一种用于何首乌及其中药制剂肝毒性评价的生物毒性效价检定方法

摘要

本发明提供一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生物毒性效价检定方法。所述毒性效价生物检定法可以准确、快捷地检测何首乌的整体毒性，对药材进行统一的毒性效价标示。在药材生产、加工、销售等环节，毒性效价检测可以作为药材质量控制的手段之一。在临床上，医生可以根据药材的标示毒性效价调整用药剂量，从而保证用药安全。

说明书

技术领域

本申请涉及一种用于何首乌及其中药制剂肝毒性评价的生物毒性效 价检定方法。

背景技术

何首乌是常用的传统补益类中药，为祖国草药中的四大仙草之一。何 首乌作为一种常见的补益类中药，不论单用、配伍还是处方、非处方以及 保健品的应用都非常的广泛。在民间何首乌流传为补肝肾、乌须发、乃至 长生不老的仙药，在一定程度上夸大了何首乌的功效，而其可能引发肝损 伤的风险却很少受到重视，因而近年来国内外相继出现了何首乌肝毒性与 不良反应的报道。

《中华人民共和国药典》收载何首乌及其炮制加工品制何首乌，生首 乌具有解毒、消痈、润肠通便的功效。制何首乌性补益精血、乌须发、强 筋骨、补肝肾等功效，制首乌的肝毒性较生首乌轻，但是仍然存在有一定 程度的损害，临床上的应用也主要以制首乌为主。何首乌的炮制方法较多， 药典收载何首乌的炮制方法有清蒸法、黑豆汁蒸法和黑豆汁炖法。目前市 场上制何首乌的质量参差不齐，其炮制方法及炮制时间是否符合药典规定 尚未可知，这大大增加了何首乌引发肝损伤的风险。因此，何首乌的质量 控制成为其临床安全应用的重要前提。

目前何首乌质量控制方法主要是用高效液相色谱法测定二苯乙烯苷 和蒽醌的含量。但由于何首乌毒性物质不明确，因此通过化学成分分析法 并不能有效地表征何首乌的肝毒性。因此，需要一种能够直观地标示出何 首乌的总毒性大小，保障临床用药安全性的毒性生物检测方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生 物毒性效价检定方法。

毒性效价(toxic potency)检定方法是以中药产生的毒性为基础，融入 定量药理学与药检分析的双重属性和要求来表征中药安全性的一种实验 方法，从而为其质量控制提供依据。在检测何首乌及其中药制剂肝细胞毒 性时，细胞抑制率的结果主要是重现其肝细胞毒性的趋势和规律，不一定 要重现试验数据的绝对值，重在证实试验结果与对照组比较是否具有显著 性差异及统计学意义；而毒性效价的检测则要求重现试验数据的绝对值， 同时还需确定线性范围，并考察精密度、重现性、甚至回收率，因此毒性 效价的检定较单纯的抑制率检测重现性好，能够更为准确可靠的评价何首 乌及其中药制剂的质量，保证临床安全用药。

具体地，本申请提供了一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生 物毒性效价检定方法，所述生物毒性效价检定方法包括下述步骤：

a.配制供试品溶液和供试品稀释液

制备何首乌或其固体制剂的干浸膏；

在测定前，用细胞培养液将所述干浸膏配置成供试品溶液，过滤除菌， 备用；

测定时，估计供试品毒性效价，用所述细胞培养液稀释供试品溶液， 得到不同浓度的供试品稀释液；

其中所述干浸膏如下制备：

称取何首乌或其固体制剂形式的供试品粉末，用乙醇浸泡，超声处理， 过滤，得到的滤液减压浓缩，真空干燥，制得干浸膏，计算收率；

b.配制对照品溶液和对照品稀释液

用所述细胞培养液将具有肝细胞毒性的对照品配制成对照品溶液，过 滤除菌，贮存，备用；

测定时，用所述细胞培养液稀释对照品溶液，得到不同浓度的对照品 稀释液；

c.测定

以肝细胞作为供试细胞，将所述肝细胞接种于细胞培养板中，并在培 养箱内培养12～48小时，吸出细胞培养液，加入所述对照品稀释液或所 述供试品稀释液，放入培养箱内孵育，之后吸出培养板内的对照品稀释液 或供试品稀释液，计算细胞抑制率；

