二甲基乙二酰基甘氨酸的新用途及间充质干细胞的分离方法

摘要

本发明属于生物技术领域，主要涉及二甲基乙二酰基甘氨酸的新用途及间充质干细胞的分离方法。本发明的目的在于提供二甲基乙二酰基甘氨酸用于制备上调骨髓组织缺氧诱导因子-1表达的药物、制备增加骨髓间充质干细胞数量的药物、制备动员间充质干细胞的药物、制备间充质干细胞药物的用途。本发明还提供了一种利用二甲基乙二酰基甘氨酸分离间充质干细胞的方法。分离间充质干细胞的方法也更加简单高效，得到的外周血间充质干细胞具有体外成骨、成脂分化能力，而且可以更好地避免细胞污染。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及二甲基乙二酰基甘氨酸的新用途 及间充质干细胞的分离方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是具有强大增殖 能力和多向分化潜能的成体干细胞，可用于治疗骨、关节、肌腱等多 种组织损伤；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生等。同时MSCs  可支持造血，调节免疫功能，防治造血干细胞移植后移植物抗宿主病 （GVHD），具有广阔的临床应用前景。

MSCs动员（mobilization）是指MSCs脱离骨髓微环境进入外周循环的 过程。生理状态下成人外周循环中MSCs 含量极少。研究发现，在烧 伤、肌损伤、骨折、缺血等急性组织损伤发生时，可观察到MSCs 动 员现象。MSCs动员现象的存在提示：可通过应用动员剂或采用其他动 员措施促使MSCs释放至外周血，从而达到一定的治疗作用。有效的MS Cs动员具有低创性和及时性，可以避免体外培养后输注治疗存在的细 胞污染、培养周期长、容易错过治疗时间窗等缺点。因此，MSCs动员 的研究具有重要的临床意义。

生理情况下外周血中MSCs含量极低，不能分离到贴壁的MSCs。许多研 究者也曾尝试采用造血干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动 员MSCs，但结果令人失望。有作者报道采用G-CSF动员后在外周血中能 分离极少量的MSCs，但其在体外增殖能力非常有限，表现为检测不到 端粒酶的活性且端粒酶显著变短。学者王付维力等报道G-CSF联合AMD 3100对MSCs具有动员作用，但其动员效率很低。目前尚缺乏高效而安 全的MSCs动员剂。

在前期研究中，本项目组证实了缺氧诱导因子-1α (hypoxia-induc ible factor -1α, HIF-1α) 是缺氧诱导MSCs 动员的关键因子 ，论著全文“HIF-1α is essential for mesenchymal stem  cell mobilization into peripheral blood induced by hy poxia”发表于Stem Cells Dev.。HIF-1在缺氧诱导MSCs 动员中关 键作用的证实为安全有效动员剂的寻找提供了线索。

HIF-1 是目前发现的最重要的缺氧感受因子与转录因子。HIF-1 由 HIF-1α  及HIF-1β 两个亚基构成，其中HIF-1α为HIF-1 的调节性亚基。在 常氧状态下，HIF-1α 被脯氨酸羟化酶（PHD）羟化，与林希病肿瘤 因子(pVHL)结合后，由泛素-蛋白酶途径水解。而在缺氧时，由于羟化 过程障碍使HIF-1α 的泛素化作用受到抑制，不能被降解。PHD 是 HIF-1 降解反应的限速酶。脯氨酸羟化酶抑制剂（PHD inhibitor, PHI）通过抑制PHD 的活性减少HIF-1α 的羟化，阻断常氧状态下H IF-1α 的降解，从而稳定HIF-1α 的表达。

根据PHI 对PHD 的作用机制，可分为两类：1）Fe2+竞争剂包括氯化 钴（CoCl2）等；2）酮戊二酸类似物，包括DMOG、FG 系列小分子抑 制剂等。本课题组成员研究发现Fe2+竞争剂CoCl2具有动员MSCs的作用 ，然而，由于铁螯合剂本身具有铁流失等副作用，不能成为理想的MS Cs动员剂。因此目前尚缺少更为安全、高效的MSCs动员剂。本发明提 供了一种较G-CSF联合AMD3100效率更高，而较CoCl2更为安全有效的M SCs动员制剂，同时也提供了骨髓与动员来源外周血MSCs的分离方法。

