人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用

摘要

本发明公开了人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用。所公开的人源基质细胞衍生因子1α的表达载体是将hSDF-1α基因插入到质粒pET15b中构成的重组质粒pET15b-hSDF-1α；同时公开了该人源基质细胞衍生因子1α的表达载体的构建方法，并公开了将所构建的表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中对人源基质细胞衍生因子1α进行表达。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体来说，本发明涉及的是人源基质细胞 衍生因子1α的表达载体、该表达载体的构建方法及该表达载体的应用。

背景技术

基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor，SDF-1）是目前已知的与 干细胞动员有关的最强趋化因子，它可以通过与其特异性受体CXCR4结合激活 一系列信号通路，从而在组织缺血后起到炎症调节、促进干细胞动员、诱导血 管再生的作用。

SDF-1属于CXC类趋化因子，人SDF-1（hSDF-1）编码序列位于10q11.1 染色体上，在体内SDF-1的形式主要有两种，分别为SDF-1α和SDF-1β，以 SDF-1α为主。

CXC趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）是SDF-1的特异 性受体，它是一个由352个氨基酸构成的并包含7个跨膜螺旋体结构的G蛋白 偶联受体。广泛表达于骨髓单个核细胞和干细胞。SDF-1与靶细胞上表达的其特 异性受体CXCR4结合后能够激活一系列的信号通路，从而影响靶细胞的各种生 物学行为，比如生长、运动、趋化、分泌、黏附、血管生成等。SDF-1与CXCR4 结合后可以促使CXCR4形成二聚体、使其空间构象发生改变并内化。 SDF-1/CXCR4生物轴具有非常重要的生物学功能，在多种疾病的发生发展中发 挥作用，对其的研究也越来越深入。所报道的其主要的生物学功能有在应用干 细胞治疗缺血缺氧性脑损伤中调节干细胞的迁移及促进损伤区血管的增生、调 控肿瘤的侵润转移、参与胚胎的发育过程、介导免疫炎症反应同时与HIV的感 染有关。

现有技术中关于SDF-1α的表达研究具体有：

（1）时宏伟，张萍，王春梅，等.GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化. 科学与技术工程，2007,7(14):3366-3367中公开了克隆小鼠的SDF-1α基因， 纯化了融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。

（2）姚峰，周军媚，王佐，等.SD大鼠SDF-1α基因克隆与序列分析.中 国实验动物学报，2008,16(1):15-18中公开了克隆大鼠的SDF-1α基因并对其功 能进行了初步预测。

（3）Read L R,Cumberbatch J A,Buhr M M,et al.Cloning and characterization  of chicken stromal cell derived factor-1.Developmental&Comparative Immunology, 2005,29(2):142-152中公开了重组鸡的SDF-1基因，用原核表达系统生产重组 蛋白并用钙通量实验测定了其活性。

（4）Tan Y,Du J,Cai S X,et al.Cloning and characterizing mutated human  stromal cell-derived factor-1(SDF-1):C-terminalα-helix of SDF-1αplays a critical  role in CXCR4activation and signaling,but not in CXCR4binding affinity. Experimental Hematology,2006,34(11):1553-1562中公开了将C端α缺失的人 SDF-1基因即hSDF-154，克隆入原核表达载体pET-30a(+)，将重组质粒导入大 肠杆菌BL21(DE3)，分离纯化出目标蛋白并对其活性进行研究。

发明内容

本发明解决的技术问题是根据hSDF-1α的cDNA序列，设计和构建hSDF-1 α表达载体，以实现hSDF-1α的表达。为此：

本发明的目的之一是提供一种人源基质细胞衍生因子1α的表达载体，该表 达载体是将人源基质细胞衍生因子1α基因插入到质粒pET15b中构成的重组质 粒pET15b-hSDF-1α。

本发明的另一目的在于提供上述人源基质细胞衍生因子1α的表达载体的构 建方法，该构建方法包括：

（1）引物设计：

根据美国国立生物技术信息中心提供的hSDF-1αcDNA序列设计引物，去 掉信号肽仅克隆成熟肽序列213bp，并在两端插入NcoⅠ、BamHⅠ酶切位点及 保护碱基，设计合成引物序列为：

