极地Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖及在水产养殖中的应用

摘要

本发明公开了一种极地细菌Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖及其在水产养殖中的应用。本发明的胞外多糖，可以在不同程度上提高大菱鲆血清和海参体腔液中的非特异性免疫指标AKP、ACP、T-SOD、CAT、LSZ等酶活力；可以显著提高大菱鲆抗鳗弧菌的能力，降低大菱鲆的感染率和死亡率；可显著降低海参的自然感染率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能提高水产动物非特异性免疫能力的胞外多糖、其制备方 法及其应用。

背景技术

海洋水产养殖是发展最为迅速的行业之一，但疾病的频发严重制约了水产 养殖产量的快速增长和水产贸易的健康发展，而且传统的病害防治措施，即滥 用和过量使用抗生素和其他化学药物已经引发了一系列的环境和社会问题。随 着病原微生物抗药性的增加，迫使人们不断加大抗生素等的使用频率和使用 量。如何保持水产养殖的健康发展和减少化学药物的投放量，减少对环境的污 染和生产鱼药低残留的绿色水产品是水产养殖的瓶颈问题和国民经济发展的 迫切要求。

极地微生物可产生大量的胞外多糖，在其生境适应性中发挥着重要的作 用。研究发现，由极地海冰中分离得到的极地微生物产生的EPS其分子量比 一般海洋微生物高5～50倍。研究者认为，高浓度的胞外多糖可以降低细胞周 围环境的水的冰点，且目前已发现多种具有避免反复冻融功效的极地微生物胞 外多糖。除此之外，还发现众多具有特殊生物活性的极地微生物胞外多糖，这 说明极地微生物EPS可能具有潜在的可供开发利用的生物活性。然而，如何 从极地微生物中提取胞外多糖以及其应用技术研究是本领域的技术人员亟待 解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种极地细菌Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖 及在水产养殖中的应用，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种极地细菌Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖， 其特征在于所述的极地Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖通过如下制备方 法获得：以极地菌株Pseudoalteromonaselyakovii在10℃、150r/min条件下 振荡培养5-6d后，经醇沉、除蛋白、冷冻干燥后获得。

在本发明的一个优选实施方式中，在发酵培养基(g/L)蔗糖30-40g，酵母 浸膏10-20g，K₂HPO₄0.2-0.3g，陈海水，按5～7％的比例接入南极菌株Pseudoalteromonas  elyakovii种子液，于10±1℃培养120小时，胞外多糖产量可达4.8g/L。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的菌株为Pseudoalteromonas  elyakovii3-3-1-2，保藏编号为：CGMCC No.7629。

本发明另一方面涉及上述多糖在水产养殖中的应用，优选的，所述的应用 包括提高水产动物的非特异性免疫指标和/或降低水产动物的感染率。

在本发明的另一方面，还涉及上述多糖在提高大菱鲆抗鳗弧菌的能力，降 低大菱鲆的感染率和死亡率中的应用。

在本发明的另一方面，还涉及上述多糖在提高高海参体腔液内的ACP、 LSZ、CAT、T-SOD和/或MDA非特异性免疫指标中的应用。

在本发明的另一方面，还涉及上述多糖降低海参的自然感染率中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用是通过注射上述多糖来实 现。

具体实施方式

实施例1

制备多糖：以南极菌株Pseudoalteromonas elyakovii3-3-1-2，保藏编号为： CGMCC No.7629，保藏日期为：2013年5月17日，保藏单位为：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号。在发酵培养基(g/L)蔗糖30-40g，酵母浸膏10-20g，K₂HPO₄0.2-0.3g， 陈海水，按5～7％的比例接入南极菌株Pseudoalteromonas elyakovii种子液，于10±1℃培养 120h，经醇沉、除蛋白、冷冻干燥后获得的极地微生物EPS，胞外多糖产量可达4.8 g/L。。