发明内容

本发明的目的在于提供二甲基乙二酰基甘氨酸在有效动员MSCs药物的 新用途，及在制备间充质干细胞药物的用途。

二甲基乙二酰基甘氨酸用于制备上调骨髓组织缺氧诱导因子-1表达的 药物的用途。

二甲基乙二酰基甘氨酸用于制备增加骨髓间充质干细胞数量的药物的 用途。

二甲基乙二酰基甘氨酸用于制备动员间充质干细胞的药物的用途。

其中，所述药物中二甲基乙二酰基甘氨酸用量为20-80mg/kg。

二甲基乙二酰基甘氨酸用于制备间充质干细胞药物的用途。

二甲基乙二酰基甘氨酸和通过二甲基乙二酰基甘氨酸动员产生的间充 质干细胞作为有效成分用于制备间充质干细胞药物的用途。

其中，所述间充质干细胞药物为治疗骨、关节或肌腱损伤药物，或促 进神经细胞、心肌细胞或肝细胞再生的药物，或者支持造血，调节免 疫功能或防治造血干细胞移植后移植物抗宿主病的药物。

另外，本发明还提供了一种利用二甲基乙二酰基甘氨酸分离间充质干 细胞的 方法。

一种利用二甲基乙二酰基甘氨酸制备的药物分离骨髓来源或外周血来 源的间充质干细胞的方法，具体步骤包括：

所述分离骨髓来源的间充质干细胞的方法的步骤为：1）按20-80mg/k g剂量的二甲基乙二酰基甘氨酸腹腔连续注射7天；2）取骨髓细胞，离 心后用红细胞裂解液裂解红细胞，接种培养7天后换液，第14天得到原 代骨髓间充质干细胞；

所述分离外周血来源的间充质干细胞的方法的步骤为：（1）按20-80 mg/kg剂量的二甲基乙二酰基甘氨酸腹腔连续注射7天，促使间充质干 细胞动员进入外周血然后进行分离得到间充质干细胞；（2）采取外周 血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20% 胎牛血清的DME M培养基重悬，接种至培养板，培养7天后换液，取贴壁细胞继续培养 ，第14天得到外周血间充质干细胞。

一种分离外周血内间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采取外周血 ，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20% 胎牛血清的DMEM培 养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质 干细胞，所述外周血为利用二甲基乙二酰基甘氨酸促使间充质干细胞 动员进入的外周血。

进一步的，所述的外周血间充质干细胞高表达CD90，不表达CD45, 具 有体外成骨、成脂分化能力。

本发明的发明人研究发现，酮戊二酸类似物——二甲基乙二酰基甘氨 酸（DMOG）可通过与内源性的2-酮戊二酸竞争从而抑制PHD，从而稳定 HIF-1的表达，更好地用于MSCs体内动员，因此避免MSCs体外培养后输 注治疗存在的细胞污染、培养时间过长容易错过最佳治疗时间窗等缺 点。可以用于制备治疗骨、关节或肌腱损伤药物，或促进神经细胞、 心肌细胞或肝细胞再生的药物，或者支持造血，调节免疫功能或防治 造血干细胞移植后移植物抗宿主病的药物的用途。由于二甲基乙二酰 基甘氨酸（DMOG）比G-CSF联合AMD3100具有更高的动员效率，且避免 了CoCl2的铁流失等副作用，更为安全有效，为组织工程与再生医学等 提供了一种有效的制剂。

分离间充质干细胞的方法也更加简单高效，得到的外周血间充质干细 胞具有体外成骨、成脂分化能力，而且可以更好地避免细胞污染。

有学者研究发现，可通过G-CSF联合AMD3100给予后在兔外周血中培养 得到 了MSCs，但其动员效率低下。本研究结果显示，DMOG（20mg/kg、40m g/kg、80mg/kg）可显著增加外周血MSCs数量，较G-CSF联合AMD3100动 员效率有所提高。本发明研究组成员曾报道Fe2+竞争剂CoCl2可通过上 调HIF-1α信号通路诱导MSCs动员，然而，由于铁螯合剂本身具有铁流 失等副作用，不能成为理想的MSCs动员剂。本发明的发明人研究发现 ，酮戊二酸类似物——二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）可通过与内源 性的2-酮戊二酸，从而稳定HIF-1的表达，更好地用于MSCs体内动员， 由于二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）比G-CSF联合AMD3100具有更高的 动员效率，且避免了CoCl2的铁流失等副作用，更为安全有效，为组织 工程与再生医学等提供了一种有效的制剂。

附图说明

图1 二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）诱导小鼠MSCs动员至外周血，同 时可增加骨髓MSCs的数量。