d.生物毒性效价计算

对细胞抑制率进行数据转换，并将转换结果作为评价指标，按照中国 药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的量反应平行线二剂量法计 算毒性效价及实验误差，可信限率FL％不超过40％。

其中，所述细胞培养液是在常规方法中用于培养肝细胞的细胞培养 液。

其中，估计供试品毒性效价的方法可以通过检测供试品在一个大的剂 量范围内的细胞抑制率的预实验来进行，所述预实验如上文的步骤c所述 的方法。

在一些实施方式中，所述细胞培养液可以由1640培养液、胎牛血清 和10000U/ml的青链霉素配置而成。

在一些实施方式中，所述细胞培养液中的1640培养液、胎牛血清和 10000U/ml的青链霉素的体积百分数可以分别为89％、10％和1％。

在一些实施方式中，在步骤a中：所述供试品粉末可以预先过10～100 目筛；所述乙醇的按毫升计的体积可以为供试品粉末的按克计的重量的 5～15倍；所述乙醇可以是体积百分数为5～95％的乙醇，优选地，所述乙 醇可以是体积百分数为50％的乙醇；所述浸泡提取的时间可以为30～60分 钟，超声处理的时间可以为15～60分钟；供试品溶液贮存温度可以为4℃； 所述过滤除菌可以是用孔径为0.2μm的微孔滤膜来过滤除菌；所述供试品 溶液可以是10.00mg/ml～20.00mg/ml的溶液。

在一些实施方式中，在步骤b中：对照品溶液可以为5.00mg/ml～10.00 mg/ml的溶液；对照品溶液贮存温度可以为4℃；所述过滤除菌可以是用孔 径为0.2μm的微孔滤膜来过滤除菌。

在一些实施方式中，在步骤b中，所述具有肝细胞毒性的对照品可以 为对乙酰氨基酚。

在一些实施方式中，步骤c中的所述肝细胞可以为人正常肝细胞L02 细胞系或鼠原代肝细胞。优选地，所述肝细胞可以为人正常肝细胞L02细 胞系。

在一些实施方式中，步骤c中的细胞接种浓度可以为1.8×10⁴～1.4× 10⁵个/ml。优选地，步骤c中的细胞接种浓度可以为3.5×10⁴个/ml。

在一些实施方式中，在步骤c中，加入对照品稀释液或供试品稀释液 后，在培养箱内孵育的时间可以为24～48小时。优选地，孵育时间可以 为24小时。

其中，步骤c中的培养可以在37℃、5％CO₂的培养箱内进行。

在一些实施方式中，在步骤c中，所述细胞抑制率的检测方法可以为 CCK-8法或MMT法，优选地，所述细胞抑制率的检测方法可以为CCK-8 法。

其中，CCK-8法是在吸出培养板内的对照品稀释液或供试品稀释液 后，加入2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单 钠盐(CCK-8)继续孵育，之后检测490nm吸光度，计算细胞抑制率。

