聚胞嘧啶结合蛋白2抑制剂在制备治疗人神经胶质瘤的药物中的用途

摘要

本发明涉及聚胞嘧啶结合蛋白2抑制剂在制备治疗人神经胶质瘤的药物中的用途。具体而言，本发明首次发现聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）在人神经胶质瘤中高表达并发现抑制PCBP2的功能可以抑制神经胶质瘤细胞的生长并促进神经胶质瘤细胞的凋亡。本发明为人神经胶质瘤的治疗提供了新的治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）的抑制剂在制备治疗人 神经胶质瘤的药物中的用途。

背景技术

多聚胞嘧啶结合蛋白（Poly (C)结合蛋白，PCBP）通常被认为是核 糖核酸结合蛋白，结合单链多聚胞嘧啶特异序列上的靶位点。该家族 被分为两大类：即核不均一核糖核蛋白（hnRNP）K和多聚胞嘧啶结 合蛋白1-4。多聚胞嘧啶结合蛋白通过对多聚胞嘧啶的结合能力在各种 水平参与基因表达调节，包括转录、信使核糖核酸加工、信使核糖核 酸稳定性和翻译调节。多聚胞嘧啶结合蛋白包含三个核不均一核糖核 蛋白K同源（KH）结构域，其中两个连续的核不均一核糖核蛋白K 同源（KH）结构域在氨基端，第三个核不均一核糖核蛋白K同源（KH） 结构域在羧基端，被一个长度可变的中间序列分开。多聚胞嘧啶结合 蛋白通过它们的核不均一核糖核蛋白K同源（KH）结构域识别和结合 多聚胞嘧啶核糖核酸序列的能力对于它们在哺乳动物细胞中的功能是 非常重要的。已有研究报道了该家族成员核不均一核糖核蛋白 （hnRNP）K、多聚胞嘧啶结合蛋白1和多聚胞嘧啶结合蛋白2通过 结合靶信使核糖核酸在各种人类肿瘤细胞中发挥重要作用。然而，截 至目前，除了发现多聚胞嘧啶结合蛋白2在白血病细胞中高表达和在 口腔癌中低表达以外，还鲜有多聚胞嘧啶结合蛋白2在其它人类肿瘤 中的研究报道。绝大部分研究报道均集中在多聚胞嘧啶结合蛋白2对 核糖核酸病毒的转录后调控和翻译水平的调节。

最近，越来越多的研究结果显示多聚胞嘧啶结合蛋白2可能作为 调节因子参与人类肿瘤的发生发展。多聚胞嘧啶结合蛋白2核糖核酸 在转移性前列腺癌中持续升高；2’,5’-寡腺苷酸合成酶在前列腺癌细胞 中被大鼠肉瘤病毒相关因子（Raf）激酶抑制蛋白和多聚胞嘧啶结合蛋 白2激活。在慢性粒细胞白血病细胞中，多聚胞嘧啶结合蛋白2被断 点簇区基因/非受体酪氨酸激酶（BCR/ABL）融合蛋白通过组成性活化 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK^ERK1/2）诱导表达，它对CCAAT／增强子 结合蛋白α(CEBPA)信使核糖核酸的调节被微小核糖核酸-328 （miR-328）的诱骗活性影响。

胶质瘤一直是人类未能征服的肿瘤之一，虽然发病率低于肺癌等 其他恶性肿瘤，但其死亡率却名列前茅，给患者的家庭和社会带来了 极大危害。近年来，越来越多的人开始研究胶质瘤发生发展中的分子 生物学机制。虽然到目前已经鉴定一些与胶质瘤相关的蛋白分子和分 子标志物，可能作为新的药物筛选靶点。然而，人类真正了解胶质瘤 的发病机制并战胜胶质瘤还需要很长的一段路要走。

