一种鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料的制备方法

摘要

本发明公开了一种鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料的制备方法。包括：将去除表面杂质的干净鱼体废弃物剪切成50～200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入蒸馏水、反应酶搅拌制成浆液，浆液在高压、超声处理下反应；反应后浆液经纯化处理，加入壳聚糖，加热至80～90℃，搅拌20～30min；经透析、浓缩、干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，快速提取的鱼胶原蛋白分子量分布均匀，杂质少，制备的生物敷料力学强度好，且具有止血、促进伤口愈合、抗菌的功效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物材料制备技术领域，特别涉及一种鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料的制备方法。

背景技术

生物敷料与传统敷料相比具有相容性好，毒副作用小、抗原性低、有一定的透水性、可减少创面的换药次数、降低创面菌落密度、提高创面愈合质量、减轻病人痛苦等优点。生物敷料作为一种新型的医用创伤敷料目前已经应用于各类皮肤创伤的治疗。

胶原蛋白是结缔组织中一种具有丰富生理功能的重要结构蛋白，具有低抗原性、可被人体吸收、降解产物无毒副作用等优点。胶原蛋白能够诱导血小板附着，产生释放反应，激活血液凝固因子，对损伤的血管壁起到堵塞作用从而达到止血目的，同时它具有生物相容性好、促进伤口愈合的特点。壳聚糖是一种天然的聚阳离子多糖，它具有抗菌、吸湿、促凝血、镇痛等功效，同时壳聚糖能够促进透明质酸等糖胺多糖的分泌，使伤口愈合加快，并能抑制成纤维细胞的生长，减轻疤痕的形成。因此，胶原蛋白与壳聚糖复合的生物敷料可具有止血、促进伤口愈合、抗菌的功效。同时，壳聚糖与胶原蛋白分子之间的氢键作用以及静电作用能够进一步提高敷料的力学性能。

传统的胶原蛋白提取方法是从猪、牛的皮和骨，以及禽类组织中提取。但近年来因疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，尤其是H5N1，H7N9等新亚型流感病毒的出现，使人们对牲畜与禽类胶原制品安全性产生严重疑虑。另外，由于宗教和习俗等原因，从猪皮牛皮中提取胶原蛋白受到很大限制，因此，寻找胶原蛋白的新来源显得愈来愈迫切。从海水或淡水鱼体废弃物提取安全性高、吸收率高、生物活性更强的胶原蛋白将成为胶原蛋白产品提取的主要来源。

传统的胶原蛋白提取方法采用酸或碱降解胶原蛋白提取，这些方法会在降解过程中导致部分氨基酸破坏，产品安全性差，生物活性损失，生产中的废液对环境造成污染；采用低温生物酶解技术，不添加其他物质，可以提高产品品质（如CN102533914 A），避免环境污染，但所需时间较长，产品分子量较低，且得到的胶原蛋白分子量分布不均。同时，目前尚没有在鱼胶原蛋白提取过程中直接复合壳聚糖制备生物敷料的报道。

本专利采用高压超声酶解技术，一步完成鱼体废弃物脱脂处理和蛋白提取，并在鱼胶原蛋白提取过程中直接加入壳聚糖制备鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。大大提高了提取效率，缩短了生产时间。提取过程绿色环保，快速方便，鱼胶原蛋白分子量分布均匀，杂质少，制备的生物敷料力学强度好，且具有止血、促进伤口愈合、抗菌的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料的制备方法。涉及一种生物材料制备技术领域。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，提取的鱼胶原蛋白分子量分布均匀，杂质少，制备的生物敷料力学强度好，且具有止血、促进伤口愈合、抗菌的功效。

本发明的公开了一种鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料的制备方法，包括：将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成50～200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入蒸馏水、反应酶搅拌制成浆液，浆液在高压、超声处理下反应；反应后浆液经纯化处理，加入壳聚糖，加热至80～90℃，搅拌20～30min；经透析、浓缩、干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

所述的鱼体废弃物是指鱼皮、鱼鳞鱼鳔中的一种或几种。在本专利中，将鱼体废弃物加工成50～200目的细小颗粒，这样可以大幅提高酶解的效率，提高最终鱼胶原蛋白的得率。

所述的蒸馏水质量为鱼粉质量的3～10倍。

所述的反应酶是指脂肪酶与蛋白酶的混合物；其中脂肪酶是指中性脂肪酶或碱性脂肪酶，蛋白酶是指菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或胰蛋白酶。本专利中酶解脱脂和酶解提取是同步进行的：酶解脱脂是利用脂肪酶的酶解作用，在适宜的温度和搅拌速率下，脂肪酶可以迅速将甘油三酯的酯键水解成为甘油和脂肪酸；酶解提取是利用蛋白酶的酶解作用，催化蛋白质中的肽键水解，从而得到鱼胶原蛋白溶液。

所述的反应酶加入质量占鱼粉质量的0.1～1%，其中脂肪酶与蛋白酶的质量比为1:2～4。由于本专利中酶解脱脂和酶解提取是同步进行的，为了使酶解脱脂与酶解提取的速率相配合且互不干扰，必须严格控制脂肪酶与蛋白酶的使用量和使用比例。

所述的高压是指控制密闭容器中的压力在1.5～3个标准大气压；所述的超声处理是指采用超声波发生器使密闭容器中的物质处于15～25kHz的超声处理。所述的高压、超声处理下反应是指反应温度为50～70℃，pH为7～9，搅拌0.5～2h。加热、高压以及超声处理可以有效提高蛋白酶的催化速率，但在处理过程中，加热温度、压力、超声频率和反应时间需要控制，以避免处理过度使蛋白质变性。