PCR扩增时所用

上游引物为：5ˊGATGCCATGGACGGGAAGCCCGTCAGC3ˊ；

下游引物为：5ˊCGCGGATCCTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGT3ˊ； （2）hSDF-1α基因的PCR扩增：

PCR的模板为带hSDF-1αcDNA片段的重组质粒pCMV-SPORT6-SDF1α， 模板浓度为0.2324ng/μL；

上游引物、下游引物的浓度均为10μmol/L；

50μL的PCR的反应体系中含有：25μL Premix、1μL模板质粒、1μL上 游引物、1μL下游引物、其余为无菌水；

PCR的反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，60℃退火30s， 72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；

胶回收PCR产物；

（3）双酶切PCR产物：

40μL的PCR产物酶切体系中含有1μL NcoⅠ、1μL BamHⅠ、4μL10×K Buffer、4μL0.1%BSA、30μL PCR产物、其余为无菌水；

37℃酶切处理；

胶回收双酶切的PCR产物；

（4）双酶切质粒pET15b：

20μL的质粒pET15b酶切体系中含有：1μL NcoⅠ、1μL BamHⅠ、2μL10 ×K Buffer、2μL0.1%BSA、10μL pET15b质粒、其余为无菌水；

37℃酶切处理；

胶回收双酶切的质粒pET15b产物；

（5）目的片段与载体质粒pET15b的连接：

双酶切PCR产物和双酶切质粒pET15b产物进行连接反应：10μL反应体系 中含有1μL10×T₄DNA Ligase Buffer、6μL双酶切的PCR产物、2μL双酶切的 质粒pET15b、0.5μL T₄DNA Ligase、其余为无菌水；

16℃反应12-24小时，得pET-15b-hSDF-1α。

hSDF-1αcDNA开放阅读框为270bp，编码89个氨基酸，N端19个氨基酸 为信号肽序列，在设计引物时仅克隆成熟肽序列213bp，编码70个氨基酸。本 文根据NCBI中发表的hSDF-1αcDNA序列设计引物，通过PCR扩增出hSDF-1α 基因，将其克隆入pET15b构建非融合表达载体pET15b-hSDF-1α及重组大肠杆 菌DH5α/pET15b-h SDF-1α。

本发明的又一目的在于利用上述重组载体pET-15b-hSDF-1α进行hSDF-1α 的诱导表达。具体是将所述人源基质细胞衍生因子1α的表达载体导入大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞中对人源基质细胞衍生因子1α进行诱导表达。

上述诱导表达过程包括：

（一）利用所述的人源基质细胞衍生因子1α的表达载体和大肠杆菌 BL21(DE3)构建重组菌BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α；

（二）对重组菌进行BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α诱导处理，对hSDF-1α诱 导表达。

上述步骤（二）中将重组菌BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1а接种于含有Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡培养；次日，按体积比1%的接种量接种菌液至 含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.6，加入诱导 剂IPTG，使IPTG的最终浓度为1.0mmol/L，30℃条件下诱导处理后，离心收 集菌体。

本发明将重组载体pET15b-hSDF-1α转化受体菌E.Coli BL21(DE3)，构建了 工程菌E.Coli BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α，菌株经IPTG诱导表达，SDS-PAGE 分析，大约在10kD处可以明显观察到目的蛋白条带，实现了对目标蛋白的表 达。

本发明的hSDF-1α在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式存在。

上述诱导表达过程进一步还包括以下步骤：

冰浴条件下超声破碎诱导处理后的重组菌BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α，之 后离心收集沉淀物，超声破碎时所用的超声破碎裂解液由10mmol/L Tris-HCL、 5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0，每克重组菌BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α 使用10mL超声破碎裂解液；

沉淀物先用洗涤液A重悬，之后收集沉淀；接着再用洗涤液B重悬沉淀物， 收集沉淀为包涵体；其中洗涤液A由体积比为1%的Triton-X100、10mmol/L  Tris-HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；洗涤液B由0.5mol/L盐酸胍、 10mmol/L Tris-HCL，5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；

利用变性液重悬包涵体，20-30℃静置40-60min，之后离心收集上清液；其 中所述变性液是由浓度为6mol/L盐酸胍、体积比为7/10⁵的β-巯基乙醇、10 mmol/L Tris-HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；每克包涵体使用5mL 变性液；

