一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法

摘要

本发明公开了一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，具体包括以下步骤：（1）家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因(

说明书

技术领域

本发明涉及一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法。

背景技术

家蚕（Bombyx mori L.）属于鳞翅目经济昆虫，在我国已经被人工驯养5700多年，经过长期的人工选择和培育，形成了具有不同生产性能的品种资源。但由于家蚕长期在室内饲养，其对化学农药的抗性较弱。每年由于化学农药引起中毒，我国的蚕茧产量减30%左右。

有机磷农药特别是辛硫磷农药，是化学农药中常用的一种，有机磷使家蚕中毒的机理是进入蚕体的机磷农药和乙酰胆碱酯酶(AChE)结合，使其活性降低，不能水解神经突触中神经传递物质乙酰胆碱，导致乙酰胆碱连续对突触后膜刺激，引起家蚕抽搐而中毒死亡。

家蚕具有两种乙酰胆碱酯酶基因类型，已有的研究表明，其中1型(Bmace1)的基因表达量是2型(Bmace2)100倍以上；并且Bmace1的功能和其对农药的抗性相关。

因此研究一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，以制备出对辛硫磷农药敏感性较低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶，为转基因培育家蚕抗药性品种提供重要素材，对于提高家蚕对辛硫磷的抗性具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶（BmAChE1）对辛硫磷敏感性的方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，包括以下步骤： 

（1）克隆家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因，具体为取经常规饲养的家蚕幼虫，提取家蚕总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA；以家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因为目的基因设定PCR扩增引物，进行RT-PCR扩增；将扩增产物克隆进pGEM-T载体获得重组质粒，对质粒DNA进行测序，选出序列正确的质粒DNA；

所述PCR引物为SEQ ID No.1：TTGTGGGTGTAGGTGCCAGCGACGGTAT以及SEQ ID No.2：ACTTATATGGTGTATTTGAACAGTGCTGTGCCTGTA；

（2）定点突变家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因的四个核苷酸位点，具体为以步骤（1）中测序正确的质粒DNA为模板，首先以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；再以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.5、SEQ ID No.6引物进行第二次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；最后以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.7、SEQ ID No.8引物进行第三次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序鉴定；选取测序正确的序列即为突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因序列；

所述四个核苷酸位点为907位G→T、986位G→C、1660位C→T以及1661位T→C；

（3）定点突变基因的表达，具体为将步骤（2）获得的突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因去除信号肽后克隆到杆状病毒转移载体中，转化E. coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒，转染sf9细胞，对sf9细胞表达产物进行纯化即获得了对辛硫磷敏感性低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶；

所述引物SEQ ID No.3为：TTATTCGGTGAATCATCGGGAGCCGTGTCAG；

SEQ ID No.4为：CTGACACGGCTCCCGATGATTCACCGAATAA；

SEQ ID No.5为CTATCATGCAGTCTGCAGCCGCCACTGCTCC；

SEQ ID No.6为GGAGCAGTGGCGGCTGCAGACTGCATGATAG；

SEQ ID No.7为：GTTCGGGGAGCCTTCCAATCCCGGGAAA；

SEQ ID No.8为：TTTCCCGGGATTGGAAGGCTCCCCGAAC。

上述技术方案中，步骤（1）中对家蚕的个体进行总RNA的提取，需要去除中肠内容物，以减少食物残渣对实验结果的影响。

上述技术方案中，所述步骤（1）中采用DNA酶对总RNA处理，以减少残留的基因组DNA对实验的影响。

上述技术方案中，步骤(2) 中，通过三次PCR扩增对四个核苷酸位点突变， 1660位C→T、1661位T→C由于靠在一起，可以在一次PCR扩增中进行两个突变，提高生产效率。

上述技术方案中，重组病毒转染sf9细胞后，一般经过3天左右细胞出现病变，要根据蛋白纯化的需要量，取细胞上清进行扩大感染。

上述技术方案中，在PCR扩增后，采用常规技术克隆扩增产物，制备质粒DNA，再经过酶切和测序验证，筛选出阳性克隆产物。

本发明中，家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷的敏感性变现为酶与辛硫磷的结合能力，降低敏感性即消弱了家蚕1型乙酰胆碱酯酶与辛硫磷的结合能力，从而保持了酶活性。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

