mM浓度范围内）具有很好的线性关系，并且通过计算其r₂弛豫率为151.37 mM^-1s^-1。因此，本发明所合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料可作为优良的双模态造 影剂，有望应用于双模态MRI影像诊断。

（5）MTT细胞活力测试结果

通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株）的活力检测所合成双模 态造影剂Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG的细胞毒性。KB细胞与Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG（浓度 为10、25、50和100μg/mL）在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后，在570nm 处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。从图7看出，与对照组相比，在0到 100μg/mL范围内，经Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG处理的细胞均具有良好的细胞活力。应用 单因素方差分析方法分析了不同浓度下材料对细胞增殖的影响，与对照组（缓冲液PBS， pH7.4）相比，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG在试验浓度0到100μg/mL范围内对KB细胞的活 力没有显著性差异，表明其具有良好的生物相容性。

（6）体内MRI结果

对于体内MRI，我们采用肠系膜静脉注射250μL本发明制备的 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG（Fe质量为1.98mg，Gd质量为1.41mg）到大鼠体内后，材料经 肠系膜静脉直接经门静脉入肝脏后，于不同时间（5min、2h和48h）进行大鼠肝脏MRI 扫描(图8)。从图片8a看出，与对照组（不注射材料的大鼠肝脏图片）相比较，注射5分 钟后扫描的大鼠肝脏处的T₁MRI信号强度明显增亮，表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料 增强了鼠肝脏部位的T₁MRI信号强度；2h后扫描的鼠肝脏处的T₁MRI信号强度较第一 次减弱，说明材料代谢了一部分；注射48h后扫描的鼠肝脏处的T₁MRI信号强度进一步 减弱，但仍然有信号，表明材料被慢慢地代谢掉了。图8d的信号强度变化图也进一步证 明，注射5分钟后肝脏处的T₁MRI信号强度最强，然后随着材料慢慢被代谢排除体外， 肝脏处的信号强度也慢慢恢复到初始值。从图片8b看出，与对照组相比较，注射5分钟 和2h后扫描的鼠肝脏处的T₂MRI图片从灰色变到黑色，表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材 料降低了鼠肝脏部位的T₂MRI信号强度；注射48h后扫描的大鼠肝脏处的T₂MRI信号强 度有所恢复，表明材料被慢慢地代谢掉了。图8_c的T₂^*MRI与图8b的T₂MRI结果相一致， 注射5分钟和2h后扫描的大鼠肝脏处的T₂MRI图片变黑，降低了鼠肝脏部位的MRI信 号强度；图8e的信号强度变化图也进一步证明，注射5分钟后肝脏处的T₂MRI信号强度 最弱，然后随着材料慢慢被代谢排出体内，肝脏处的信号强度也慢慢恢复到初始值。结果 表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料能用于体内MRI双模态成像。

（7）体内组织分布结果

为了研究材料Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG在体内生物组织的分布情况，首先通过尾静脉 注射100μL纳米材料的PBS溶液（Fe质量为0.79mg，Gd质量为0.56mg），然后用ICP-AES 测量在注射后不同时间点（1h、4h、24h、48h、96h和168h）以及对照鼠（不注射任 何材料）中Fe元素在各个重要器官中的含量（图9）。从图中可看出，跟对照组（不注射 材料的小鼠）相比，Fe元素主要分布在肝脏和脾脏处，并且随着时间的增长，聚集量越多， 在4h，肝脏处Fe量达到最高（每克器官含Fe量为409.15μg），然后随着时间的增长，Fe 元素被肝脏慢慢地排泄出去；在1-48h，Fe元素在脾脏处聚集量越来越多，在48h处达到 最高（每克器官含Fe量为393.21μg），然后随着时间的增长，Fe元素被脾脏慢慢地排泄 出去；而在其他的器官（心、肺和肾），Fe的聚集明显较少，在这些器官中材料最后也被 慢慢地代谢掉，排出体外。这些结果表明材料能在小鼠体内慢慢地正常的代谢清除，且不 显示毒性。

有益效果：

（1）本发明采用简单的、PEI辅助的“一步”水热法来合成PEI包裹的双模态造影剂 四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒，此法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所 用的稳定剂为廉价和环境友好的聚乙烯亚胺材料，具有产业化实施的前景；

（2）本发明制备的四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒能够长时间地分散在水基溶 液中，没有团聚现象发生，且PEG化的四氧化三铁-氢氧化钆纳米颗粒 （Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG）不仅具有良好的生物相容性，而且具有很好的T₁和T₂弛豫效 应，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG的反应示意图；

图2是本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-PEI的X射线衍射图；

图3是本发明制备的Fe₃O₄、Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI及Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG的热重分 析图；Fe₃O₄为对比例1制备的未包覆PEI的纯Fe₃O₄纳米颗粒；