上清液中加入复性液得复性样品，所述复性液是由1mmol/L还原型谷胱甘 肽、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、10mmol/L Tris-HCL、5mmol/L EDTA组成， 且pH为8.0；每体积上清液使用20体积复性液；复性液以滴加方式加入上清液中，且在12-48小时滴加完；

将复性样品离心收集得上清液样品，用阳离子交换柱SP Sepharose F.F.1mL 预装柱对上清液样品进行纯化得到目标蛋白；分离纯化时所用平衡液A液的组 分有20mmol/L Tris-HCL、0.3～0.4mol/L NaCl，pH为8.5，且用0.45μm水 性膜过滤；洗脱液B液：在平衡液A液中加入1mol/L NaCl，且用0.45μm水 性膜过滤；洗脱条件：梯度0%洗脱液B液～100%洗脱液B液、洗脱体积20mL、 洗脱流速1.0mL/min、紫外检测波长280nm。

利用Sepherdex G-25柱对目标蛋白进行脱盐，收集280nm色谱峰对应的分 离物；脱盐时所用缓冲液为：10mmol/L PB，pH7.0。

本发明对诱导后的菌株进行超声破碎，离心后分别取上清和沉淀，经 Tris-tricine-SDS-PAG分析，目标蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体细胞中。 对包涵体进行洗涤、变性及稀释复性处理得到的上清经强阳离子交换柱SP  Sepharose F.F.初步分离纯化，得到重组目标蛋白hSDF-1α。将高盐的蛋白溶液经 凝胶过滤层析进行除盐并真空冷冻干燥，得到疏松、白色的棉絮状的目标蛋白 hSDF-1α。

附图说明

图1为实施例1中PCR产物的电泳分析结果图，其中，M泳道代表DL2000、 1-4泳道代表PCR产物；

图2为实施例1中胶回收PCR产物的凝胶电泳检测结果图，其中，M泳道 代表DL2000、1泳道代表胶回收的hSDF-1α基因；

图3为实施例1中PCR产物双酶切的电泳检测结果图，其中，M泳道代 表DL2000、1-3泳道代表酶切PCR产物；

图4为实施例1中质粒pET15b双酶切的电泳检测结果图，其中，M泳道 代表Middle Marker、1-3泳道代表双酶切PET15b、4泳道代表未酶切PET15b

图5为实施例1中重组质粒pET15b-SDF1α的双酶切鉴定结果图，其中， M泳道代表Middle Marker、1-4泳道代表双酶切的pET-15b-SDF1α；

图6为实施例1中重组质粒pET15b-SDF1α的测序鉴定结果图；

图7为实施例2重组菌E.Coli BL21(DE3)/pET15b-SDF1α的诱导表达的电泳 检测结果图，该图中1-2泳道为未诱导菌体；3-4泳道为IPTG诱导后的菌体， M泳道为蛋白Marker（从上到下依次为100，30，25，20，15，10，5and 3.4kD）；

图8诱导为实施例2表达产物hSDF-1α的可溶性分析电泳检测结果图，1-2 泳道为破碎沉淀，3-4泳道为破碎上清，M泳道为蛋白Marker（从上到下依次 为100，30，25，20，15，10，5and3.4kD）；

图9为实施例2复性样品在SP Sepharose F.F色谱柱上的分离图谱；

图10为实施例3经SP Sepharose F.F.层析所得蛋白组分的SDS-PAGE分析 结果图，1-2泳道为图10中流川峰Ⅰ；3、4、5和6泳道为图10中色谱峰Ⅱ； M泳道为蛋白Marker（从上到下依次为100，30，25，20，15，10，5and3.4 kD）；

图11为实施例3经Sepherdex G-25层析所得蛋白组分的SDS-PAGE分析 1-2泳道为脱盐色谱峰；M泳道为蛋白Marker（从上到下依次为100，30，25， 20，15，10，5and3.4kD)；

图12为THP-1细胞图；

图13为重组hSDF-1α体外促THP-1细胞的趋化活性图，其中(a)为0ng/mL  hSDF-1α组；(b)为10ng/mL hSDF-1α组；(c)为100ng/mL hSDF-1α组；(d)为 500ng/mL hSDF-1α组；