其中，MTT法是在吸出培养板内的对照品稀释液或供试品稀释液后， 加入噻唑蓝(MTT)继续孵育，之后加入二甲基亚砜溶解并检测490nm 吸光度，计算细胞抑制率。

在一些实施方式中，在CCK-8法中，可以加入体积比为5％～10％的 CCK-8。

在一些实施方式中，在CCK-8法中，加入CCK-8后，继续孵育的时 间可以为30分钟～60分钟。

在一些实施方式中，在MTT法中，加入的MTT的浓度可以为0.50 mg/ml。

在一些实施方式中，在MTT法中，加入MTT后，继续孵育的时间可 以为4小时。

在一些实施方式中，在步骤c中，所述对照品稀释液可以是1.01 mg/ml～3.18mg/ml的对乙酰氨基酚溶液。

在一些实施方式中，在步骤c中，所述对照品稀释液可以是1.79mg/ml 和2.39mg/ml的对乙酰氨基酚溶液。

在一些实施方式中，在步骤c中，所述供试品稀释液可以是 1.90mg/ml～6.00mg/ml的溶液。

在一些实施方式中，在步骤c中，所述供试品稀释液可以是2.53mg/ml 和3.38mg/ml的溶液。

在一些实施方式中，在步骤d中，采用三次方对细胞抑制率进行数据 转换。

在一些实施方式中，在步骤d中，所述可信限率FL％不超过20％。

其中，本文所给出的供试品溶液或供试品稀释液的浓度以mg/ml为单 位，其相当于每毫升溶液中含有的生药量，比如2.50mg/ml表示相当于每 毫升2.50毫克生药量的溶液。且供试品溶液或供试品稀释液的浓度是依据 以下公式换算的：(称取的何首乌原料×收率)÷溶液的体积。

其中，根据中国药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的量反 应平行线法的要求，用于计算毒性效价的供试品稀释液的浓度应满足以下 关系：供试品稀释液的浓度与细胞抑制率之间具有正相关关系且通过数据 转换后剂量效应间应具有线性关系。其中，可以对剂量和/或细胞抑制率进 行数据转换，只要其最后的剂量效应间具有线性关系就可以。在本申请中， 数据转换是对细胞抑制率进行转换。

而且，对照品稀释液的浓度应符合以下要求：在对照品稀释液中，进 行与供试品溶液相同的数据转换后，剂量效应间具有线性关系并且与数据 转换后的供试品剂量效应关系成平行线。

因此，根据上述要求，本领域的技术人员可以通过如上述步骤c所述 的测定方法的预实验来确定可用于计算毒性效价的供试品稀释液和对照 品稀释液的浓度。

与现有的中药安全性评价方法相比，本申请的何首乌生物毒性效价检 定方法具有如下优点：

1)本申请的生物毒性效价检定方法可以评价药物的整体毒性；

2)本申请检测肝细胞毒性效价，直接标识出药材的内在质量，与临 床安全性密切相关；

3)以对照品当量表示药材总毒性，可以对药材毒性大小进行统一标 示，便于不同样品毒性大小的比较及毒性限量的设定；

4)本申请的生物毒性效价检定方法结果准确，精密度高，同时操作 简便，用时较短，经济成本低。

因此，本申请提供的毒性效价生物检定法可以准确、快捷地检测何首 乌的整体毒性，对药材进行统一的毒性效价标示。在药材生产、加工、销 售等环节，毒性效价检测可以作为药材质量控制的手段之一。在临床上， 医生可以根据药材的标示毒性效价调整用药剂量，从而保证用药安全。

附图说明

图1不同的细胞接种浓度下的细胞生长曲线图；

图26.00mg/ml的供试品稀释液在不同的培养时间下的抑制率曲线 图；

图3用不同浓度的乙醇所提取的何首乌提取物对L02细胞的抑制率 的柱状图；

图4用常规的MTT法和CCK-8法检测不同浓度下的供试品稀释液 的细胞抑制率的曲线图；

图5A-5C供试品稀释液的剂量与不同细胞抑制率转换的效应关系曲 线图；

图6对照品稀释液的剂量与细胞抑制率三次方的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认 识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术 方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本 申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。