图1 A：各处理组小鼠外周血CFU-F数。DMOG处理组较对照组外周血M SCs数量显著增加。

图中，CFU-F：成纤细胞样集落。NS组：生理盐水组。DMOG 20mg/kg 组：每天给予小鼠腹腔注射DMOG 20mg/kg/d，连续7天；DMOG 40mg /kg组：每天给予小鼠腹腔注射DMOG 40mg/kg/d，连续7天；DMOG 8 0mg/kg组：每天给予小鼠腹腔注射DMOG 80mg/kg/d，连续7天； #表 示与NS组相比，P<0.05。

图1B：各处理组小鼠骨髓CFU-F数。DMOG处理组较对照组外周血MSCs数 量显著增加。

图中，CFU-F：成纤细胞样集落。#表示与NS组相比，P<0.05。

图2:各处理组小鼠外周血CD45^-CD90⁺细胞的比例示意图，DMOG给予可 增加骨髓CD45^-CD90⁺细胞比例，同时可诱导CD45^-CD90⁺细胞动员至外 周血。

图2C：各处各处理组小鼠骨髓CD45^-CD90⁺细胞的比例。同对照组相比 ，DMOG各剂量处理组骨髓CD45^-CD90⁺细胞比例均增加。

图2D：各处各处理组小鼠外周血CD45^-CD90⁺细胞的比例。同对照组相 比，DMOG各剂量处理组外周血CD45^-CD90⁺细胞比例均增加。

图3为动员外周血来源MSCs（PB-MSCs）可以向成骨、成脂分化。

图3A：PB-MSCs成骨诱导分化第14天Von Konssa染色结果（100×）。

图3B：PB-MSCs成脂诱导分化第21天油红O染色结果（100×）。

图4各组小鼠骨髓细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、基质细胞衍 生因子-1α（SDF-1α）、血管生长因子（VEGF）的表达水平。

图4A DMOG可上调小鼠骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达 。

图4B、C、D：分别为HIF-1α、SDF-1α、VEGF相对表达定量结果。#表 示与NS组相比有显著性差异，P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中 所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到 的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开 的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。

所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积（W/V）百分比浓度或体 积/体积（V/V）百分比浓度。

具体MSCs动员技术方法如下：

1. 实验动物

清洁级雄性ICR 小鼠（8w，30g），浙江中医药大学实验动物中心提 供。

2. 主要试剂

（1）药品及细胞培养相关试剂

DMOG：美国Cayman公司； LG-DMEM培养液、胎牛血清（FBS）：Invi trogen (GIBCO）公司；0.25%胰酶-EDTA、青霉素-链霉素：Invitro gen (GIBCO）公司；淋巴细胞分离液：鼎国生物科技公司。

（2）抗体

抗HIF-1α抗体、抗SDF-1α抗体、抗 VEGF抗体、抗β-actin抗体： 美国Abcam公司；抗小鼠 CD90-PE 抗体、抗小鼠CD45-FITC抗体、荧 光抗体同型对照、辣根标记山羊抗兔二抗：联科生物公司。

（3）分子生物学实验试剂

核蛋白提取试剂盒、蛋白酶抑制剂 protease inhibitor cocktai l：Biovision 公司；蛋白质浓度测定(BCA)试剂盒：Thermo公司；P MSF、Tris碱、 SDS、β巯基乙醇等分子生物学实验常用试剂：Sigma公司；PVDF膜：  MILLPORE公司。

3. 方法

(1)动物分组与处理   

为检测不同剂量DMOG对MSCs 的动员作用，将ICR小鼠分为4组，每组 5只，分别为：①生理盐水对照组；②DMOG 20mg/kg组；③DMOG 40 mg/kg组；④DMOG 80mg/kg组。分别腹腔注射，每天给予上述剂量的 DMOG, 对照组给予相同体积的生理盐水,于7 天后采集小鼠外周血与 骨髓细胞，留取血清及骨髓上清、骨髓组织，用淋巴细胞分离液分离 外周血单个核细胞（PBMNCs）及骨髓单个核细胞（BMMNCs）。

(2)小鼠外周血及骨髓细胞提取  

各处理组到达相应处理时间后，分别取外周血单个核细胞与骨髓细胞 进行CFU-F法检测MSCs 数量与流式细胞术检测 CD45-CD90+细胞群比 例。4%水合氯醛10mL/kg腹腔注射麻醉ICR小鼠，用10mL注射器从后腔 静脉取血2mL，淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNCs），吸取白膜层 ，PBS洗涤 3次后，计数。无菌条件下取出股骨和胫骨，将肌肉、脂 肪及结缔组织仔细剔除干净，剪开骨骺端，露出骨髓腔；用注射器抽 取 PBS 液冲出骨髓细胞于离心管中；充分混匀，1000r/min，离心 10min；去掉上清，裂解红细胞计数。