本发明以多聚胞嘧啶结合蛋白2在神经胶质瘤中的表达谱为线索， 研究了多聚胞嘧啶结合蛋白2在神经胶质瘤发生中的作用和可能的机 制。随着对聚胞嘧啶结合蛋白2表达的调控、作用机制及其靶向治疗 的深入研究，将为神经胶质瘤的诊治提供更充分的理论依据，以多聚 胞嘧啶结合蛋白2为靶点的抗癌治疗有可能成为肿瘤治疗的一个新的 突破。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于研究多聚胞嘧啶结合蛋白2及其抑 制剂在制备治疗神经胶质瘤的药物中的用途。

因此，本发明的第一方面涉及一种人聚胞嘧啶结合蛋白2的抑制 剂在制备治疗人神经胶质瘤的药物中的用途。

优选地，所述人聚胞嘧啶结合蛋白2的抑制剂是特异于人聚胞嘧 啶结合蛋白2的抗体。

优选地，所述人聚胞嘧啶结合蛋白2的抑制剂是特异于人聚胞嘧 啶结合蛋白2的编码基因的siRNA。

优选地，所述人聚胞嘧啶结合蛋白2的抑制剂是能降低人聚胞嘧 啶结合蛋白2表达的化学生物物质。

更优选地，所述的特异于人聚胞嘧啶结合蛋白2的抗体是多克隆 抗体或单克隆抗体。最优选地，所述的特异于人聚胞嘧啶结合蛋白2 的抗体是单克隆抗体。

优选地，所述特异于人聚胞嘧啶结合蛋白2的编码基因的siRNA 的序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，所述人神经胶质瘤处于II到IV级。

优选地，所述药物的剂型为注射剂、口服剂。最优选地，所述药 物的剂型为静脉注射剂。

换言之，本发明用抗多聚胞嘧啶结合蛋白2抗体检测多聚胞嘧啶 结合蛋白2在人神经胶质瘤组织和细胞系中的表达谱，首次发现多聚 胞嘧啶结合蛋白2在人神经胶质瘤（II到IV级）中高表达。本发明然 后通过RNAi技术发现敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2可以在体外和体内 抑制神经胶质瘤细胞的生长并促进肿瘤细胞凋亡，并利用重组干扰腺 病毒检测敲低聚胞嘧啶结合蛋白2对裸鼠成瘤的影响。

因此，本发明首次发现通过抑制PCBP2在人神经胶质瘤中的表达 可以抑制神经胶质瘤细胞的生长并促进神经胶质瘤细胞的凋亡。众所 周知，在核酸水平抑制靶基因的转录表达和在蛋白质水平中和靶蛋白 均可以实现抑制靶蛋白生理功能的目的。因此，任何能降低靶蛋白在 生物体内生理功能的化学生物物质均可以用于本发明。这样的化学生 物物质包括能敲除或敲降PCBP2表达的siRNA。本领域技术人员公知 靶基因siRNA的设计方法及制备方法，其中的一条siRNA的序列如 SEQ ID NO：5所示。特异于PCBP2蛋白的抗体可以特异性地中和掉 体内的PCBP2蛋白，从而实现降低PCBP2蛋白生理功能的目的。特 异性抗体的制备方法在本领域众所周知，包括天然形式的抗体如单克 隆抗体、多克隆抗体，以及改造形式的抗体，如人源化抗体、嵌合抗 体、单链抗体等。本领域技术人员公知如何利用siRNA或特异性抗体 进行药物制备的方法。此外，利用高通量筛选也可以从化合物库尤其 是小分子化合物库中筛选获得特异性抑制PCBP2活性或表达的化合 物。这样的化合物也落入本发明的范围。

综上，本发明发现PCBP2的抑制剂可以用于制备治疗人神经胶质 瘤的药物，从而为人神经胶质瘤的治疗开辟了一条新的治疗途径，具 有显著的社会效益和经济效益。

附图说明

图1：PCBP2信使核糖核酸（mRNA）在神经胶质瘤细胞中高表达。 实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测人神经胶质瘤组织样本 中聚胞嘧啶结合蛋白2 m核糖核酸水平，结果显示了多聚胞嘧啶结合 蛋白（PCBP）2在Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤组织和正常脑组织（N1，N2）中的 信使核糖核酸（mRNA）表达情况，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） 作为内参。