1．本发明提供了一种降低BmAChE1对辛硫磷敏感性的方法，由此方法获得的BmAChE1可以作为转基因培育家蚕抗药性品种的素材，对于提高家蚕对有机磷农药的抗性研究具有重要意义；

2．本发明的方法通过对Bmace1相关位点进行突变实现，操作简单；通过真核表达系统体外表达证明，制备的BmAChE1降低了对辛硫磷的敏感性，为家蚕的转基因应用效果提供了保证。

附图说明

图1为实施例一中Bmace1定点突变后测序谱图；

图2为实施例一中重组wAChE1和mAChE1的SDS-PAGE分析和Western blotting分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述:

实施例一：一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶（BmAChE1）对辛硫磷敏感性的方法

材料及设备：家蚕幼虫采用苏州大学育成的品种（苏秀×春丰）；PCR仪采用ABI veriti 96型PCR仪；冷冻离心机为久保田7300型。

（1）总RNA提取及cDNA的制备

家蚕常规饲养至5龄第3天，去除中肠内容物后，经液氮冷冻后，采用宝生物工程(大连)有限公司RNAiso reagent提取总RNA，采用DNA酶处理后，利用RTase M-MLV (RNaseH-)进行反转录制备cDNA。

（2）Bmace1的克隆

根据Bmace1的序列（GenBank Accession No. DQ186605）ATG上游+26位设计引物SEQ ID No.1：TTGTGGGTGTAGGTGCCAGCGACGGTAT，下游-2029设定引物SEQ ID No.2：ACTTATATGGTGTATTTGAACAGTGCTGTGCCTGTA ，利用Pfu高保真酶进行PCR扩增，PCR反应程序：94℃预变性3 min，然后98℃ 20 sec、68℃ 3 min 30 sec 35个循环，最后72℃延伸10 min。采用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，采用T4 DNA连接酶连接纯化产物和pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选的方法挑选白斑，经LB液体培养基（Amp⁺）培养10小时后，提取质粒DNA，经pstⅠ酶切鉴定获得重组质粒(Bm-ace1-pGEM-T)，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

（3）Bmace1的定点突变

以步骤（2）中经测序鉴定正确的Bm-ace1-pGEM-T质粒DNA为模板，首先以SEQ ID No.3，SEQ ID No.4为引物，利用Pfu高保真酶对G907T靶标碱基进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序。正确序列再用SEQ ID No.5，SEQ ID No.6引物对G986C靶标碱基进行第二次PCR扩增，同样进行克隆和测序。最后再采用SEQ ID No.7和SEQ ID No.8引物对C1660T、T1661C靶标碱基进行第三次PCR扩增，再进行克隆和测序鉴定。表1为上述设计的引物；附图1为上述Bmace1定点突变后测序图谱；其中A，B，C代表突变的位点，分别对应G907T、G986C以及C1660T、T1661C；星号表示突变的碱基。

表1　定点突变引物的设计　

（4）真核表达重组转移载体 pFastBacTMHT B-ace1的构建和鉴定

分析野生型（wBmace1）和定点突变型（mBmace1）AChE基因的读码框，设计含有限制性内切酶位点的通用引物SEQ ID No.9，SEQ ID No.10（表2），从pUC-wace1和pUC-mace1中扩增ace1片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，分别用XbaI和XhoI双酶切，回收酶切产物后与 pFastBac^TM HT B 连接，转化 E. coli DH10Bac感受态细胞，PCR方法筛选阳性重组质粒 pFastBac^TM HT B-wBmace1和pFastBac^TM HT B- mBmace1，用 XbaI和 XhoI对重组转移载体双酶切，验证ace1 插入 pFastBac^TMHT B 质粒的正确性。