图4是本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI的透射电镜图片（a和b）和能量分散谱（c）； 以及Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG的透射电镜图片(d和e)和能量分散图谱(f)；

图5是本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料的T₁MRI成像图片(a)和T₁弛豫率 的线性关系图(b)；

图6是本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料的T₂MRI成像图片(a)和的T₂弛豫 率的线性关系图(b)；

图7是MTT法测试的KB细胞经过PBS缓冲液（对照）和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG 纳米颗粒（浓度范围在0-100μg/mL）处理24小时后的细胞活力。

图8为经大鼠肠系膜静脉注射250μL本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG进入大鼠 后,于不同时间扫描的大鼠肝脏的T₁(a)、T₂(b)和T₂^*(c)MRI图片以及T₁(d)和T₂(e)MRI 信号强度随时间的变化图；

图9为尾静脉注射100μL本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG进入小鼠后，Fe元 素在不同时间点（1h、4h、24h、48h、96h和168h）在小鼠主要器官（心、肝、脾、 肺和肾）的组织分布；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。

实施例1

（1）将1.25g Fe源（FeCl₂·4H₂O）加入烧杯中，加入7.75mL的超纯水（电阻率大 于18.2MΩ.cm）使其溶解。在不断搅拌中，加入6.25mL NH₃·H₂O，并于空气中连续搅拌 10-15分钟，从而保证二价铁被氧化。接着将反应物转移到反应釜中。将2.83g Gd(NO₃)₃溶于6mL水溶液中，超声溶解后，移入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀。同时将0.51 g PEI溶于3mL水溶液中，转入反应釜中，与反应釜中溶液充分混匀。混合物于134～140℃ 反应约3-3.5小时。反应结束后，自然冷却至室温，将所得到的黑色沉淀分散于超纯水中、 磁分离，再次分散、磁分离，如此重复五次纯水洗涤，以去除过量的反应试剂，重新分散 于水相中，即得PEI包裹的四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI；

（2）将上述合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI与甲氧基聚乙二醇羧酸进行PEG化反应：将 甲氧基聚乙二醇羧酸和1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐分别溶解于3-6mL DMSO中，混合均匀并搅拌活化3h后，再加入到步骤（1）制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI 的DMSO溶液中，振荡反应2-5天，用水磁分离洗涤，再分散入水或PBS中，得到PEG 化的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒；

通过XRD、TG、TEM、EDS测试方法表征Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料。通过分析Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI的X-射线衍射图谱（图2）， 所合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI材料的X-射线衍射图谱中标出的峰（100）、（110）、（101）、 （200）、（201）、（210）、（300）、（211）、（220）和Gd(OH)₃的图谱(JCPDS83-2037)一致， 而图谱中标出的峰（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）和Fe₃O₄的图谱(ICSD 20-596)一致，证明PEI包裹的产物为四氧化三铁-氢氧化钆磁性纳米颗粒。电感耦合等离 子体原子发射光谱（ICP-AES）的测试结果表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的Gd 和Fe的摩尔比为0.25。

为了对Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒表面PEI和PEG的修 饰量进行定量，我们对水热法合成的Fe₃O₄和一步法合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI以及 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒进行了TGA测试。由图3可以看出，跟纯氧化铁比较， Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI失重为7.78%，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒失重为9.15%。因此 可计算出，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒上PEI和PEG的质量 分数分别为7.78%和1.37%，由此表明Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒成功地被PEI包 裹和PEG修饰。

TEM测试结果（图4）显示Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI（4a和4b）和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG （4d和4e）纳米颗粒的形貌为球形或准球形，从4b和4e高倍TEM图中可以看出纳米颗粒 外围有一层大分子壳层包围，表明PEI和PEG均匀地修饰在Fe₃O₄-Gd(OH)₃纳米颗粒表面。 图4c和4f分别为Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI和Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的能量分散谱 （EDS），进一步地证实了纳米颗粒中元素Fe和Gd的共同存在。

实施例2

将上述制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料通过ICP-AES测试法测得溶液中Fe 和Gd元素的含量，再用EP管配制不同Fe浓度和Gd浓度的水溶液2mL，通过T₁和T₂磁共振成像研究材料的T₁和T₂弛豫效应。图5和6分别为Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米 颗粒随Gd或Fe浓度变化的灰白图和线性拟合图，从图5a灰白图看出，随着Gd浓度的增 加，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米颗粒的信号增强，从5b线性关系图可知，其具有良好的 r₁弛豫率（5.63mM^-1s^-1）；从图6a灰白图看出，随着Fe浓度的增加，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG 纳米颗粒的信号减弱，从6b线性关系图可以看出Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料的T2 弛豫时间倒数随着铁浓度的增加（在0-0.16mM浓度范围内）具有很好的线性关系，并且 通过计算其r₂弛豫率为151.37mM^-1s^-1。因此，本发明所合成的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳 米材料可作为优良的双模态造影剂，有望应用于MRI双模态影像诊断。