图14为pET-15b的多克隆位点图。

具体实施方式

参考图14，本发明选用质粒pET15b构建不带标签的非融合重组表达载体， 上游引物可选用NcoⅠ作为酶切位点，下游引物可选用NdeⅠ、XhoⅠ或BamHⅠ 作为酶切位点，在相同条件下对带有重组体质粒的重组菌进行表达，结果发现 选用NcoⅠ和BamHⅠ两个酶切位点时目标蛋白表达量较高。因此，最终确定 NcoⅠ、BamHⅠ为最优双酶切位点。

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1：

该实施例所用材料：

带有hSDF-1αcDNA片段的重组质粒pCMV-SPORT6-SDF-1α购自Gene  Copoeia公司；pET15b原核表达载体、大肠杆菌DH5α购自北京鼎国昌盛生物 公司。

该实施例所用培养基及配制试剂：

LB固体培养基：蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、琼脂1.5g、酵母提取物0.5g， 溶于100mL蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB液体培养基：称取蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、酵母提取物0.5g，溶于 100mL蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min。

100mg/mL Amp：1.0g Amp溶于8mL蒸馏水中，定容至10mL，用0.22μm 滤器超虑除菌，分装后贮于4℃冰箱中备用。

50×TAE电泳缓冲液（2mol/L Tris-HAC，100mmol/L EDTA，pH8.0）： Tris碱121.15g，EDTANa₂·2H₂O18.6g于烧杯中，向烧杯中加入约300mL 蒸馏水，充分搅拌均匀，加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解，加蒸馏水定容至1 L后，调pH至8.0，室温保存。

该实施例表达载体pET15b-hSDF-1α的构建具体包含以下操作步骤：

（1）hSDF-1αcDNA序列PCR引物设计

根据美国国立生物技术信息中心NCBI（NM_199168）提供的hSDF-1αcDNA 序列设计引物，去掉信号肽仅克隆成熟肽序列213bp，并在两端插入NcoⅠ， BamHⅠ酶切位点及保护碱基，设计合成引物序列为：

上游引物：5ˊGATGCCATGGACGGGAAGCCCGTCAGC3ˊ(下划线为 NcoⅠ酶切位点，27bp)

下游引物：5ˊCGCGGATCCTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGT3ˊ（下 划线为BamHⅠ酶切位点，35bp）

（2）hSDF-1α基因的PCR扩增

PCR扩增的模板为带hSDF-1αcDNA片段的重组质粒 pCMV-SPORT6-SDF1α，模板浓度为0.2324ng/μL；

上游引物、下游引物浓度均为10μmol/L；

PCR反应体系50μL：25μL Premix、1μL模板质粒、1μL上游引物、1μL 下游引物、无菌水补足至50μL；

PCR的反应液在冰上配制，然后置于PCR仪上进行反应。

PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，60℃退火30s， 72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；

PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，表明扩增 出目的条带，大小约230bp，与理论相符。

（3）PCR产物的胶回收

用Gel Extraction Kit回收PCR产物，首先将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳， 胶浓度1.5%，电源80V恒压电泳。

在指示带跑至二分之一的位置停止电泳，凝胶成像仪紫外灯下观察电泳条 带并拍照。

在紫外灯下用刀片切下含有目的片段的凝胶放入离心管中，按照每克凝胶加 1ml的Binding Buffer计算，向其中加入对应量的Binding Buffer，60℃水浴加 热7min，使凝胶完全融化；

将混合液加入已经平衡好的分离柱中，分离柱的容量为700μl，10000g离心 1min，倒掉收集管中的液体；向分离柱中加入700uL SPW Wash Buffer（已加 入100mL无水乙醇），10000g离心1min，弃下液，将该洗涤过程再重复一遍； 13000g空离2min，彻底除去分离柱中剩余的乙醇；

将分离柱放入1.5mL离心管上，加入40μL Elution Buffer，室温放置2min 洗脱DNA，13000g离心1min，离心管收集的溶液即为纯化的PCR产物。

在紫外灯下切下含有目的片段的凝胶，胶回收样品两管，40μL/管，取5μL 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，仅在230bp处有一条目标条带， 其分子量与目的基因的理论分子量一致，进而说明了扩增出目的基因，同时利 用微量紫外分光光度计测得纯化后的PCR产物浓度为35.4ng/μL。

（4）含有抗Amp基因的pET15b质粒的制备

挑有质粒pET15b的DH5α单菌落接入5mL含有Amp的LB培养基中，37 ℃、220r/min振荡培养12h；吸取3mL菌液于离心管中，6000g离心5min， 弃培养液收集菌体。