表2  PCR引物设计

（5）重组杆状病毒质粒 Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1的构建和鉴定

按照Invitrogen公司的Bac to Bac说明书，提取鉴定正确的重组质粒 pFastBac^TM HT B-wBmace1和pFastBac^TM HT B-mBmace1 后转化大肠杆菌 Ac DH10Bac感受态细胞，转移质粒在辅助质粒提供的转座酶作用下发生转座，转移到杆状病毒穿梭载体bacmid中。将复苏后的菌液涂布于含有X-gal 100 μg/mL、IPTG 40 μg/mL、庆大霉素7 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、四环素10 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL的LB平板上，37℃培养48 h，挑取白色单菌落，接种于3 mL含有上述四种抗生素的SOC培养基中，过夜培养，碱裂解法提取重组杆状病毒质粒Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1，取蓝色菌落作为阴性对照。设计M13 上、下游引物对SEQ ID No.11 、SEQ ID No.12（表2），以及Bmace1基因特异性引物SEQ ID No.13（表2）与M13下游引物组合引物对鉴定插入序列的大小以筛选目的重组质粒 Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1。鉴定正确的质粒于4℃ 保存备用。

（6）重组杆状病毒质粒转染Sf9 细胞

提取重组杆状病毒质粒 Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1，按照Invitrogen公司脂质体转染说明书将鉴定正确的 Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1质粒转染 Sf9 细胞。转染步骤见附录方法重组病毒的转染部分。27℃培养3-4 d，在倒置显微镜下观察细胞生长状态。同时以野生型Bacmid转染的Sf9细胞以及无病毒感染的 Sf9 细胞作为对照。收集病毒感染的细胞上清于 4℃保存。沉淀经 300 g 离心 5 min，移去细胞和大的碎片，获得第1代病毒 P1。将 P1 病毒再次感染细胞获得高滴度的重组病毒液。

（7）重组病毒表达目的产物的检测

分别取经重组Bacmid（Bacmid-wBmace1 和Bacmid-mBmace1）感染72 h 的病变Sf9细胞和同样处理的阴性对照。12 000 rpm 离心5 min。取上清，在沉淀中加入200 μL上样缓冲液，充分裂解，100℃ 煮沸5 min。12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，考马斯亮蓝染色检验结果。用浸入式电转移法将SDS-PAGE电泳凝胶分离样品转移至PVDF膜上，然后进行脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h、6×His一抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次每次5 min，羊抗兔二抗孵育1 h，最后按照伯乐的AP Conjugate Substrate Kit说明书显色。

附图2为上述重组wAChE1和mAChE1的SDS-PAGE分析和Western blotting分析；左图为Western blotting结果，右图为SDS-PAGE结果（M. 预染蛋白marker；1-4分别为mBmace1、wBmace1，对照的空Bacmid以及Sf9细胞的表达产物）；结果表明，在分子量76 kDa处有特异表达的目的蛋白，证明目的蛋白被正确表达。

（8）表达产物的纯化及生物活性测定

采用Invitrogen 公司的产品（Ni-NTA agarose和纯化柱），纯化根据说明书进行。

将纯化后的10 μL酶液的与辛硫磷（33.4 μM）溶液10 μL混匀与酶标板中，37 ℃ 放置10 min 让酶和辛硫磷充分结合，再按照南京建成科技有限公司的乙酰胆碱酯酶（AChE）测定试剂盒说明书测定AChE的剩余活力。

测定结果表明：m-Bmace1表达产物的剩余活力为14.12±0.03%，w- Bmace1表达产物的剩余活力为10.08±0.02%，经突变后Bmace1对辛硫磷的敏感性降低了40.8%。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学

<120>一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法

<160> 13

 

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

TTGTGGGTGTAGGTGCCAGCGACGGTAT                      28

 

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ACTTATATGGTGTATTTGAACAGTGCTGTGCCTGTA         36

 

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

TTATTCGGTGAATCATCGGGAGCCGTGTCAG                  31

 

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

CTGACACGGCTCCCGATGATTCACCGAATAA                     31

 

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

CTATCATGCAGTCTGCAGCCGCCACTGCTCC                    31

 

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

GGAGCAGTGGCGGCTGCAGACTGCATGATAG                 31

 

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

GTTCGGGGAGCCTTCCAATCCCGGGAAA                           28

 

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

TTTCCCGGGATTGGAAGGCTCCCCGAAC                        28

 

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

GCTCTAGAATGCGCGTGGTGTTGGCA                             26

 

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

CCGCTCGAGTTATATGGTGTATTTGAACAGTGC                   33

 

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

GTTTTCCCAGTCACGAC                                               17

 

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

CAGGAAACAGCTATGAC                                                17

 

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

AGGAAGGGAAAGGTGAG                                                17