实施例3

以KB细胞为模型细胞，通过MTT比色法测定KB细胞（一种人类上皮癌的细胞株） 的活力检测所合成双模态造影剂Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG纳米材料的细胞毒性。KB细胞 与Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG(浓度为10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然 后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的增殖及活力。从图7 看出，与对照组相比，在0到100μg/mL范围内，经Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG处理的细胞 均具有良好的细胞活力。应用单因素方差分析方法分析了不同浓度下材料对细胞增殖的影 响，与对照组（缓冲液PBS，pH7.4）相比，Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG在试验浓度0到100 μg/mL范围内对KB细胞的活力没有显著性差异，表明其具有良好的生物相容性。

实施例4

为了研究材料的体内MRI双模态成像效果，我们采用肠系膜静脉注射。以200g左右 的SD大鼠（Sprague Dawley，SD）作为动物模型（上海动物实验中心）。通过肠系膜静脉 注射250μL本发明制备的Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG（Fe质量为1.98mg，Gd质量为1.41mg） 入大鼠体内后，材料经肠系膜静脉直接经门静脉入肝脏后，于不同时间（5min、2h和48 h）进行MRI扫描(图8)。从图片8a看出，与对照组（不注射材料的大鼠肝脏图片）相比 较，注射5分钟后扫描的大鼠肝脏处的T₁MRI信号强度明显增亮，表明 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料增强了鼠肝脏部位的T₁MRI信号强度；2h后扫描的鼠肝脏 处的T₁MRI信号强度较第一次减弱，说明材料代谢了一部分；注射48h后扫描的鼠肝脏 处的T₁MRI信号强度进一步减弱，但仍然有信号，表明材料被慢慢地代谢掉了。图8d的 信号强度变化图也进一步证明，注射5分钟后肝脏处的T₁MRI信号强度最强，然后随着 材料慢慢被代谢排除体外，肝脏处的信号强度也慢慢恢复。从图片8b看出，与对照组相 比较，注射5分钟和2h后扫描的鼠肝脏处的T₂MRI图片从灰色变到黑色，表明 Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG材料降低了鼠肝脏部位的T₂MRI信号强度；注射48h后扫描的大 鼠肝脏处的T₂MRI信号强度有所恢复，但仍暗，表明材料被慢慢地代谢掉了。图8c的T₂^*MRI与图8b的T₂MRI结果相一致，注射5分钟和2h后扫描的大鼠肝脏处的T₂MRI图 片变黑，降低了鼠肝脏部位的MRI信号强度；图8e的信号强度变化图也进一步证明，注 射5分钟后肝脏处的T₂MRI信号强度最弱，然后随着材料慢慢被代谢排除体内，肝脏处 的信号强度也慢慢恢复。

实施例5

为了研究材料Fe₃O₄-Gd(OH)₃-PEI-PEG在体内生物组织的分布情况，首先通过尾静脉 注射100μL纳米材料的PBS溶液（Fe质量为0.79mg，Gd质量为0.56mg）入小鼠（6周 左右的小鼠BALB/C，上海动物实验中心，20-25g）体内，然后用ICP-AES测量在注射后 不同时间点（1h、4h、24h、48h、96h和168h）以及对照鼠（不注射任何材料）中Fe 元素在各个重要器官中的含量（图9）。从图中可看出，跟对照组（不注射材料的小鼠）相 比，Fe元素主要分布在肝脏和脾脏处，并且随着时间的增长，聚集量越多，在4h，肝脏 处Fe量达到最高（每克器官含Fe量为409.15μg），然后随着时间的增长，Fe量被肝脏慢 慢地排泄出去；在1-48h，Fe元素在脾脏处聚集量越来越多，在48h处达到最高（每克器 官含Fe量为393.21μg），然后随着时间的增长，Fe量被脾脏慢慢地排泄出去；而在其他 的器官（心、肺和肾），Fe的聚集明显较少，在这些器官中材料最后也被慢慢地代谢掉， 排除体外。这些结果表明材料能在小鼠体内慢慢地正常的代谢清除，且不显示毒性。

对比例1

按照文献（Ge等人，J.Phys.Chem.C2009,113,13593–13599）将1.25g FeCl₂·4H₂O与 7.75mL超纯水超声处理后，再加6.25mL NH₃·H₂O在空气中搅拌10min，在高压反应釜 中于134℃条件下反应3小时，进行洗涤和磁分离，获得18.5nm直径的Fe₃O₄磁性纳米 颗粒。