图2：PCBP2蛋白在神经胶质瘤细胞中高表达。Western Blotting 检测人神经胶质瘤组织样本中聚胞嘧啶结合蛋白2蛋白水平，结果显 示多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）在Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤组织和正常脑组 织（N1，N2）中的蛋白表达水平，β-肌动蛋白作为上样对照。

图3：PCBP2信使核糖核酸（mRNA）在神经胶质瘤组织中高表达。 实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测人神经胶质瘤细胞系中 聚胞嘧啶结合蛋白2 mRNA水平，结果显示了多聚胞嘧啶结合蛋白 （PCBP）2在5种胶质瘤细胞（T98G、U87MG、U251、A172、 CCF-STTG1）和正常脑组织（N1、N2）中的信使核糖核酸（mRNA） 表达，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

图4：PCBP2蛋白在神经胶质瘤组织中高表达。Western Blotting 检测人神经胶质瘤细胞系中聚胞嘧啶结合蛋白2蛋白水平上调， Western Blotting显示多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）在5种胶质瘤细 胞（T98G、U87MG、U251、A172、CCF-STTG1）和正常脑组织（N1、 N2）中蛋白表达水平，β-肌动蛋白作为上样对照。

图5：PCBP2在神经胶质瘤组织中高表达。免疫组化检测人神经 胶质瘤病理切片中聚胞嘧啶结合蛋白2水平上调，免疫组织化学检测 正常组织和各级胶质瘤组织中多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）的表达。 兔IgG作为背景阴性对照，图片放大倍数为400倍。

图6：Western Blotting检测在神经胶质瘤细胞系中瞬时转染聚胞嘧 啶结合蛋白2 siRNA敲低聚胞嘧啶结合蛋白2的效果，Western Blotting 检测多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）siRNA敲低效果。采用200纳 摩尔siRNA转染T98G、U87MG和U251胶质瘤细胞系，对照siRNA 为不干扰任何人类蛋白的阴性对照，多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2） siRNA为特异针对多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）靶点的siRNA，转 染48～72小时后，分别用抗多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）和β-肌 动蛋白抗体进行Western blotting检测。β-肌动蛋白作为上样对照。

图7A-C：敲低PCBP2表达抑制神经胶质瘤细胞增殖能力。MTT 实验检测在神经胶质瘤细胞系中敲低聚胞嘧啶结合蛋白2对细胞增殖 能力的抑制作用，*：P<0.05，MTT实验检测敲低多聚胞嘧啶结合蛋白 2（PCBP2）表达对神经胶质瘤细胞增殖能力的影响。MTT实验操作如 前述方法。siRNA转染T98G（A图）、U87MG（B图）和U251（C图） 胶质瘤细胞系后0小时开始测定，之后24小时、48小时和72小时各 测定一次。…代表阴性对照（对照siRNA），—代表敲低多聚胞嘧啶结 合蛋白2（PCBP2）（多聚胞嘧啶结合蛋白2 siRNA）。结果以平均值± 标准差（SD）表示。*：P<0.05。

图8A-I：敲低PCBP2表达抑制神经胶质瘤细胞进入S期，将细胞 阻滞在G1期。细胞流式检测在神经胶质瘤细胞系中敲低聚胞嘧啶结合 蛋白2对细胞周期的有丝分裂间期期阻滞，*：P<0.05，流式细胞术检 测敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）对神经胶质瘤细胞周期的改变。 左图为阴性对照（对照siRNA）和敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2） （多聚胞嘧啶结合蛋白2 siRNA）表达的胶质瘤细胞的周期情况，横坐 标为细胞DNA含量，纵坐标为细胞数量。右图为阴性对照（对照siRNA） 和敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）（多聚胞嘧啶结合蛋白2 siRNA）表达的胶质瘤细胞（T98G、U87MG和U251）各周期所占比 例。A-C图涉及T98G，D-F图涉及U87MG，G-I图涉及U251。实心 条带代表阴性对照（对照siRNA），空心条带代表敲低多聚胞嘧啶结合 蛋白2（PCBP2）（多聚胞嘧啶结合蛋白2 siRNA）表达。结果以平均 值±标准差（SD）表示。*：P<0.05。