以下实施例中采用的物质，除了注明的之外，其余均为市售。

实施例1

检测何首乌的毒性效价

供试品：何首乌(购自北京绿野药业有限公司，批号120050904，产 地：湖北)。

对照品：对乙酰氨基酚(购自中国药品生物制品检定所，批号 100018-200408)，赋值1mg＝0.5u，u为肝细胞毒性效价(potency)单位数。

试剂：CCK-8(购自日本同仁化学研究所，批号EW728)。

肝细胞：L02细胞(购自中国典型培养物保藏中心)。

细胞培养液：将89.00ml的1640培养液(Gibco，批号1161726)，10.00ml 的胎牛血清(Gibco，批号505985)以及1.00ml的10000U/ml青链霉素(罗 基(北京)生物技术有限公司，批号ZC03418)置于已灭菌的盐水瓶中， 配制成细胞培养液。

a.细胞培养及孵育条件的确定

将L02细胞以1.4×10⁵个/ml、7.0×10⁴个/ml、3.5×10⁴个/ml、1.8×10⁴个/ml、8.8×10³个/ml、4.4×10³个/ml、2.2×10³个/ml及0个/ml(空白) 的浓度接种于96孔板中，每孔200μl，在37℃，5％CO₂的培养箱内进行 常规培养，以细胞实时监测仪比较不同接种浓度的L02细胞的生长状况。 如图1所示的。当接种浓度在1.8×10⁴～1.4×10⁵个/ml范围内时，细胞生 长指数均可达到最高状态，其中细胞接种浓度为3.5×10⁴个/ml，培养24 小时后处于生长对数期的三分之一到二分之一之间，适于给药。故优选地， L02细胞接种浓度为3.5×10⁴个/ml。

将L02细胞以3.5×10⁴个/ml接种于96孔板中，每孔200μl。在37℃， 5％CO₂的培养箱内进行常规培养24h，吸出细胞培养液，加入6.00mg/ml 的供试品稀释液，每孔200μl，分别孵育6h，12h，24h和48h，检测细 胞抑制率，发现培养24h后检测到的细胞抑制率明显大于培养6h及12h， 且与培养48h后的检测结果无明显差异(如图2所示的)。故选择药物孵 育时间为24～48h，优选地为24h。

b.比较不同溶剂提取何首乌供试品的细胞毒性

分别称取何首乌的粉末(过100目筛)10g，分别置于6个磨口锥形 瓶中，分别加入水、5％乙醇，25％乙醇，50％乙醇、75％乙醇以及95％乙 醇各100.00ml。浸泡30min，超声处理30min，抽滤，得到的滤液减压回 收溶剂，真空干燥，制得粉末状的干浸膏，计算收率。其中，％表示体积 百分数。

用细胞培养液将得到的干浸膏配制成15.00mg/ml的供试品溶液，用 0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，并用细胞培养液稀释成6.00mg/ml，得到6 个不同的供试品稀释液，分别编号为水、5％乙醇提取物、25％乙醇提取物、 50％乙醇提取物、75％乙醇提取物和95％乙醇提取物。

将肝细胞接种于96孔板中，细胞浓度3.5×10⁴个/ml，每孔200μl； 在37℃，5％CO₂的培养箱内进行常规培养24h，吸出细胞培养液，分别加 入上述6个不同的供试品稀释液，每个编号设6个复孔，每孔200μl。培 养箱内培养24h，吸出培养板内的药液，加入体积比为5％的CCK-8继续 培养60min后，检测450nm吸光度，计算平均细胞抑制率，结果如图3 所示。由图3可知：乙醇提取物均可产生肝细胞毒性，其中用50％乙醇所 提取的提取物毒性最大，故50％乙醇为最佳提取溶剂。

c.细胞抑制率检测方法的确定

使用细胞培养液将50％乙醇提取的何首乌干浸膏配置成10.00mg/ml 的供试品溶液，0.2μm的微孔滤膜过滤，在4℃下贮存。用细胞培养液将 供试品溶液稀释成0.90mg/ml、1.30mg/ml、2.00mg/ml及3.00mg/ml，得到 供试品稀释液。

分别采用MTT法和CCK-8法检测细胞抑制率，其中细胞培养的方法 与b中所述的细胞培养方法相同，仅将所用的药液替换成浓度为 0.90mg/ml、1.30mg/ml、2.00mg/ml及3.00mg/ml的供试品稀释液。

