水稻杂种劣势基因Hwc3(t)的分子鉴定方法

摘要

本发明涉及一种水稻杂种劣势基因Hwc3（t）的分子鉴定方法，属于农业生物技术植物育种领域。本发明方法包括提取水稻总DNA，用特异性引物WF1、WR1进行PCR反应；反应完毕后加入5μl的loading buffer，用1%琼脂糖凝胶、120V电泳40min；紫外透射仪上检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。野生型材料（hwc3（t）/hwc3（t））的PCR产物分子量2928bp；突变型材料（Hwc3（t）/Hwc3（t））的PCR产物分子量为1153bp，突变型为含有劣势基因Hwc3（t）的材料。本发明方法能准确、快速、高效地鉴别水稻杂种劣势基因Hwc3（t）。

说明书

技术领域

本发明涉及一个水稻杂种劣势基因Hwc3（t）分子鉴定的方法，属于农业生 物技术领域，更具体地说属于植物育种领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要粮食作物之一，中国60%以上的人口以稻 米为主食。我国水稻年播种面积占粮食作物播种面积的近30%，而水稻总产量占 粮食总产量的42%左右，单位面积产量比粮食作物平均单产高45%，其中一个 重要因素,就是水稻杂种优势的利用。杂交水稻研究的成功与发展,否定了自花授 粉作物没有杂种优势的传统理论观点,大大丰富了作物遗传育种的理论和实践, 具有很高的学术价值;而这项重大科技成果的应用，给中国水稻生产带来了一次 飞跃，为粮食生产的发展做出了巨大贡献。

在杂交育种实践中也常常发现杂种劣势(hybrid weakness)现象。理论上看， 杂交亲本间亲缘关系越远，杂种F₁表现强优势的可能性越大。然而，随着亲本间 亲缘关系的远离，双亲之间出现的生殖障碍往往也越明显。亚洲栽培稻中无论是 亚种内杂交还是亚种间杂交，其F₁群体往往都会出现不同程度的生殖障碍或杂种 劣势的现象。水稻的杂种劣势主要是指具有不同性状的亲本(籼粳亚种内或两亚 种间)进行杂交而产生的杂种，在生活力、繁殖力、适应性、产量、品质以及对 不良环境因素的抗性等方面有多个性状至全部性状都不及双亲，甚至明显比亲本 弱的现象。迄今为止，杂种劣势现象已经在拟南芥和菜豆等很多种植物中发现。 杂种劣势现象可能是杂合子基因表达调控的一种外在表现形式，基因表达调控处 于动态变化过程中，在不同生长条件、不同发育阶段、各种生物和非生物协迫下 基因表达存在显著差异。杂种F₁基因来源于两个亲本，但是其在许多表型上不同 于两个亲本，这可能与亲本基因在杂种F₁中表达调控发生了变化有密切相关。

关于杂种优势的遗传机理，国内外学者提出了多种假说：显性假说、超显性 假说、上位性效应等一系列假说。随着分子生物学技术的不断进步，育种家开始 从分子遗传学等方面研究产生杂种优势的原因，但是至今仍未有确凿的结论，因 此有必要通过研究杂种劣势从反方向来阐述杂种优势理论。水稻杂种劣势的研究 有利于探讨籼粳品种进化及杂交不亲和性等机制，为亚种间杂种优势的利用，建 立新的杂种优势利用模式等具有重要的理论及实践意义。研究表明，水稻杂种劣 势通常是由于两个显性基因的互补所致。目前，已发现分布于不同染色体上的10 多个显性或隠性基因位点与杂种劣势现象有关，已精确定位的水稻杂种劣势基因 有Hwa1、Hwa2、Hwc1、Hwc2、hwd1、hwd2等，分布在第1、4、7、10、 11号染色体上。但是，对水稻劣势基因的克隆还未见报道，产生杂种劣势的分子 机制也不明确。杂种劣势亲本韩国粳稻品种Shinseonchalbyeo为杂种劣势研究的 理想材料，通过研究发现Shinseonchalbyeo携带的劣势基因是一个新的杂种劣势 显性基因Hwc3（t），位于水稻第4号染色体上，该位点区域的1775bp碱基缺失导 致其ORF功能发生改变，与其它劣势基因共同作用导致F₁出现杂种劣势。目前对 杂种劣势基因检测只有通过杂交，对F₁进行形态学观察得以验证，这种检测方法 首先需将材料进行常规杂交，将F₁种植下去，分蘖期后进行农艺性状考察才能确 定，有时间周期长，方法繁琐等缺点，并且对于仅含有单个劣势基因、生长势正 常的植株，无法通过表型来鉴定，对杂交育种的效率有一定的影响。目前还没有 一种技术完善、快速有效选择鉴定杂种劣势基因Hwc3（t）的方法。