图9A-G：敲低PCBP2表达诱导神经胶质瘤细胞发生凋亡。DNA 末端转移酶介导的缺口末端标记法检测在神经胶质瘤细胞系中敲低聚 胞嘧啶结合蛋白2表达对细胞凋亡的诱导，*：P<0.05，DNA末端转移 酶介导的缺口末端标记法实验检测敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2 （PCBP2）对胶质瘤细胞凋亡的影响。左图为阴性对照（对照siRNA） 和敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）（多聚胞嘧啶结合蛋白2 siRNA） 表达的胶质瘤细胞的DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法结果 （A-F图）。光镜下，DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法阳性的细 胞核被染成深棕色。标尺为50微米。右图为统计T98G、U87MG和 U251胶质瘤细胞阴性对照组和敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2） 表达组各个平行孔中DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法阳性细 胞占总细胞的比例（G图）。实心条带代表阴性对照（对照siRNA）， 空心条带代表敲低多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）（多聚胞嘧啶结合 蛋白2 siRNA）表达。结果以平均值±标准差（SD）表示。*：P<0.05。

图10：Western Blotting检测重组干扰腺病毒对聚胞嘧啶结合蛋白 2和阳性对照生存素蛋白的敲低效果，感染对照重组腺病毒和干扰多聚 胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）重组腺病毒，干扰生存素蛋白重组腺病毒 后的T98G细胞内多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）和生存素蛋白表达 量检测。分别用抗多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）、抗生存素蛋白和 抗β-肌动蛋白抗体进行Western blotting检测。β-肌动蛋白作为上样对 照。

图11：敲低PCBP2表达抑制胶质瘤细胞在裸鼠体内的增殖。裸鼠 成瘤实验皮下肿瘤生长曲线。以注射腺病毒日定为0，用游标卡尺测定 相应时间点皮下肿瘤长轴和短轴的长度，利用公式肿瘤体积=长轴×短 轴²×π/6计算肿瘤体积。横坐标是时间轴，箭头所指时间为腺病毒注射 的日期。…代表阴性对照（对照重组腺病毒），—代表干扰多聚胞嘧啶 结合蛋白2（PCBP2）重组腺病毒，—·—代表阳性对照（干扰生存素 蛋白重组腺病毒）。纵坐标是肿瘤体积，单位为立方毫米。结果以平均 值±标准差（SD）表示。*：P<0.05。

图12：敲低PCBP2表达抑制胶质瘤细胞在裸鼠体内的增殖。裸鼠 成瘤实验分析敲低聚胞嘧啶结合蛋白2对神经胶质瘤体内生长的抑制 作用，箭头所指为腺病毒瘤内注射时间点，*：P<0.05，裸鼠成瘤实验 研究肿瘤分离照片。在裸鼠皮下由T98G细胞形成的肿瘤中注射对照重 组腺病毒和多聚胞嘧啶结合蛋白2和生存素蛋白干扰重组腺病毒。每 组裸鼠各8只。在注射后15天后处死小鼠，取出肿瘤后拍摄照片。标 尺为1厘米。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术 人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修 改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料 如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1

1）细胞总核糖核酸提取：利用常规TRIZOL法获取人神经胶质瘤 细胞的总核糖核酸，其中所用的神经胶质瘤细胞细胞系为T98G、 U87MG、U251、A172、CCF-STTG1（5个细胞系都来源恶性胶质瘤（Ⅳ 级）患者），购自美国模式培养物集存库（ATCC），正常脑组织和胶质 瘤组织均由北京天坛医院神经外科提供，采集前均经北京天坛医院医 学伦理学委员会批准，所用TRIZOL试剂购自英骏公司，产品批号为 15596-026，其他试剂均为分析纯，可商购。

