人工血小板PLGA-PEG-RGD在制备静脉用全身性纳米止血药中的应用

摘要

本发明公开了一种用于预防和治疗全身性出血，包括创伤失血、脏器内出血、深部出血及手术出血的静脉用纳米止血药PLGA-PEG-RGD及其制备工艺。实验证明，本发明的PLGA-PEG纳米颗粒负载RGD三肽的人工血小板PLGA-PEG-RGD具有高效的止血效果，可以用作静脉用全身性纳米止血材料，为复杂战创伤、脏期内出血和外科手术的止血救治提供了更多的药物选择，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种两亲性的高分子材料负载多肽的人工血小板，具体涉及一种新型 的PLGA-PEG纳米颗粒负载RGD三肽的人工血小板PLGA-PEG-RGD及其制备方法与以其 为活性成分制备静脉用全身性纳米止血药中的应用。

背景技术

创伤大失血导致的死亡率无论在平时和战时都很高。失血可分为内出血和外出 血，平时的创伤患者拥有“黄金一小时”的救治时间，而对于战场上的伤员只有“白 金5分钟”。传统的伤口止血材料(急救包、四头带、止血带和绷带等)基本解决了 严重的外出血的止血问题，而内出血大部分是因脏器破裂造成，因无法使用外用止血 材料，使伤后“第一时间”止血几乎不可能，失血性休克的发生率及伤员的死亡率高。 因此，如何在第一时间快速有效地救治大失血及内出血病人是战伤救治的重要问题。

重组人凝血因子VII(rFVII)是全身用止血药的代表，但rFVII具有分子量大、生产 成本高、价格昂贵、表达量低、易失活、不易保存等缺点，大大限制了其在战伤救治 中的应用(Nunez TC，Cotton BA.Transfusion therapy in hemorrhagic shock.Curr  Opin Crit Care2009，15：536-541)。另外，血小板制品因供者来源有限、免疫原 性、不易储存、易失活等缺缺陷，也限制了其在紧急救治中的应用。

近年来，研究者用高分子材料负载多肽构建人工血小板的研究成为了纳米止血材 料的一个新的方向。Lavik小组报道了一种高分子材料负载止血活性因子的合成血小 板(Bertram JP，Williams CA，Robinson R，et al.Intravenous Hemostat： Nanotechnology to Halt Bleeding.Sci Transl Med2009，1：1-8)。该人工血小 板使用了PLGA-PLL作为高分子载体的疏水内核，PEG作为亲水的冠状外层，将GRGDS 五肽接枝到PEG上。通过静脉给药，负载多肽的纳米止血颗粒能够靶向性与激活的血 小板结合，促进血小板聚集并进一步激发凝血机制，快速止血的目的。在小鼠的股动 脉受伤模型和肝脏的内出血模型中(Shoffstall AJ，Atkins KT，Groynom RE，et al. Intravenous hemostatic nanoparticles increase survival following blunt trauma  injury.Biomacromolecules2012，13：3850-3857)均显示了很好的止血效果。此外， 该人工血小板在室温下稳定存在。在形成血栓的过程中与血块合并在一起；24小时内， 人工血小板已经完全被吸收；在使用后的7天内，没有发现明显的副作用。但是，该 人工血小板存在合成方法相对复杂的缺点。

发明内容

在上述背景下，本发明利用高分子聚合物PLGA(FDA批准药用辅料)、PEG和RGD 三肽设计合成出一种新型的静脉用全身性纳米止血药，因此，本发明目的在于提供一 种新型的PLGA-PEG嵌段共聚物负载RGD的人工血小板PLGA-PEG-RGD。

本发明所提供的PLGA-PEG嵌段共聚物负载RGD的人工血小板PLGA-PEG-RGD，是 由高分子聚合物聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)连接聚乙二醇(PEG)再连接RGD得到的。

其分子结构式如式I所示，

(式I)

其中，x代表PLGA中乳酸的个数，x＝233-400；y代表PLGA中羟基乙酸的个数， y＝233-400；n代表聚乙二醇的(CH₂-CH₂-O)片段的个数，n＝20-134。

所述PLGA型号优选为Resomer503H(50∶50lactic to glycolic acid ratio， Mw＝25kDa)；PEG型号优选为异官能团聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH，Mw＝3400Da)。

所述人工血小板PLGA-PEG-RGD为纳米颗粒。

本发明还提供了一种制备上述人工血小板PLGA-PEG-RGD的方法，可包括以下步 骤：

步骤一：PLGA-NHS的合成

根据以下化学方程式，将端羧基的PLGA(Resomer503H)和NHS合成活化酯 PLGA-NHS；

式中x、y的限定与前述相同；

步骤二：PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的合成

将活化酯PLGA-NHS和异官能团修饰的聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH)通过酰胺键连接 得到端羧基的PLGA-PEG的嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH；

