突触核蛋白内含子1甲基化水平检测方法

摘要

一种突触核蛋白内含子1甲基化水平检测方法，属于生物工程领域。本发明的检测步骤如下：亚硫酸氢钠处理、PCR扩增、单链制备、焦磷酸测序样本制备、焦磷酸测序分析前准备，用计算机软件分析计算出相应位点的甲基化状态。本发明提供的DNA甲基化的检测方法克服了现有DNA甲基化检测技术的不足，具有快速、准确、高通量、兼具备定量的优点。建立了基于焦磷酸测序平台的α-Syn内含子1CpG岛甲基化水平检测方法。电泳、桑格尔测序、焦磷酸测序均证明本方法检测的特异性。通过与亚硫酸盐克隆测序法的比对，证明本发明建立的焦磷酸测序法具有很好的定量特性。此外，该方法操作便捷，通量较高。96个样本可以同时测序，耗时不足2小时，极为适合临床检验工作的需要。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。

背景技术

目前，针对α-Syn内含子1甲基化水平的检测主要使用亚硫酸盐测序法、甲基化特异PCR以及二代测序法。其中亚硫酸盐测序法涉及大量的扩增片段克隆工作，费时费力。而且，在克隆的过程中甲基化/非甲基化产物的比例可能会发生偏移，从而导致定量准确度下降。甲基化特异PCR法较为简单，但这种方法仅能定性，不能定量分析。二代测序法成本较高，不适合大规模应用。

发明内容

本发明的目的提供一种能够定量分析α-Syn内含子1中CpG岛的甲基化水平的检测方法。

本发明的检测步骤如下：

a、亚硫酸氢钠处理：用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行处理修饰，将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；基因组DNA使用0.3mol/L NaOH变性；而后使用偏重亚硫酸氢钠与对苯二酚混合溶液(pH 5.0)于50℃处理基因组DNA 16h； 用试剂盒纯化DNA，并加入0.3 mol/L NaOH于37℃孵育15min终止反应，最后乙醇沉淀DNA；

b、PCR扩增：按常规方法进行PCR扩增，引物及反应条件如下：

正向扩增引物：GAA,ATG,GAA,GTG,TAA,GGA,GGT,T ；

反向扩增引物：Biotin-TTC,TAA, TCC,ATC,CAA,CAT,CCA,C ；

扩增条件：94°C预变性2min； 94°C变性20s，58°C退火20s， 72°C延伸20s，共50循环；最后72°C延伸5min；

c、单链制备：用链霉亲和素偶连的琼脂糖珠吸附生物素标记的PCR产物，通过NaOH变性来制备单链DNA ；

d、焦磷酸测序样本制备：经变性的单链DNA和测序引物在80℃加热结合成杂交体，冷却成为焦磷酸测序样本，

测序引物S1为：AGG,AGG,TTA,AGT,TAA,TAG,GT；  

测序引物S2为：GTT,AGG,GTG,GAG,GTT,GAG,AA；

e、焦磷酸测序分析前准备：测序样本加入酶的混合物和底物混合物进行反应；每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团---PPi；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由软件转化为一个峰值，峰值高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；根据加入dNTP类型和荧光信号强度可实时记录模板DNA的核苷酸序列；其中酶的混合物是DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶混合，底物混合物是受质APS和荧光素混合；

f、用计算机软件分析计算出相应位点的甲基化状态。

本发明提供的DNA甲基化的检测方法克服了现有DNA甲基化检测技术的不足，具有快速、准确、高通量、兼具备定量的优点。建立了基于焦磷酸测序平台的α-Syn内含子1 CpG岛甲基化水平检测方法。电泳、桑格尔测序、焦磷酸测序均证明本方法检测的特异性。通过与亚硫酸盐克隆测序法的比对，证明本发明建立的焦磷酸测序法具有很好的定量特性。此外，该方法操作便捷，通量较高。96个样本可以同时测序，耗时不足2小时，极为适合临床检验工作的需要。

附图说明

图1是本发明基因子DNA甲基化流程图；

图2是焦磷酸测序原理图；

图3是α-Syn内含子1的CpG岛序列的扩增产物；

图4是焦磷酸测序和亚硫酸盐测序结果比较。

具体实施方式

本发明的检测步骤如下：

a、亚硫酸氢钠处理：用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行处理修饰，将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；基因组DNA使用0.3mol/L NaOH变性；而后使用偏重亚硫酸氢钠与对苯二酚混合溶液(pH 5.0)于50℃处理基因组DNA 16h； 用试剂盒纯化DNA，并加入0.3 mol/L NaOH于37℃孵育15min终止反应，最后乙醇沉淀DNA；

b、PCR扩增：按常规方法进行PCR扩增，引物及反应条件如下：

正向扩增引物：GAA,ATG,GAA,GTG,TAA,GGA,GGT,T ；

反向扩增引物：Biotin-TTC,TAA, TCC,ATC,CAA,CAT,CCA,C ；

扩增条件：94°C预变性2min； 94°C变性20s，58°C退火20s， 72°C延伸20s，共50循环；最后72°C延伸5min；

c、单链制备：用链霉亲和素偶连的琼脂糖珠吸附生物素标记的PCR产物，通过NaOH变性来制备单链DNA ；

d、焦磷酸测序样本制备：经变性的单链DNA和测序引物在80℃加热结合成杂交体，冷却成为焦磷酸测序样本，

测序引物S1为：AGG,AGG,TTA,AGT,TAA,TAG,GT；  

测序引物S2为：GTT,AGG,GTG,GAG,GTT,GAG,AA；

e、焦磷酸测序分析前准备：测序样本加入酶的混合物和底物混合物进行反应；每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团---PPi；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由软件转化为一个峰值，峰值高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；根据加入dNTP类型和荧光信号强度可实时记录模板DNA的核苷酸序列；其中酶的混合物是DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶混合，底物混合物是受质APS和荧光素混合；

f、用计算机软件分析计算出相应位点的甲基化状态。

本发明提供α-Syn内含子1甲基化水平检测方法，依次包括以下步骤：

1、用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行处理修饰。将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；