平衡分离柱：取750μL GPS缓冲液加入分离柱中，静置4min，12000g离 心2min，弃去液体即为平衡好的分离柱。

在菌体中加入250μL溶液Ⅰ（已加入RNase A），吹吸使其完全分散，溶液 Ⅰ含有的葡糖糖成分可以维持细胞的渗透压，使细胞很好的悬浮，不会立即沉 降；然后加入250μL溶液Ⅱ，混匀后静置2min，使细胞充分裂解以获得澄清 的细胞裂解液；加入350μL溶液Ⅲ，摇晃离心管使溶液Ⅲ分散均匀，直至产生 白色沉淀；12000g离心10min，吸取上清至平衡好的分离柱中，10000g离心1 min，弃下液；加入500μL Buffer HB，10000g离心1min，弃下液；加入500μL  DNA Wash Buffer，10000g离心1min，弃下液，重复该步骤；空柱13600g离 心2min；

换离心管后加入40μL Elution Buffer，放置2min，使DNA能够完全溶于 Buffer中，13600g离心2min收集离心液。

（5）双酶切PCR产物

PCR产物酶切体系40μL：NcoⅠ1μL、BamHⅠ1μL、10×K Buffer4μL、 0.1%BSA4μL、PCR产物30μL、无菌水补足至40μL；加入0.2mL PCR管中， 混匀后于37℃（PCR仪孵育）酶切5h。将双酶切的PCR产物和载体质粒pET15b 分别跑电泳后胶回收。

PCR产物双酶切后经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，2、3泳道条 带很亮，说明双酶切的PCR产物浓度较大。

（6）双酶切载体质粒pET15b

载体质粒pET15b酶切体系20μL：NcoⅠ1μL、BamHⅠ1μL、10×K Buffer 2μL、0.1%BSA2μL、pET15b质粒10μL、无菌水补足至20μL；加入0.2mL PCR 管中，混匀后于37℃（PCR仪孵育）酶切5h。将双酶切的PCR产物和载体质 粒pET15b分别跑电泳后胶回收。

pET15b质粒双酶切后经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图4所示，pET15b 质粒酶切较完全。

表2PCR产物和质粒pET15b双酶切后胶回收的紫外检测结果

（7）目的片段与载体质粒pET15b的连接

将回收的酶切PCR产物和载体质粒pET15b进行连接反应，反应体系10μL： 10×T₄DNA Ligase Buffer1μL、PCR产物6μL、质粒pET15b 2μL、T₄DNA Ligase0.5μL、无菌水补足至10μL；加入0.2mL PCR管中，混匀 后于16℃（PCR仪孵育）连接过夜，得pET-15b-hSDF-1α。

将实施例1的连接产物pET-15b-SDF1α转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞 中，对平板上的单克隆提质粒双酶切鉴定，并对鉴定的阳性克隆进行测序鉴定。 具体过程如下：

（1）DH5α感受态细胞的制备

接种大肠杆菌DH5α单菌落至5mL不含AMP的LB液体培养基中，37℃、 220rpm振荡培养过夜；

次日，取100μL（1%接种量）培养液转接入10mL不含AMP的LB液体 培养基中，37℃、220rpm振荡培养2～3h(OD₆₀₀=0.4～0.6)，停止培养；

无菌条件下将菌液分装到预先在冰上放置的无菌的1.5m离心管中，冰上放 置10min；

然后4℃、6000rpm离心5min，倒出培养液，细胞沉淀用200μL冰预冷 的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬，放在冰上0℃保温30min，得到感受态细胞DH5α 悬液；

（2）将实施例1构建的pET-15b-SDF1α转化大肠杆菌感受态细胞DH5α

无菌条件下向200μL的感受态细胞DH5α悬液中加入10μL连接产物 pET-15b-SDF1α（阳性对照pET-15b10μL，阴性对照不加质粒），轻轻混匀，静 置于冰上30min；

将离心管放入42℃的水浴中热击90s，将离心管转移至冰上，让其冷却3 min；加入790μL无抗生素的LB液体培养基，180r/min，37℃振荡培养60min， 使菌体复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