式中n的限定与前述相同；

步骤三：PLGA-PEG-NHS的合成

根据以下化学方程式，将PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的端羧基在EDC 作用下与NHS反应得到相应的活化酯PLGA-PEG-NHS；

步骤四：PLGA-PEG-RGD的合成

根据以下化学方程式，将活化酯PLGA-PEG-NHS与RGD三肽(精氨酰-甘氨酰-天 冬氨酸，Arg-Gly-Asp)的端氨基在碱性条件下对接得到PLGA-PEG-RGD；

步骤五：纳米颗粒的制备和收集

纳米微球的制备方法为：将步骤四制备的PLGA-PEG-RGD溶于可以与水混溶的溶 剂，在超声作用下将得到的高分子溶液缓慢滴加入纯水溶液中，在室温下搅拌挥发至 形成悬浊液，再滴加聚丙烯酸溶液(1g/100ml)，有絮状沉淀析出，静置，离心，纳米 颗粒固体再用蒸馏水洗涤三次，用该固体配制溶度为5-25mg/mL(优选为10mg/mL) 的水溶液，用液氮快速冷冻，冷冻干燥得到粉体纳米颗粒。

本发明还一目的在于提供一种静脉用全身性纳米止血药，其活性成分为所述的人 工血小板PLGA-PEG-RGD。该药为静脉注射液，用生理盐水或PBS将PLGA-PEG-RGD纳 米颗粒分散后形成。

分散包括以下过程：用生理盐水(0.9％NaCl溶液)或PBS(配方：1.75mM KH₂PO₄， Na₂HPO₄，10.06mM NaCl，2.68mM KCl，pH7.2-7.4)悬浮纳米微球至其浓度为5-25mg/mL， 并超声分散(200-300瓦、60-120min)，得到纳米微球的分散液。

分散液中纳米微球浓度优选为20mg/mL，超声分散优选为250瓦下超声60min。

所述人工血小板PLGA-PEG-RGD在制备针对全身性大失血及内出血的静脉用止血 药中的应用也属于本发明。

包含所述人工血小板PLGA-PEG-RGD或所述静脉用全身性纳米止血药的急救包也 属于本发明内容。

综上，本发明公开了一种用于预防和治疗全身性出血，包括创伤失血、脏器内出 血、深部出血及手术出血的静脉用纳米止血药PLGA-PEG-RGD及其制备工艺。本发明 具有以下优点：

1)适用于全身性失血的止血，尤其对脏器内出血以及战场上穿透伤出血的救治 提供新的治疗方法；

2)静脉注射给药适于复杂条件下的创伤救治，比如可提高战场上单兵自救互救 能力，提高车祸等重大事故中的伤员自救能力；同时具有预防治疗双重功能；

3)本发明中的RGD纳米颗粒性能稳定，可制成冻干粉使用，利于保存，适合在 野外条件下使用，比如装备部队，提高复杂战创伤救治能力；

4)价格低廉：具有优于rFVII的止血效果，但克服了生物制品(例如rFVII因子) 价格昂贵、表达量低、易失活、不易保存等缺陷；

5)不具有免疫原性，不会传播传染性疾病；

6)制备方法简单，易操作。本发明和现有技术中已知的PLGA-PLL-PEG接枝GRGDS 五肽人工血小板相比有两方面的进步：a.高分子载体的合成步骤简化，使用PLGA-PEG 嵌段共聚物代替了PLGA-PLL-PEG——PLGA-PEG嵌段共聚物的合成包括：端羧基的PLGA 用NHS活化得到相应的活化酯，该活化酯在碱性条件下与聚乙二醇的氨基反应得到 PLGA-PEG嵌段共聚物，只需要两步反应；而PLGA-PLL-PEG的合成包括：端羧基的PLGA 与苄氧羰基保护的聚赖氨酸通过酰胺键连接得到了PLGA-PLL，再用溴化氢/醋酸溶液 脱去保护基得到端氨基的PLGA-PLL，PEG先用羰基二咪唑活化，进一步与端氨基的 PLGA-PLL连接得到了PLGA-PLL-PEG，共需要四步反应。b.使用了RGD三肽代替了GRGDS 五肽，节约了合成成本。

综上所述，本发明的PLGA-PEG纳米颗粒负载RGD三肽的人工血小板PLGA-PEG-RGD 具有高效的止血效果，可以用作静脉用全身性纳米止血材料，为复杂战创伤、脏期内 出血和外科手术的止血救治提供了更多的药物选择，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为动态光散射(DLS)检测PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的大小