2）蛋白编码基因的逆转录：选用全式金公司的逆转录试剂盒（商 品名称TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，批号 F30809），按照产品说明书进行操作，将上述获取的总核糖核酸进行逆 转录获得cDNA文库。

3）Real-time PCR：按照常规Real-time PCR（实时PCR）操作方 法进行。

Real-time PCR体系配制(20微升)：

注意：应先根据需要检测的引物对配制不同模板的总管，混匀后 再将其平均分配到分管中，加入不同引物对。每对引物，各3个平行 管反应。引物序列如下：

PCBP2：上游5’-CAGTATCATCGGAAAGAAAGGAG-3’（SEQ ID  NO：1），

下游5’-TGAAGATGGCATTAGTGGGTC-3’  （SEQ ID  NO：2）；

GAPDH：上游5’-GGTCATCCATGACAACTTTGG-3’  （SEQ ID  NO：3），

下游5’-GGCCATCACGCCACAG-3’（SEQ ID NO：4）。

（提示：如果使用Bio-Rad公司IQ-5仪器时，则不需要加入ROX  DYE II。）

A）Real-time PCR反应程序：95℃10 s，95℃5 s，60℃34 s。

循环重复第2，3步35次。（仪器：ABI 7500型）

（提示：使用Bio-Rad公司IQ-5时，第3步的时间改为30 s） 磷酸盐缓冲液漂洗，3×5分钟。

B）引物第一次使用时，还需要进行熔解曲线，检测引物的特异性。

溶解熔解程序：1．95℃，60 S；  2．55℃，60 S；3．55℃， 10S；

循环重复第3步，每次循环时温度+0.5℃，共41次，第3步采集 信号。

结果见图1、3，PCBP2信使核糖核酸（mRNA）在神经胶质瘤组 织和细胞系中高表达。

4）总蛋白提取：用TNTE细胞蛋白裂解缓冲液（用前加入终浓度 为5 μg/毫升PMSF蛋白酶抑制剂、0.5μg/毫升亮抑酶肽（Leupeptin）、 0.7μg/毫升胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A)、0.5μg/毫升胰蛋白酶抑制剂 （Aprotinin）四种蛋白酶抑制剂）裂解人神经胶质瘤细胞，离心获取 总蛋白裂解液。

5）Western Blotting：以10%分离胶进行SDS-PAGE电泳，然后凝 胶小心转移至电转缓冲液中转硝酸纤维素膜，封闭非特异性结合位点 后加入一抗PCBP2抗体（PCBP2抗体购自奥维亚公司，货号 ARP40568），4℃孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗：山羊 抗兔抗体（购自中山金桥）室温结合1-2h。然后用ECL法进行显色。

结果见图2、4、6和10，PCBP2蛋白在神经胶质瘤组织和细胞系 中高表达（图2、4），PCBP2 siRNA可以有效敲低靶蛋白表达（图6）， 干扰重组腺病毒感染神经胶质瘤细胞可以有效抑制靶蛋白表达（图 10）。

6）免疫组织化学：将人神经胶质瘤切片（来自北京协和医院，经 患者知情同意）按常规操作进行免疫组织化学实验，所用一抗为PCBP2 抗体，购自奥维亚公司，针对聚胞嘧啶结合蛋白2，DAB显色（中杉 金桥DAB试剂盒），封片后镜下观察结果并拍照或放于4℃暂时保存。

结果见图5，PCBP2蛋白在神经胶质瘤组织中高表达。

实施例2真核细胞转染siRNA

使用阳离子脂质体作为载体转染细胞，具体步骤如下：

1)转染前一天，用胰蛋白酶进行消化以收获对数期生长的细胞，计 数后以相应密度（1-3×10⁵个/毫升）接种到相应的孔板中，培养过夜 至细胞达到50-90%融合时进行转染（转染siRNA按50-70%融合铺板， 转染质粒DNA按80-90%融合铺板）；