MTT法是将培养板内药物吸出后，加入5.00mg/ml的MTT20μl及细 胞培养液180μl，继续孵育4小时，之后加入二甲基亚砜100μl溶解并检测 490nm处吸光度，计算细胞抑制率。

CCK-8法是将培养板内药物吸出后，加入体积比为5％的CCK-8 100μl，继续孵育60分钟，检测490nm处吸光度，计算细胞抑制率。

结果如图4所示，两种方法趋势基本一致，其中CCK-8法灵敏度及稳 定性更好。因此，优选CCK-8法作为检测细胞抑制率的方法。

d.数据转化方式的确定

使用细胞培养液将50％乙醇提取的何首乌干浸膏配置成20.00mg/ml 的供试品溶液，用0.2μm的微孔滤膜过滤，在4℃下贮存。用细胞培养液 将供试品溶液分别稀释成1.90mg/ml、2.53mg/ml、3.38mg/ml、4.50mg/ml 以及6.00mg/ml，得到供试品稀释液。以与b中所述的细胞培养方法相同 的方法来培养细胞，仅将药液替换成浓度为1.90mg/ml、2.53mg/ml、3.38 mg/ml、4.50mg/ml以及6.00mg/ml的供试品稀释液，然后使用与步骤b所 述的相同的CCK-8法检测细胞抑制率，在1.90-6.00mg/ml的浓度范围内， 供试品稀释液的浓度与细胞抑制率之间有正相关关系。采用了对数转换 (如图5A所示的)、平方转换(如图5B所示的)及三次方转换(如图5C 所示的)对细胞抑制率进行数据转换，其中进行三次方转换后剂量效应间 具有良好的线性关系(如图5C所示的)，因此，细胞抑制率进行三次方转 换为最佳数据转换方式。

当细胞抑制率在40～70％时，该供试品的稀释液浓度范围为 2.53mg/ml～3.38mg/ml，因此优选地将浓度为2.53mg/ml和3.38mg/ml的供 试品稀释液用于二剂量法。

另外，精密称取对乙酰氨基酚100mg置于10ml容量瓶中，加细胞培 养液至刻度，密塞，振摇使完全溶解，0.2μm的微孔滤膜过滤，得到对照 品溶液，4℃下贮存。用细胞培养液将对照品溶液分别稀释至浓度为1.01 mg/ml、1.34mg/ml、1.79mg/ml、2.39mg/ml以及3.18mg/ml，得到对照 品稀释液。以与b中所述的细胞培养方法相同的方法来培养细胞，仅将药 液替换成浓度为1.01mg/ml、1.34mg/ml、1.79mg/ml、2.39mg/ml以及3.18 mg/ml的对照品稀释液，然后使用与步骤b所述的相同的CCK-8法检测细 胞抑制率，发现在1.01～3.18mg/ml范围内时，给药浓度与抑制率的三次 方具有良好的线性关系(如图6所示的)。

其中细胞抑制率在40～70％时，对照品浓度范围为1.79mg/ml～2.39 mg/ml，因此优选地将浓度为1.79mg/ml和2.39mg/ml的对照品稀释液用 于二剂量法。

e.毒性效价及实验误差的计算

用细胞培养液将对照品配制成5.00mg/ml的对照品溶液，过滤除菌，4 ℃下贮存。用细胞培养液将对照品溶液稀释成3.18mg/ml的对照品稀释液， 然后按照0.75的剂距用细胞培养液稀释，得到1.79mg/ml(3.18 mg/ml*0.75*0.75)和2.39mg/ml(3.18mg/ml*0.75)的对照品稀释液。