图2为扫描电镜观察PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的结果

图3为PBS、RGD多肽、PLGA-PEG-RGD纳米颗粒对凝血时间的影响

图4为代表性的某一人份的TEG结果图

图5为大鼠肝损伤静脉给药后出血伤口的切面

图6为大鼠肝损伤静脉给药后血压的变化

具体实施方式

RGD是Arg-Gly-Asp氨基酸序列，存在于人体大多数粘附蛋白中，是粘附蛋白与 细胞表面特异受体蛋白相互作用主要的识别位点。血栓的形成开始于血小板的聚集。 血小板的聚集需要血小板特异的整联蛋白GP II b-III a与含RGD序列的可溶性血液 蛋白(如纤维蛋白原)的相互作用，后者作为衔接蛋白把血小板聚集在一起。参与凝血 过程的纤维蛋白原(即凝血因子F I)、纤维连接蛋白(FN)和冯-维勒布兰德因子(von  Willebrand Factor，vWF)等，都含有保守的RGD氨基酸序列区。由于纤维蛋白原的 RGD序列与位于活化血小板GP II b/IIIa结合，是血小板聚集和血栓形成的共同通路。 因此，RGD序列是血小板聚集和黏附的关键序列。

基于以上分析，本发明提出一种新型的PLGA-PEG纳米颗粒负载RGD三肽的人工 血小板，命名为PLGA-PEG-RGD。

本发明所提供的人工血小板PLGA-PEG-RGD，其分子结构式如式I所示，是由高分 子聚合物聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)连接聚乙二醇(PEG)，再连接RGD氨基酸残基序 列得到的。其结构式如式I所示：

   (式I)

其中，x代表PLGA中乳酸的个数，x＝233-400；y代表PLGA中羟基乙酸的个数， y＝233-400；n代表聚乙二醇的(CH₂-CH₂-O)片段的个数，n＝20-134。

所述高分子聚合物聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)的型号优选为Resomer503H(50∶50 lactic to glycolic acid ratio，Mn＝25kDa)；聚乙二醇(PEG)的型号优选为异官 能团聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH，Mw＝3400Da)；RGD为(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸， Arg-Gly-Asp)三肽。

本发明还提供了一种制备上述人工血小板PLGA-PEG-RGD的方法。

所述制备方法中使用的原料都可从市场上购买，本领域的技术人员可以根据本发 明的制备方法制备得到所述任意一种化合物。

本发明所提供的制备人工血小板PLGA-PEG-RGD的方法，可包括以下步骤：

步骤一：PLGA-NHS的合成

根据以下化学方程式，将端羧基的PLGA(Resomer503H)和NHS(N-羟基丁二酰 亚胺)合成活化酯PLGA-NHS；

x、y含义与前述限定相同。

步骤二：PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的合成

将活化酯PLGA-NHS和异官能团修饰的聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH)通过酰胺键连接 得到端羧基的PLGA-PEG的嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH；

n的含义与前述限定相同。

步骤三：PLGA-PEG-NHS的合成

根据以下化学方程式，将PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的端羧基在EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)作用下与NHS反应得到相应的活化酯 PLGA-PEG-NHS；

步骤四：PLGA-PEG-RGD的合成

根据以下化学方程式，将活化酯PLGA-PEG-NHS与RGD三肽(精氨酰-甘氨酰-天 冬氨酸，Arg-Gly-Asp)的端氨基在碱性条件下对接得到PLGA-PEG-RGD；

步骤五：纳米微球(纳米颗粒)的制备和收集

纳米微球的制备方法为：将步骤四制备的PLGA-PEG-RGD溶于可以与水混溶的溶 剂，在超声作用下将该高分子溶液缓慢滴加入纯水溶液中，在室温下搅拌挥发导致纳 米颗粒的形成，再使用氢键凝聚沉降法得到絮状的纳米颗粒聚集物，使用过滤或离心 的方法收集，得到PLGA-PEG-RGD纳米颗粒。

实验证明，人工血小板PLGA-PEG-RGD纳米颗粒具有高效的止血效果，可以其为 活性成分制备静脉用全身性纳米止血药，该止血药可用于预防和治疗全身性出血，包 括创伤失血、脏器内出血、深部出血及手术出血等。

本发明所提供的静脉用全身性纳米止血药，需用生理盐水或PBS将PLGA-PEG-RGD 纳米颗粒分散后才可以进行静脉注射，用于预防和治疗全身性出血，所述静脉用全身 性纳米止血药的制备，包括将纳米颗粒分散的过程：用生理盐水(0.9％NaCl溶液) 或0.1M PBS(配方：1.75mM KH2PO4，Na2HPO4，10.06mM NaCl，2.68mM KCl，pH7.2-7.4) 悬浮PLGA-PEG-RGD纳米颗粒(5-25mg/mL，优选为20mg/mL)，并超声分散(200-300 瓦、60-120min，优选为250瓦、60min)，得到纳米颗粒分散液。