然后取200μL菌液均匀地涂布到含有抗生素Amp的LB平板上，同时作以 下对照：

对照1：是将pET15b质粒转化感受态细胞，涂布在抗性LB平板上、在37 ℃培养箱过夜培养16～24h。

对照2：是取100μL感受态细胞，将其涂布在抗性LB平板上、37℃培养 箱过夜培养16～24h。

对照3：将100μL感受态细胞涂布在没有抗性的平板上、37℃培养箱过 夜培养16～24h。

在含Amp的抗性板中长出了20几个单克隆（连接产物转化的平板）；对照 1长出了几百个单克隆，对照2平板上没有长出单克隆，对照3有菌落密密麻麻 地长满了整个平板。

（3）导入有pET-15b-SDF1α的大肠杆菌感受态细胞DH5α的培养

在转化成功的平板上挑单克隆接种于含有Amp的LB液体培养基，37℃、 220rpm振荡培养12h。

（4）重组质粒的提取

从上一步所得菌液中提取质粒，提取方法与实施例1中“含有抗Amp基因 的pET15b质粒的制备”中的提取方法相同。

（5）对该实施例1重组质粒的双酶切鉴定

酶切体系40μL：NcoⅠ1μL、BamHⅠ1μL、10×K Buffer4μL、0.1%BSA 4μL、提取的重组质粒20μL、无菌水补足至40μL；

在连接产物转化的平板中挑取几个单克隆，提取质粒，双酶切鉴定，结果 如图5，可看到2、3、4泳道在230bp左右有条带，初步说明目的基因已插入载 体pET-15b。

（6）对实施例1重组质粒测序鉴定

将酶切鉴定阳性的单克隆送去上海生物工程公司测序，采用T7promoter通 用引物作为起始引物单向测序。

序列测定采用T7promoter作为起始引物，测序结果如图6，序列比对结果 显示在测序质粒的61-276之间的碱基对与目的基因完全配对，构建的重组载体 序列、读码框正确。

hSDF-1αcDNA序列：

ATGGACGGGAAGCCCGTCAGCCTGAGCTACAGATGCCCATGCCGATTCTTC GAAAGCCATGTTGCCAGAGCCAACGTCAAGCATCTCAAAATTCTCAACAC TCCAAACTGTGCCCTTCAGATTGTAGCCCGGCTGAAGAACAACAACAGAC AAGTGTGCATTGACCCGAAGCTAAAGTGGATTCAGGAGTACCTGGAGAAA GCTTTAAACAAGTAA

hSDF-1α基因相应的蛋白质氨基酸序列：

Met Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn

Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile

Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys

实施例2：

该实施例中利用实施例1制备的重组质粒pET15b-hSDF-1α进行hSDF-1α 的诱导表达，同时对该实施例所得的表达产物进行相关试验分析。

该实施例所用材料：

大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞；快流速SP琼脂糖凝胶Sulphopropyl  Sepharose Fast Flow（SP Sepharose F.F.；0.7×2.5cm i.d.）预装柱和葡聚糖G-25凝胶 排阻柱Sephadex G-25（Sephadex G-25；5×150mm i.d.）购自GE公司。

该实施例所用培养基及主要试剂配制：

（1）100mg/mL Amp的配制：将1000mg Amp溶于8mL水中，定容至10mL， 0.22μm滤器超虑除菌，分装，贮于4℃冰箱中备用。

（2）400mmol/L IPTG的配制：称取0.952g IPTG溶于8mL去离子水，定 容至10mL，0.22μm滤器超虑除菌，分装，贮于4℃冰箱中备用。

（3）Amp+（含有Amp的）LB液体培养基：酵母提取物0.5g，蛋白栋1g， NaCl1g，溶于100mL去离子水中。配好后纱布报纸封口，121℃高压蒸汽灭 菌20min。待冷却后加入100μL配制好的100mg/mL Amp，使Amp的终浓度为 100ug/mL。置于4℃冷库备用。

（4）10mmol/L PB pH7.0配制：量取61.0mL0.2mol/L Na₂HPO₄、39.2mL 0.2mol/L Na₂HPO₄置于烧杯中，加水定容至2000mL。过凝胶过滤柱时用0.45μm 水膜过滤。