实施例2

1、用0.1mol/L、pH7.4的无菌PBS缓冲液配制浓度为3mg/mL极地微 生物EPS溶液。选择体重(100±5)g、体长(12±0.6)cm、体色基本一致的健 康大菱鲆，随机分养于水族箱中，适应驯化1周后开始实验。实验中采用水温 15-18℃海水，每天早晨8:00喂食、10:00换水排污。实验时，将鱼随机分为 3组，每组15尾，每组处理2个重复。对照组肌肉注射0.1mL PBS缓冲液、 空白实验组肌肉注射0.1mL多糖溶液、阳性对照组肌肉注射0.1mL黄芪多糖 溶液。

2、分别在注射第3d、5d、7d时，从每尾鱼尾静脉取血1mL，4℃静 置过夜，第二天取血清，2000r/min离心5min，取上清液测定各酶活性。

3、实验组大菱鲆血清AKP最佳活性时间为实验第3d，此时，注射EPS 3-3-1-2的实验组AKP活性比PBS对照组提高了12.4％。

4、极地胞外多糖对大菱鲆血清ACP最佳活性时间为实验第5d，此时， EPS3-3-1-2的实验组ACP活性比PBS对照组提高了24.8％。

5、在注射极地胞外多糖EPS第3、5d时，EPS3-3-1-2的实验组T-SOD 活性比PBS对照组分别提高了7.4％和6.96％。

6、注射极地胞外多糖第3、5和7d时，EPS3-3-1-2的实验组CAT活性 比PBS对照组分别提高了9.9％、4.7％和5.2％。

7、注射极地胞外多糖EPS第3、5和7d时，EPS3-3-1-2的实验组LSZ 活性比PBS对照组分别提高了57.3％、41.7％和44.96％。

8、大菱鲆在注射浓度为3mg/mL的EPS3-3-1-2后，感染鳗弧菌20d时 对鳗弧菌的感染率和死亡率分别比对照组降低了60％和20％。

实施例3

1、刺参大小基本一致，每头体质量约为125g，伸展的体长约为20cm。 试验中，每组选取10头健康实验参，实验组每头刺参注射浓度为2、4mg/mL 的多糖溶液0.1mL，空白组注射0.1mL的纯新鲜海水。

2、试验期间，正常投喂饵料，并置于遮光、适宜温度的海水环境中。各 处理组刺参每隔7d抽取适量体腔液，随即置于-20℃冷冻保存。试验期间同时 记录发病情况。

3、注射EPS3-3-1-2浓度为4mg/mL的实验组ACP活性比对照组至少提 高了14%，浓度为2mg/mL的实验组ACP活性28d时提高程度最大，此时酶 活比对照组的高约63％。

4、注射EPS3-3-1-2浓度为4mg/mL的实验组在整个试验期间，其酶活 比对照组至少提高了22.3％，注射EPS浓度为2mg/mL的实验组28d时的LSZ 酶活比对照组增加了6.8倍。

5、注射EPS3-3-1-2浓度为4mg/mL的实验组在整个试验期间，其酶活 比对照组至少提高了22.3％，实验第35d时酶活最大，且比对照组酶活提高了 96.8％。注射EPS浓度为2mg/mL的实验组28d时的LSZ酶活比对照组增加 了6.8倍，在第21d时其酶活比对照组提高了194％。

6、注射EPS3-3-12浓度为4mg/mL的实验组在实验第7d和28d时，其 T-SOD活力比对照组分别提高了132％和49.8%，浓度为2mg/mL的实验组在 实验第28d时T-SOD活力比对照组提高了36.7％。

7、在28d时，注射EPS浓度为4mg/mL实验组MDA含量比对照组降低 了82.2％，浓度为2mg/mL的实验组MDA含量比对照组降低了54.9％。

8、注射EPS3-3-1-2浓度为4mg/mL实验组在第21、28和35d时保护率 均保持在100％；注射浓度为2mg/L实验组在第21、28和35d时保护率分别 为100％、80％和70％，；对照组在第21、28和35d时保护率分别为80％、70％ 与60％。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。