(3)CFU-F法检测外周血与骨髓中MSCs的数量

将外周血中MNCs用3mL含有20%胎牛血清的LG-DMEM培养基重悬，以3× 10⁵/cm²的密度接种于6孔培养板中。骨髓细胞同样采用以上培养基重 悬，以密度为1×10⁶细胞每瓶的密度接种于底面积为12.5cm²的塑料培 养瓶中，置于 37℃含5% CO2孵箱培养。培养 7 天后换液，倒置 显微镜下观察，于第 14天时计数外周血CFU-Fs与骨髓 CFU-Fs。将 呈成纤维细胞样形态、生长密集、>50 个细胞的集落记为1个 CFU- F。外周血所得的CFU-F即外周血间充质干细胞，骨髓培养所得的CFU即 骨髓间充质干细胞。

一个MSCs贴壁即扩增形成一个CFU-F，基于此理论，CFU-F培养法已成 为检测外周血MSCs数量的经典方法。CFU-F法检测结果发现：给予DMO G 40mg/kg/d×7d，小鼠外周血CFU-Fs数量较生理盐水对照组（NS组 ）显著增加（3.2±0.71/3×106 MNCs VS.1.8±0.83/3×106 MNC s，P<0.05），同时骨髓 CFU-Fs数量显著增加（14.6±0.54/1×106 MNCs VS.10.4±0.51/1 ×106 MNCs，P<0.05）（表1，图1）。然而，各剂量组之间的外周血 CFU-Fs和骨髓CFU-Fs数量并无显著性差异（P﹥0.05）。以上结果表明 ：DMOG（20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg）促进小鼠骨髓MSCs数量增加， 同时诱导MSCs动员至外周血，从而使外周血MSCs数量增加。

有学者研究发现，可通过G-CSF联合AMD3100给予后在兔外周血中培养 得到了MSCs，但其动员效率低下。本研究结果显示，DMOG（20mg/kg、 40mg/kg、80mg/kg）可显著增加外周血MSCs数量，较G-CSF联合AMD31 00动员效率有所提高。

表1  DMOG对小鼠MSCs的动员作用（n=5）

(4)流式细胞术检测小鼠外周血及骨髓中CD45^-CD90⁺细胞群比例

将计数后小鼠外周血及骨髓单个核细胞用PBS调整细胞浓度至10⁶/mL。  加100μL调整后细胞至1.5mL EP管，同时设置单色及双色同型对照 组。流式抗体染色：CD90-PE 每管5μL，CD45-FITC每管2μL。避光 室温孵育30min后， PBS洗涤2次，用400μL PBS重悬后加入流式管 ，上机检测。

流式细胞术结果显示：外周血与骨髓中CD45^-CD90⁺细胞群比例与对照 组相比均升高（表2、图2C、2D）。该结果同样证实了DMOG可诱导具有 CD45^-CD90⁺免疫表型的MSCs动员至外周血。

表2  DMOG对小鼠外周血及骨髓中CD45^－CD90^＋细胞群变化

（5）成骨定向分化鉴定

外周血CFU-Fs扩增至P2代，0.25%胰酶-EDTA消化。将细胞以10,000个 /cm²接种于6孔板中，每组3孔。置于37℃含5%CO₂孵箱培养2天后，换 去培养液，加入成骨分化诱导液（10% FBS的LG-DMEM含0.1μM地塞米 松、10mM β-磷酸甘油、50μM维生素C），每3天换液，培养14天， 倒置显微镜下观察细胞形态。

Von Kossa染色鉴定成骨分化结果：吸干培养板内培养液，用4%多聚 甲醛固定15 min，双蒸水漂洗2次，自然晾干后，每孔加入2ml新配制 的2%硝酸银溶液染色5min，去离子水充分洗涤后，置于紫外线下15~3 0min，双蒸水漂洗2次，5%硫代硫酸钠处理2min，双蒸水冲洗2次，镜 下观察拍照。

动员外周血来源MSCs（PB-MSCs）在诱导分化第14天，细胞表面即出现 较多的钙盐分泌， Von Konssa染色均呈阳性，参见图3A。以上结果 说明PB-MSCs具有成骨分化能力。