2)转染前1-2h更换新的培养基，使用Lipofectamine 2000转染时更 换无双抗的新鲜培养基；

3)配制转染体系（以12孔板为例）：在两个无菌的1.5毫升离心管 中各加入100微升opti-MEM培养液。在其中一个加入siRNA（其序 列是5’-GGCCUAUACCAUUCAAGGA-3’（SEQ ID NO：5）），另一个 加入阳离子脂质体转染试剂，单独混匀后室温放置5分钟，然后将两 管溶液轻轻混合均匀，室温放置20分钟，不要超过30分钟。

使用lipo2000转染体系具体比例见下表：

4)将混合液逐滴加入培养板中，轻轻混匀。37℃5%CO₂孵箱中培 养4-6h后更换含100单位/毫升的青霉素和100毫克/毫升的链霉素的 新鲜培养基。48 h后根据实验需要观察或收集细胞。

MTT：

1)常规消化人神经胶质瘤细胞，分组制备单细胞悬液，平行接种于 96孔培养板，以2个梯度(2×10³和4×10³细胞/孔)接种；每孔培养基 总量100微升(96孔培养板每孔容积370微升)，设4个平行孔。37℃、 5%CO2培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)，第二天 进行转染，将转染时的时间定为0，分别在转染后第24h、48h、72h 和96h取一组细胞进行以下操作。

2)在相应的时间点，每孔中加入2毫克/毫升的MTT液(10微升/ 孔)，继续培养4h。

3)小心吸出孔内培养液，加入DMSO(100微升/孔)，将培养板置于 微孔板振荡器上振荡10分钟或手动摇晃，使结晶物溶解。

4)酶标仪检测各孔OD值(实验波长为570 nm，参考波长为630 nm)。记录结果，绘制细胞生长曲线。

结果见图7A-C，敲低PCBP2可以抑制神经胶质瘤细胞的增殖能 力。

细胞流式细胞术：

1)收集人神经胶质瘤细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接 吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化， 且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的 染色及分析），离心，1000rpm，5min。

2)用1ml冰冷的PBS重悬后，离心，1000rpm，5min。

3)用200μl冰冷的PBS重悬后，小心吹打，不要产生气泡，充分 重悬细胞，迅速加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加 边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步）。

4)1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬， 1,500rpm，5min。小心弃上清。

5)加入0.5毫升DNA抽提缓冲液混匀，37℃作用5分钟，磷酸盐 缓冲液清洗。

6)加入含有50μg/毫升的碘化丙啶（购自西格玛（Sigma）公司）， 100μg/毫升的RNase的磷酸盐缓冲液溶液500微升，37℃，避光培养 30分钟－1h。

结果见图8A-I，敲低PCBP2可以抑制神经胶质瘤细胞进入S期， 阻滞细胞周期在G1期，从而抑制细胞增殖。

TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）：

A.固定

1)24孔板细胞长满后，吸弃旧培养基。

2)磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

3)小心吸净磷酸盐缓冲液，每孔500微升4%多聚甲醛室温固定 20～30分钟。

B.增加细胞通透性

1)按1：200的比例，用10毫米Tris溶液（pH8.0)作为稀释液来 稀释2毫克/毫升的蛋白酶K溶液，使其终浓度为10μg/毫升，冰上放 置。每孔需要100微升蛋白酶K溶液。

2)吸净多聚甲醛，磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

3)每孔滴加50-100微升浓度为10 μg/毫升的蛋白酶K溶液，使 其被全部覆盖，冰上孵育5分钟。注意严格控制孵育时间，孵育时间 过长可对细胞造成一定的伤害，过短则可能造成透性处理不充分，影 响标记效率。蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或 细胞的类型或固定方法的不同而有所不同。