2、将步骤1处理的基因组DNA作为模板，用HS Taq 酶进行PCR扩增；反应中PCR 引物为生物素标记；

3、用链霉亲和素偶连的琼脂糖珠吸附步骤2的PCR产物，通过NaOH变性来制备单链DNA；

4、取步骤3的单链DNA和测序引物在80℃加热结合成杂交体，冷却成为焦磷酸测序样本；

5、焦磷酸测序分析前准备：取步骤4所生成的测序样本加入酶的混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶）和底物混合物（受质APS和荧光素）进行反应，参照按照PyroMarkQ96使用说明书进行测序操作；

6、在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由软件转化为一个峰值，峰值高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度可实时记录模板DNA的核苷酸序列；

7、经软件分析计算出相应位点的甲基化状态。

实施例：焦磷酸测序在α-Syn内含子1甲基化检测中的应用

一、亚硫酸氢钠处理

使用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行修饰，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的尿嘧啶保持不变。其过程简述如下：首先，基因组DNA使用0.3mol/L NaOH变性；而后使用偏重亚硫酸氢钠与对苯二酚混合溶液(pH 5.0)于50℃处理基因组DNA 16h。 用试剂盒纯化DNA，并加入0.3 mol/L NaOH于37℃孵育15min终止反应，最后乙醇沉淀DNA。

二、PCR扩增

按常规方法进行PCR扩增，引物及反应条件如下：

正向扩增引物：GAA,ATG,GAA,GTG,TAA,GGA,GGT,T ；

反向扩增引物：Biotin-TTC,TAA, TCC,ATC,CAA,CAT,CCA,C ；

扩增条件：94°C预变性2min； 94°C变性20s，58°C退火20s， 72°C延伸20s，共50循环；最后72°C延伸5min。

三、单链制备

用链霉亲和素偶连的琼脂糖珠吸附生物素标记的PCR产物，通过NaOH变性来制备单链DNA。

四、焦磷酸测序样本制备

经变性的单链DNA和测序引物在80℃加热结合成杂交体，冷却成为焦磷酸测序样本。

测序引物S1为：AGG,AGG,TTA,AGT,TAA,TAG,GT；  

测序引物S2为：GTT,AGG,GTG,GAG,GTT,GAG,AA 。

五、焦磷酸测序分析前准备

测序样本加入酶的混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶）和底物混合物（受质APS和荧光素）进行反应；每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由软件转化为一个峰值，峰值高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度可实时记录模板DNA的核苷酸序列。

六、甲基化位点分析

用计算机软件分析计算出相应位点的甲基化状态。

本发明所检测的位于α-Syn内含子1的CpG岛序列：

第1位至第22位碱基和第173位至第194位碱基显示PCR扩增引物。第15位至第34位碱基和第68位至第87位碱基显示测序引物。第40、41位碱基，第58、59位碱基，第60、61位碱基，第67、68位碱基、第88、89位碱基，第96、97位碱基，第107、108位碱基，109、110位碱基，第121、122位碱基，第126、127位碱基，第128、129位碱基第138、139位碱基，第141、142位碱基，均为进行分析的CpG位点。

该片段长194bp，包含13个CpG位点。使用基因特异扩增引物，获得大小正确的扩增产物，其中1-5泳道均为194bp,第6泳道为对照。通过桑格尔测序，证实为目的片段。通过焦磷酸测序引物S1可以检测上游4个CpG位点；通过焦磷酸测序引物S2可以检测下游9个CpG位点。各CpG位点甲基化均得到定量检测，并且与亚硫酸盐测序法结果相一致(图4)。

图4中A，焦磷酸测序引物S1测序结果，图中各个百分比指甲基化碱基所占总碱基的比例；B，焦磷酸测序引物S2测序结果图中各个百分比指甲基化碱基所占总碱基的比例；C，同一样本亚硫酸氢盐克隆测序结果。每一空心圆代表一个未甲基化的CpG位点，每一实心圆代表一个甲基化CpG位点。每个克隆包含13个CpG位点信息，共检测10个克隆。

为了应用焦磷酸测序法分析α-Syn内含子1甲基化水平的增龄变化，共进行147次测试。

与第一组和第二组相比，第三组中，每个CpG位点甲基化水平和总体平均甲基化水平均显著上升。第二组和第一组相比，CpG位点1，2，4甲基化水平显著上升。通过下表可知甲基化水平无显著差异。

<110>  长春恒晨生物科技有限责任公司

 

<120>  突触核蛋白内含子1甲基化水平检测方法

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  194

<212>  DNA

 

<400>  1

GAAATGGAAGTGCAAGGAGGCCAAGTCAACAGGTGGTAACGGGTTAACAAGTGCTGGCGCGGGGTCCGCTAGGGTGGAGGCTGAGAACGCCCCCTCGGGTGGCTGGCGCGGGGTTGGAGACGGCCCGCGAGTGTGAGCGGCGCCTGCTCAGGGTAGATAGCTGAGGGCGGGGGTGGATGTTGGATGGATTAGAA