发明内容

本发明克服目前没有杂种劣势基因Hwc3（t）鉴定方法的不足，提供一种准 确、快速、高效的水稻杂种劣势基因Hwc3（t）的分子鉴定方法。

本发明所述的水稻杂种劣势基因Hwc3（t）的分子鉴定方法，包括以下步骤：

（1）提取待鉴定水稻材料叶片总DNA；

（2）用杂种劣势基因Hwc3（t）的特异性引物WF1、WR1进行PCR扩增反应； 所述的引物WF1的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述的引物WR1的碱基序列如 SEQ ID NO:2所示；

（3）PCR反应完毕后加入5μl的loading buffer，用1%琼脂糖凝胶、120V 电泳40min；

（4）在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果；

（5）依据电泳结果鉴定待鉴定水稻材料基因型，野生型材料（hwc3（t）/hwc3 （t））的PCR产物分子量2928bp；突变型材料（Hwc3（t）/Hwc3（t））的PCR 产物分子量为1153bp；PCR扩增产物分子量为1153bp的水稻基因型为（Hwc3（t） /Hwc3（t））是含有劣势基因Hwc3（t）的材料。

步骤（2）所述的PCR扩增反应的反应液组成：总反应体积25.00μl，其中 ddH₂O19.7μl，10X PCR La bufferⅡ2.50μl，2.5mM dNTP mixture2.00μl，50pmol 引物WF10.20μl，50pmol引物WR10.20μl，5U/μl Takara La Taq0.20μl，100ng/μl 模板DNA0.20μl；扩增程序为：预变性94℃5min；变性94℃30s、退火54℃ 30s、延伸72℃3min，35个循环；延伸72℃5min。

本发明的有益效果是Shinseonchalbyeo为本课题组发现的一个新的水稻杂 种劣势基因突变体，其自身生长正常。该材料第4号染色体1775bp缺失导致ORF 功能发生改变。

基于水稻杂种劣势野生型及突变体Hwc3（t）基因的序列差异，设计Hwc3 （t）的特异性引物WF1、WR1，为快速准确鉴别水稻Hwc3（t）基因提供了有力 的工具。具体表现为：（1）用Hwc3（t）的特异性引物WF1、WR1作引物鉴别水 稻材料时，鉴别准确率为100%，而且用时不超过3天，鉴别材料提取DNA，PCR 反应及电泳即可；（2）由于鉴别方法简单易行，鉴别不受季节及材料数量的限制， 避免了田间农艺性状鉴定的繁琐程序，鉴别方法简单经济，鉴定一个材料或个体 仅需人民币约5-10元。

附图说明

图1是用WF1、WR1作引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图 谱，其中泳道M为Marker10kb，1,2,3,4泳道分别为野生型材料Nipponbare， 93-11，Aranghyangchalbyeo，Sanghaehyangheolua扩增产物，5泳道为突变体 Shinseonchalbyeo扩增产物。

具体实施方式

具体实施方式为构建不同的遗传分离群体，对几个群体单株分别用形态学观 察及分子鉴定法鉴定材料基因型，比较几种方法鉴别结果，考察本发明分子鉴别 法的可靠性。实施例所用的所有水稻材料均为现有的常规材料，这些水稻材料及 实施例中所用的各种试剂均可从商业渠道购买到。实施例中无特殊说明的均为常 规方法。

实施例1

来源于Sanghaehyangheolu/Shinseonchalbyeo（Sanghaehyangheolu含有劣 势基因Hwc1，杂种F₁表现劣势，F₂群体中劣势植株与正常植株的理想分离比为9： 7）杂交F₂代群体，共200个单株。对200单株分别用形态学观察及分子鉴定法 鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的可靠性。

表型鉴定时，对F₂群体进行观察，主要是对其地上部的农艺性状考察：在 分蘖盛期对亲本、F₂整体植株进行株高、分蘖综合分析，判断劣势植株和正常植 株。

本发明分子鉴定时，提取待鉴定水稻材料叶片总DNA；用Hwc3（t）的特异 性引物WF1、WR1进行PCR扩增，所述的引物WF1的碱基序列如SEQ ID NO:1所 示，所述的引物WR1的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；PCR扩增反应完毕后加入 5μl的loading buffer，用1%琼脂糖凝胶、120V电泳40min；紫外透射仪上检 测，依据电泳结果鉴定材料基因型。野生型材料（hwc3（t）/hwc3（t））的PCR 产物分子量2928bp；突变型材料（Hwc3（t）/Hwc3（t））的PCR产物分子量为 1153bp，突变型含有劣势基因Hwc3（t）的材料。

PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：

反应液组成：

扩增程序：预变性94℃5min；

变性94℃30s、退火54℃30s、延伸72℃3min，35个循环；

延伸72℃5min。

表1Sanghaehyangheolua/Shinseonchalbyeo杂交F₂群体的表型及基因型

由表1可看出，来源于Sanghaehyangheolua/Shinseonchalbyeo杂交F₂群 体的200个单株中，形态学观察发现其中劣势株114株，经分子鉴定其基因型为 显性纯合或显性杂合，且F₂群体中有150单株经该分子标记鉴定含有劣势基因 （显性纯合或显性杂合）。结果表明本发明分子鉴定方法准确率为100%，且分子 鉴定能区分出含有劣势基因Hwc3（t）的正常型植株。

实施例2

各种水稻籼粳品种资源50份（详见表4），50份材料均生长正常，用本发明 分子鉴定法鉴定材料的基因型，考察分子鉴别法的可靠性。

杂交验证时，将这50份材料播种，开花后分别与Hwc1携带者 Sanghaehyangheolua进行人工杂交、套袋、收种。收种后播种杂种F₁，到分蘖 期考察农艺性状。

本发明分子鉴定时，提取待鉴定水稻材料叶片总DNA；用Hwc3（t）的特异 性引物WF1、WR1进行PCR扩增，所述的引物WF1的碱基序列如SEQ ID NO:1所 示，所述的引物WR1的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；PCR扩增反应完毕后加入 5μl的loading buffer，用1%琼脂糖凝胶、120V电泳40min；紫外透射仪上检 测，依据电泳结果鉴定材料基因型。野生型材料（hwc3（t）/hwc3（t））的PCR 产物分子量2928bp；突变型材料（Hwc3（t）/Hwc3（t））的PCR产物分子量为 1153bp，突变型含有劣势基因Hwc3（t）的材料。

所述PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：

反应液组成：

扩增程序：预变性94℃5min；

变性94℃30s、退火54℃30s、延伸72℃3min，35个循环；

延伸72℃5min。

结果见表2，在50份材料中，有两份材料（Shinseonchalbyeo、 Hwaseonchalbyeo）与材料Sanghaehyangheolua杂交F₁出现杂种劣势，这两份 材料经本发明分子鉴定其带型为1153bp，基因型为突变型（Hwc3（t）/Hwc3（t））。 其余材料与材料Sanghaehyangheolua杂交F₁均生长正常，经分子鉴定其带型为 2928bp（hwc3（t）/hwc3（t）），基因型为野生型。表明本发明分子鉴定准确率 为100%。

表250份水稻籼粳品种Hwc3（t）位点基因型鉴定结果

表3杂种劣势不同鉴定方法的比较

由表1～表3可看出，使用本发明特异性引物WF1、WR1鉴别杂种劣势基因 Hwc3（t）时，准确率为100％，且使用该分子鉴定成本低，所需时间短，可明 显缩短选种进程。

表4实施例2所用的50份籼、粳水稻品种目录

品种名称 类型 品种名称 类型 Nipponbare 粳稻 滇粳优1号 粳稻 93-11 籼稻 滇粳优5号 粳稻 Aranghyangchalbyeo 粳稻 丽粳11 粳稻 Sanghaehyangheolua 粳稻 榆密15B 粳稻 Shinseonchalbyeo 粳稻 C418 粳稻 Hwaseonchalbyeo 粳稻 南34 粳稻 Milyang23 籼稻 南46 粳稻 Sangambyoe 籼稻 辽粳287 粳稻 Deasanbyeo 籼稻 南粳46 粳稻 Gayabyoe 籼稻 雪河矮早 粳稻 Ansanbyeo 粳稻 黎榆B 粳稻 Juanbyeo 粳稻 云粳优8号 粳稻 Junambyeo 粳稻 云系10号 粳稻

Dongjinbyeo 粳稻 云粳恢96 粳稻 Ijpoombyeo 粳稻 滇榆 粳稻 Alembyeo 粳稻 大理州95-66 粳稻 Sujeongbyeo 籼稻 沪粳276 粳稻 Hwayongbyeo 粳稻 广陵香粳 粳稻 Nonganbyeo 粳稻 楚粳香2号 粳稻 Sindongjinbyoe 粳稻 凤稻23 粳稻 Jinmibyeo 粳稻 中浙优1号 籼稻 Baegyangbyeo 籼稻 IR24 籼稻 楚粳28 粳稻 IR64 籼稻 合系26 粳稻 明恢64 籼稻 合系42 粳稻 辐恢838 籼稻

                                  序列表

 

<110>  云南农业大学

 

<120>  水稻杂种劣势基因Hwc3（t）的分子鉴定方法

 

<130>  /

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  水稻（Oryza sativa L.）

 

<400>  1

gcgatttgca cctgtcgtgt ct                                              22

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  水稻（Oryza sativa L.）

 

<400>  2

acaacttcaa cgcatgagcg agc                                             23