(6). 成脂定向分化鉴定

外周血来源CFU-Fs扩增至P2代，0.25%胰酶-EDTA消化。将细胞以20,0 00个/cm²接种于6孔板中，每组3孔。置于37℃含5%CO₂孵箱培养，待细 胞近90%-100%融合时，加入成脂分化诱导液（含45ml LG-DMEM培养基 与5ml脂肪分化添加剂），每3天换液，培养21天，倒置显微镜下观察 细胞形态。

油红O染色鉴定成脂分化结果：吸干培养板内培养液，PBS轻轻洗涤1~ 2次，4%多聚甲醛固定15min。60%异丙醇漂洗后每孔加入新鲜配制的油 红O染液2ml，染色 10min，吸干染液后再用60%异丙醇漂洗2次，去离 子双蒸水冲洗2次，镜下观察拍照。

经诱导分化21天，可观察到动员外周血来源MSCs（PB-MSCs）胞浆中均 出现 成簇分布的高折光性脂滴，经油红O染色呈橘红色，参见图3B。

(7)Western blot 检测骨髓组织中HIF-1α、SDF-1α、及VEGF的表 达

用加有 10μM PMSF及蛋白酶抑制剂 cocktail的预冷PBS 1mL，冲 洗各组小鼠股骨单个核细胞，4℃ 1500rpm/min，6min 离心。按照 核蛋白提取试剂盒说明书提取细胞团块胞核蛋白与胞质蛋白，BCA试剂 盒测定蛋白浓度。蛋白质与上样缓冲液混合煮沸10分钟后进行SDS-PA GE电泳，再将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时，分别加兔 抗小鼠HIF-1α多克隆抗体（1:500稀释），兔抗小鼠SDF-1α多克隆抗 体（1:1000稀释），兔抗小鼠VEGF多克隆抗体（1:1000稀释）或兔抗 小鼠β-actin 多克隆抗体（1:2000稀释）4℃孵育过夜，1×TBST洗 膜液漂洗3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:2000稀释）室 温孵育1小时。1×TBST洗膜液漂洗3次，ECL显色系统显影，用凝胶图 像分析系统进行半定量分析。

Western-blot结果显示，不同剂量的DMOG给予7天处理后，小鼠骨髓细 胞HIF-1α蛋白表达水平均明显升高，且维持较稳定的水平。同时SDF -1α、VEGF表达在给予DMOG（40mg/kg）后显著上升，给予DMOG（80m g/kg）时保持较高水平。此结果提示DMOG通过上调HIF-1α信号通路从 而诱导MSCs动员。

本发明研究组成员曾报道Fe2+竞争剂CoCl2可通过上调HIF-1α信号通 路诱导MSCs动员，然而，由于铁螯合剂本身具有铁流失等副作用，不 能成为理想的MSCs动员剂。本发明的发明人研究发现，酮戊二酸类似 物——二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）可通过与内源性的2-酮戊二酸 ，从而稳定HIF-1的表达，更好地用于MSCs体内动员，由于二甲基乙二 酰基甘氨酸（DMOG）比G-CSF联合AMD3100具有更高的动员效率，且避 免了CoCl2的铁流失等副作用，更为安全有效，为组织工程与再生医学 等提供了一种有效的制剂。

众所周知，间充质干细胞是具有强大增殖能力和多向分化潜能的成体 干细胞，可用于治疗骨、关节、肌腱等多种组织损伤；促进神经细胞 、心肌细胞、肝细胞再生等。同时MSCs 可支持造血，调节免疫功能 ，防治造血干细胞移植后移植物抗宿主病（GVHD）等。本发明的实施 例证明二甲基乙二酰基甘氨酸动员产生的间充质干细胞高表达CD90， 不表达CD45, 具有体外成骨、成脂分化能力，所以二甲基乙二酰基甘 氨酸制备的药物可以用于可用于治疗骨、关节、肌腱等多种组织损伤 ；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生等，同时可支持造血，调节 免 疫功能，防治造血干细胞移植后移植物抗宿主病（GVHD）等。同理， 二甲基乙二酰基甘氨酸和通过二甲基乙二酰基甘氨酸动员产生的间充 质干细胞作为有效成分制备间充质干细胞药物也可用于治疗骨、关节 、肌腱等多种组织损伤；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生等， 同时可支持造血，调节免疫功能，防治造血干细胞移植后移植物抗宿 主病（GVHD）等。