C.灭活内源过氧化物酶活性

1)1：10稀释30%H₂O₂溶液：将10微升30%H₂O₂（300微升 H₂O₂+700微升ddH₂O)与90微升甲醇混合，每孔需100微升这样的混 合物。

2)吸净蛋白酶K溶液，磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

3)以上述制备的100微升3%H₂O₂溶液完全覆盖每孔细胞，室温 避光孵育5分钟。

4)磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

D.平衡和标记反应

1)按1：5的比例用ddH₂O稀释5×TdT平衡缓冲液（每孔需用 20微升5×缓冲液和80微升ddH₂O混合稀释成100微升缓冲液)。

2)滴加100微升1×TdT平衡缓冲液使其全部覆盖待检细胞区 域，室温孵育30分钟。

3)把TdT酶（购自默克公司）从冰箱中取出，为了减少试剂损耗， 在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标 记，用移液器准确加入57微升生物素片段末端标记反应混合物 （Biotin-FragELT毫升ABELING REACTION MIX)和3微升TdT酶， 轻轻吹打混匀备用。

4)轻轻吸干1×TdT平衡缓冲液，注意不要触碰到细胞。

5)每孔立即滴加60微升上述准备的TdT标记反应混合物。

6)置于湿盒中37℃孵育90～120分钟。

E.终止标记反应

1)提前10分钟37℃预热终止缓冲液，混匀。

2)吸净TdT标记反应混合物，磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

3)每孔滴加100微升终止缓冲液，室温孵育5分钟。

4)磷酸盐缓冲液溶液洗2遍。

F．显色与检测

1)提前10分钟37℃预热封闭缓冲液，每孔滴加100微升封闭缓 冲液，室温孵育10分钟。

2)用封闭缓冲液1：50稀释50×偶联物（每孔需用2微升50×链 霉亲和素标记过氧化物酶偶联物和98微升封闭缓冲液混合稀释成 100微升缓冲液)。

3)小心吸去封闭缓冲液，注意不要接触到细胞。并立即加入100 微升稀释过的1×链霉亲和素标记过氧化物酶偶联物。

4)置于湿盒中室温孵育30min。

5)孵育结束前5min，制备DAB显色物溶液：戴手套和口罩，将 一片DAB片和一片双氧水/尿素片溶于1ml ddH2O（足够处理10个 样品)。

6)PBS溶液洗2遍。

7)每孔滴加100μl DAB显色物溶液，室温避光孵育10-15min。光 学显微镜下观察染色情况。

8)用ddH2O漂洗细胞2遍。

结果见图9A-G，敲低PCBP2可以诱导神经胶质瘤细胞发生凋亡。

裸鼠成瘤：

1)当鼠右前肢腋下长出肉眼可见的肿瘤团块时，测量肿瘤的长径和 短径后，开始向肿瘤内注射腺病毒，不同腺病毒用Enhanced Infection  Solution（购自上海吉凯公司，重组腺病毒购自上海吉凯基因化学技术 有限公司）稀释至滴度相同。

2)第一次（即注射病毒的D1天）注射腺病毒的量为10微升，第 二天（即注射病毒的D2天）进行第二次注射，注射量为10微升，隔 两天（即注射病毒的D5天）进行第三次注射，注射量为10微升，隔 一天（即注射病毒的D6天）进行最后一次注射，注射量也为10微升。 也就是说，每只裸鼠共注射四次腺病毒，注射病毒的总量为40微升。

3)从注射病毒开始测量肿瘤的长径和短径，每次注射病毒前先测 量，停止注射病毒后，每隔两天测量一次。按照V（体积）＝L（长径） ×W2（短径的平方）×π/6计算出肿瘤的体积，绘制肿瘤生长曲线图。

4)处死裸鼠，分离肿瘤，拍照。

结果见图11、12，敲低PCBP2可以抑制神经胶质瘤细胞在裸鼠体 内增殖。