该实施例的主要操作步骤如下：

（1）菌种的培养及诱导表达

CaCl₂转化法将10μL的重组质粒转化200μL BL21(DE3)感受态细胞，构建工 程菌BL21(DE3)/pET15b-hSDF-1α；

在转化的平板上挑取单克隆接种于5mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃，220rpm振荡培养12h；次日，按1%的接种量接种1mL的菌液至100mL 新鲜的含有Amp的LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.4-0.6，加 入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，30℃，220rpm诱导5h，离心收集菌体。

对该实施例2所得表达产物进行SDS-PAGE分析

分别取1mL未诱导与诱导的菌液，6000g离心5min，收集沉淀分别进行 SDS-PAGE分析。重组载体pET-15b-hSDF-1α转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导 表达后的菌种经SDS-PAGE分析，如图7所示，诱导与未诱导的菌体相比，可 以明显地观察到10kD处的目的条带，其分子量大小与理论分子量一致。

对该实施例2所得重组蛋白的表达形式进行鉴定

重组大肠杆菌发酵液于4℃、4500r/min离心15min，收集菌体沉淀称重， 按照1g:10mL的比例加入超声破碎裂解液（pH8.0，10mmol/L Tris-HCL，5 mmol/L EDTA），混匀，冰浴条件下超声破碎（400W，超10S停10S，60次 ×2）至菌液清亮，将悬浮液于4℃，10000r/min离心30min，分别收集上清 和沉淀，SDS-PAGE分析确定目标蛋白的表达形式。

重组蛋白的可溶性分析如图8所示，在重组表达菌体裂解后的沉淀中10kD 处有明显的目的条带，说明hSDF-1α在大肠杆菌BL21(DE3)主要以包涵体的不 可溶形式表达。

实施例3：

该实施例中对实施例2所得的发酵液进行如下处理：

（1）包涵体的制备和洗涤

0.85L诱导培养的大肠杆菌发酵液，4℃、4500r/min离心15min，弃去 培养液并将菌体沉淀称重，按照1g:10mL的比例加入超声破碎裂解液（10 mmol/L Tris-HCL、5mmol/L EDTA，pH8.0），充分搅拌混匀避免块状菌体产 生。

冰浴条件下超声破碎（400W，超10S停10S，60次×2）至菌液清亮，超 声磨碎的在4℃，10000r/min离心30min，收集沉淀。

沉淀先用洗涤液A（体积比1%Triton-X100、10mmol/L Tris-HCL、5mmol/L  EDTA，pH8.0）重悬，吹吸洗涤，4℃、10000r/min离心30min，收集沉淀； 再用洗涤液B（0.5mol/L盐酸胍、10mmol/L Tris-HCL，5mmol/L EDTA，pH8.0） 重悬，吹吸洗涤，4℃、10000r/min离心30min，收集沉淀即为洗涤后的包涵 体。

（2）包涵体的变性和复性

洗涤后的包涵体按照1g:5mL的比例加入变性液（含6mol/L盐酸胍、体积 比7/10⁵β-巯基乙醇的,10mmol/L Tris-HCL，5mmol/L EDTA，pH8.0,），重悬 混匀，室温下静置40-60min，4℃，10000r/min离心30min，收集上清液，

采用稀释复性的方法，在上清液中按1:20（V/V）的比例加入复性液（含1 mmol/L还原型谷胱甘肽、0.2mmol/L化型谷胱甘肽的、10mmol/L Tris-HCL、5 mmol/L EDTA，pH8.0），复性液以类似吊瓶的系统缓慢滴加入上清，并用磁 力搅拌器缓慢搅拌，复性过夜（48h滴加完）。