使用细胞培养液将50％乙醇提取的何首乌干浸膏配置成10.00mg/ml 的供试品溶液，过滤除菌，用细胞培养液稀释成6.00mg/ml的供试品稀释 液，然后按照0.75的剂距用细胞培养液来稀释，得到2.53mg/ml (6.00mg/ml*0.75*0.75*0.75)以及3.38mg/ml(6.00mg/ml*0.75*0.75)的 供试品稀释液。

采用前述CCK-8法检测细胞抑制率，然后对细胞抑制率进行三次方转 化，以转化结果为评价指标，按中国药典2010版二部附录XIV生物检定 统计法中的量反应平行线二剂量法计算毒性效价及实验误差，可信限率 FL％不超过10～40％，优选地不超过20％。

下面具体给出测定上文所选择的不同浓度下的供试品稀释液(50％乙 醇溶液提取的供试品稀释液)与对照品稀释液(对乙酰氨基酚对照品稀释 液)对细胞抑制率转换的相关结果。(表1)

表1对不同浓度的供试品稀释液与对照品稀释液的细胞抑制率进行数 据转换的结果

以细胞抑制率的三次方为指标，以对乙酰氨基酚为参照，采用二剂量 法计算何首乌的肝毒性效价，结果见表2。

表2何首乌肝毒性效价测定可靠性检测结果

可靠性检测结果表明回归项有非常显著意义(P＜0.01)，偏离平行的差 异无显著意义(P＞0.05)，说明供试品和标准品呈平行直线关系，可用量反 应平行线原理的方法计算供试品毒性效价及可信限。

研究结果表明，以对乙酰氨基酚的毒性效价为500u/g，何首乌的肝细 胞毒性效价为336.6u/g，可信限率FL＝8.9％，符合生物检测要求。对于制 首乌也可以采用类似于上述实施例的方法来评估毒性效价。

实施例2

检测何首乌固体制剂的毒性效价

供试品：

坤宝丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号2035138)；

润燥止痒胶囊(贵州同济堂制药有限公司，批号120319)；

养血生发胶囊(天津宏仁堂药业有限公司，批号B010521)；

首乌延寿片(太极集团四川绵阳制药有限公司，批号12070003)；

脑脉泰胶囊(桂林三金药业股份有限公司，批号120908)；

斑秃丸(广州敬修堂(药业)股份有限公司，批号H10033)；

白蚀丸(广州中一药业有限公司，批号R00001)；

降脂灵片(国药药材冷水江制药有限公司，批号20121008)。

对照品、试剂、肝细胞及细胞培养液与实施例1相同。同时，用于二 剂量法的对照品稀释液的浓度与实施例1相同，浓度也为1.79mg/ml和2.39 mg/ml。

采用与实施例1相同的方法，用50％乙醇提取的上述8种供试品的浸 膏来配置供试品溶液和供试品稀释液，并进行细胞抑制率检测。根据细胞 抑制率检测结果，选取浓度为18mg/ml和13.5mg/ml的养血生发胶囊、斑 秃丸和降脂灵片浸膏供试品稀释液用于二剂量法，且选取浓度为6mg/ml 和4.5mg/ml的脑脉泰胶囊和白蚀丸供试品稀释液用于二剂量法。同时， 试验发现，坤宝丸、润燥止痒胶囊以及首乌延寿片供试品稀释液在提高给 药剂量达到20mg/mL时，仍未出现细胞抑制作用，因此，认为未检出毒 性效价。

以细胞抑制率的三次方为指标，以对乙酰氨基酚为参照，采用二剂量 法计算上述何首乌固体制剂的肝毒性效价并进行可靠性检测分析。可靠性 检测结果表明，上述何首乌固体制剂供试品和标准品呈平行直线关系，可 用量反应平行线原理的方法计算供试品毒性效价及可信限。

以对乙酰氨基酚的毒性效价为500u/g，何首乌固体制剂的肝细胞毒性 效价及可信限率如表3所示。

表3.8种含何首乌固体制剂的毒性效价检测结果及可信限率

以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和 实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内， 当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变 化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施 例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界 定的范围内。