所述的纯化处理是指在反应后浆液中加入少量氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为5～6；所述的氢氧化钠加入量占反应后浆液质量的0.1～0.5%。氢氧化钠加入的目的是调节酶解反应后浆液体系为弱碱性，以使脂肪酶解生成的脂肪酸反应生成皂盐；过滤去除杂质后调解pH值使系统为弱酸性，这样有利于壳聚糖粉体的溶解。

所述的壳聚糖是指分子量为5～30万的壳聚糖粉体，所述的壳聚糖加入量为溶液总质量的1～5%。

所述的透析是指将滤液置于透析袋中经蒸馏水透析4～7天，其中所述的透析袋为截留分子量为10～100KD。采用透析处理可以除去滤液中原有的可溶性小分子杂物，并控制得到的鱼胶原蛋白和壳聚糖溶液均在所需的分子量范围内。

所述的浓缩是指透析后的溶液经蒸发浓缩至固体含量为5～10wt%的溶液，所述的干燥是指自然干燥、加热烘干或冷冻干燥。

 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本专利采用高压超声酶解技术，一步完成鱼体废弃物脱脂处理和蛋白提取，并在鱼胶原蛋白提取过程中直接加入壳聚糖制备鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。制备过程中加热使壳聚糖粉体的溶解与灭酶过程同步进行，大大提高了提取效率，缩短了生产时间。提取过程绿色环保，快速方便，鱼胶原蛋白分子量分布均匀，杂质少，制备的生物敷料力学强度好，且具有止血、促进伤口愈合、抗菌的功效。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

将去除表面杂质干净的鱼皮剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为3倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.1%，且中性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1: 4。

配制好的浆液在1.5个标准大气压、15kHz的超声处理下控制反应温度为50℃，pH为7，搅拌2h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为5，在滤液中加入占溶液总质量为1%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为30万。混合液加热至90℃，搅拌20min；将滤液置于截留分子量为100KD的透析袋中经蒸馏水透析7天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为5wt%的溶液，然后经自然干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

实施例2：

将去除表面杂质干净的鱼鳞剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为5倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.3%，且中性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1: 4。

配制好的浆液在2个标准大气压、20kHz的超声处理下控制反应温度为55℃，pH为7.5，搅拌1.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.2%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为6，在滤液中加入占溶液总质量为5%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为5万。混合液加热至80℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为10KD的透析袋中经蒸馏水透析4天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为10wt%的溶液，然后经冷冻干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

实施例3：

将去除表面杂质干净的鱼鳔剪切成小块，并用破碎机切成150目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.5%，且中性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:3。

配制好的浆液在2.5个标准大气压、25kHz的超声处理下控制反应温度为70℃，pH为7.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.3%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为5，在滤液中加入占溶液总质量为2%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为10万。混合液加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为50KD的透析袋中经蒸馏水透析5天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为9wt%的溶液，然后经加热烘干得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

实施例4：

将去除表面杂质干净的鱼皮、鱼鳞剪切成小块，并用破碎机切成200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为9倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.7%，且碱性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1:3。

配制好的浆液在3个标准大气压、15kHz的超声处理下控制反应温度为65℃，pH为8，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.4%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为6，在滤液中加入占溶液总质量为3%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为15万。混合液加热至80℃，搅拌20min；将滤液置于截留分子量为70KD的透析袋中经蒸馏水透析6天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为8wt%的溶液，然后经冷冻干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

实施例5：

将去除表面杂质干净的鱼鳞、鱼鳔剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为10倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.9%，且碱性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1:2。

配制好的浆液在2个标准大气压、20kHz的超声处理下控制反应温度为60℃，pH为8.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.5%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为5.5，在滤液中加入占溶液总质量为4%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为20万。混合液加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为100KD的透析袋中经蒸馏水透析7天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为7wt%的溶液，然后经加热烘干得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

实施例6：

将去除表面杂质干净的鱼皮、鱼鳞、鱼鳔剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的1%，且碱性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:2。

配制好的浆液在1.5个标准大气压、15kHz的超声处理下控制反应温度为55℃，pH为7，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，过滤浆液并调节滤液pH值为6，在滤液中加入占溶液总质量为5%的壳聚糖粉体，其中壳聚糖分子量为25万。混合液加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为30KD的透析袋中经蒸馏水透析7天，透析后的溶液经蒸发浓缩得到固体含量为6wt%的溶液，然后经自然干燥得到鱼胶原蛋白复合壳聚糖生物敷料。

具体试验效果如下：

1.机械性能测试

实施例1、2、3、4、5、6所得敷料的物理-机械性能如表1所示。参照《GB/T 14335-2008化学纤维短纤维线密度试验方法》测试纤维的线密度，参照《GB/T14337-2008化学纤维短纤维拉伸性能试验方法》测试纤维的断裂强度和断裂延伸率。 

表1细菌纤维素与天然多糖共混纤维的物理-机械性能

2.透湿率和吸湿性测试

  表2

3. 潮湿条件下的阻菌性

按照YY/T 0471.5接触性创面敷料试验方法第5部分阻菌性潮湿条件下的阻菌性步骤测定。半固体敷料：样品处理方法取医用湿性烧伤伤口敷料若干，厚度3mm为阻菌样品备用。片状敷料：样品制备方法取医用水凝胶敷料剪切为5cm×5cm阻菌样品备用。试验中的肉汤瓶中应无粘质沙雷菌生长。

表3