（3）重组hSDF-1α的纯化

将复性样品离心收集上清液样品，用强阳离子交换柱SP Sepharose F.F.1mL 预装柱对上清液样品进行纯化。

平衡液A液：组分有20mmol/L Tris-HCL、0.3～0.4mol/L NaCl，pH8.5，配 置好后0.45μm水性膜过滤溶液。

洗脱液B液：在平衡液A液中加入1mol/L NaCl，配置好后0.45μm水性 膜过滤溶液。

洗脱条件：梯度0%B～100%B，洗脱体积20mL，洗脱流速1.0mL/min， 紫外检测波长280nm。

在使用离子交换柱时，要保证平衡液A液电导高于样品电导5～10mS。

梯度洗脱进行分离，流速1mL/min，首先用5～10个柱体积的A液平衡分 离柱，直到280nm紫外吸收基线及电导稳定；将样品的pH调至8.5，加载到分 离柱上，上样前将紫外280nm基线归零；用5～10个柱体积的A液平衡分离柱， 直到流川峰Ⅰ紫外基线及电导稳定，即所有未结合物质都被冲洗出了分离柱； 用10～20个柱体积的梯度进行洗脱，设定流速为1.0mL/min，0%～100%B20min。 紫外检测波长280nm。收集色谱峰Ⅱ；用5个柱体积的100%B液冲洗分离柱以 洗脱任何残留的离子型结合物质；用5～10个柱体积的A液再平衡分离柱，直到 基线及电导到达所需值。SDS-PAGE分析流川峰Ⅰ及色谱峰Ⅱ。通过上述离子 交换柱收集到色谱峰Ⅱ对应的样品。

如图9，在0%B～100%B的洗脱过程中，仅出现一个峰Ⅱ，经SDS-PAGE 分析如图10，流穿峰Ⅰ在10kD处无条带，色谱峰Ⅱ有一条较亮条带且无杂带， 由于经离子交换层析所收集的蛋白溶液盐浓度较大，所以有拖带。结果表明经 SP Sepharose F.F.柱初步分离纯化，可以得到目标蛋白。

（3）重组蛋白的脱盐及冻干

将分离得到的目标蛋白溶液用Sepherdex G-25柱进行脱盐。

缓冲液：pH7.010mmol/L PB。

用缓冲液平衡层析柱，直到紫外280nm基线及电导稳定；上样（色谱峰Ⅱ 对应的样品），上样体积不能超过柱体积的30%；再用缓冲液洗脱样品，收集 280nm色谱峰，用缓冲液一直冲洗柱子电导稳定。SDS-PAGE分析色谱峰，如 图11，在10kD处有目标条带且无杂带，分离的蛋白纯度较高。将脱盐后收集 的100mL蛋白溶液真空冷冻干燥后可获得100mg重组hSDF-1α。

将脱盐后的重组蛋白质溶液在－40℃冰箱过夜冷冻于10cm培养皿中过 夜，次日用真空冷冻干燥仪冻干，将冻干的粉末保存于干燥箱。

采用Transwell细胞迁移实验对实施例3所得蛋白质活性进行鉴定：

试验用材料：

人THP-1单核细胞（购自ATCC），改良型RPMI-1640培养基购自HyClone 公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；8μm聚碳酸酯膜Transwell小室购自 Corning公司；青霉素-链霉素双抗购自北京鼎国昌盛生物公司。

试验用培养基及试剂配制：

（1）细胞培养液：取基础培养基164044.5mL置于100mL试剂瓶，胎牛 血清5mL，双抗500μL，混匀后置于4℃冰箱备用。

（2）冻存液：10%DMSO+90%胎牛血清，混匀后置于4℃冰箱保存。

试验方法：

重组hSDF-1α的活性测定用8μm孔径的Transwell迁移实验检测重组 hSDF-1α趋化单核细胞THP-1迁移。THP-1细胞（培养3～5代）先用含0.2%BSA 的无血清培养基RPMI-1640饥饿12h，收细胞，用含0.5%胎牛血清的 RPMI-1640重悬定细胞浓度为3×10⁵/mL。

将实施例2脱盐后冻干的hSDF-1α粉末配成10ng/mL、100ng/mL、500 ng/mL三种浓度，含0.5%胎牛血清的RPMI-1640作为对照，每种浓度分别取 600μL加入24孔板，一式三份，将插入式小室放入24孔板，每孔加200μL的 细胞悬液。放入CO₂培养箱中孵育10h，取出小室，在200×显微镜下计数24 孔板每个孔溶液中所含细胞的数目。

试验结果表明：

THP细胞的培养THP-1细胞培养3～5代，在低倍镜（10×10）下，细胞透 亮，呈单个球形，大小均一，如图12，细胞状态良好。

采用transwell细胞迁移实验来测定重组hSDF-1α对THP-1细胞的趋化活性。以 未加hSDF-1α的含0.5%胎牛血清的RPMI-1640作为对照，加入hSDF-1α浓度 分别为10ng/mL、100ng/mL、500ng/mL时迁移到下室的细胞数明显地多于对 照组，说明纯化后的重组hSDF-1α对THP-1细胞具有趋化活性。结果如图13 所示。