可通过静脉注射的方式将得到的PLGA-PEG-RGD纳米颗粒分散液用于预防和治疗 全身性出血，注射量一般为30-50mg/kg。

所述PLGA-PEG-RGD纳米颗粒或包装好纳米颗粒分散液的也可作为静脉用全身性 纳米止血药配备在急救包里，用于急救或装备部队。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular  Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V) 百分比浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以 达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生 物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照 实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、制备LGA-PEG负载RGD三肽的人工血小板PLGA-PEG-RGD

本实施例详细描述制备LGA-PEG负载RGD三肽的人工血小板PLGA-PEG-RGD的过 程：

步骤一：PLGA-NHS的合成

根据以下化学方程式，将端羧基的PLGA(Resomer503H)和NHS合成活化酯 PLGA-NHS，具体合成方法为：在氮气保护下，将PLGA(Resomer503H，x＝272，y＝272) 3g溶于10mL的无水二氯甲烷，再加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺) 76μL(4.3equiv)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)46mg(4equiv)，室温搅拌6小时， 将反应液浓缩至2-3mL，加入乙醚沉降，静置，过滤，得到白色粗产品，粗产品用二 氯甲烷-乙醚沉降3次，真空干燥，得到2.6克白色固体；

步骤二：PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的合成

将活化酯PLGA-NHS和异官能团修饰的聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH)通过酰胺键连接 得到端羧基的PLGA-PEG的嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH，具体合成方法为：在氮气保护 下，将PLGA-NHS1.5g溶于6mL的无水氯仿，再加入NH₂-PEG-COOH(n＝72，分子量3400) 的200mg(1.3equiv)和N，N’-二异丙基乙胺30μL(4equiv)，室温搅拌48小时， 将反应液浓缩至2-3mL，加入冻甲醇沉降，静置，过滤得到白色粗产品，将粗产品用 氯仿-甲醇沉降3次，真空干燥，得到1克白色固体；

步骤三：PLGA-PEG-NHS的合成

根据以下化学方程式，将PLGA-PEG嵌段共聚物PLGA-PEG-COOH的端羧基在EDC 作用下与NHS反应得到相应的活化酯PLGA-PEG-NHS，具体合成方法为：在氮气保护下， 将PLGA-PEG-COOH1g溶于10mL的无水二氯甲烷，再加入EDC26μL(5equiv)和NHS 12mg(4equiv)，室温搅拌6小时，将反应液浓缩至2-3mL，加入乙醚沉降，静置， 过滤得到白色粗产品，将粗产品用二氯甲烷-乙醚沉降3次，真空干燥，得到0.7克 白色固体；

步骤四：PLGA-PEG-RGD的合成

根据以下化学方程式，将活化酯PLGA-PEG-NHS与RGD三肽(精氨酰-甘氨酰-天 冬氨酸，Arg-Gly-Asp)的端氨基在碱性条件下对接得到PLGA-PEG-RGD，具体合成方 法为：在氮气保护下，将PLGA-PEG-NHS0.5g溶于6mL的无水DMF(N，N-二甲基甲酰 胺)，再加入RGD20mg(4equiv)和N，N’-二异丙基乙胺22μL(9equiv)，室温搅拌 48小时，将反应液装入透析袋，用蒸馏水进行透析12h，将透析袋中的液体冷冻干燥， 得到白色固体0.38g；

步骤五：纳米颗粒(或纳米微球)的制备和收集

将50mg PLGA-PEG-RGD溶于5mL乙腈，然后缓慢滴加到50mL的蒸馏水中，边滴 加边超声分散(功率是250瓦)，滴加完后，继续搅拌3h，再滴加聚丙烯酸溶液 (1g/100ml)，有絮状沉淀析出(纳米颗粒聚集物)，静置，离心，固体再用蒸馏水洗 涤三次纳米颗粒聚集物；用该纳米颗粒聚集物配制溶度为5-25mg/mL(优选为10mg/mL) 的水溶液，用液氮快速冷冻，冷冻干燥得到粉状纳米颗粒。

经核磁和元素分析检测，确证用上述方法制备步骤四得到的白色固体是PLGA-PEG 嵌段共聚物负载RGD三肽的高分子聚合物，其由高分子聚合物聚乳酸-羟基乙酸(PLGA) 连接聚乙二醇(PEG)，再连接RGD氨基酸(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)。 其分子结构式为：

另外，依据上述操作，改变原料PLGA中x和y的取值，PEG中n的取值，同样可 以得到PLGA-PEG-RGD白色固体和人工血小板PLGA-PEG-RGD纳米颗粒。经验证，代表 PLGA中乳酸个数的x＝233-400，代表PLGA中羟基乙酸个数的y＝233-400，代表聚乙二 醇的(CH2-CH2-O)片段个数的n＝20-134。因此，本发明一类人工血小板PLGA-PEG-RGD 的通用结构如式I所示：

   (式I)

实施例2、PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的表征

将实施例1得到纳米颗粒悬浮在PBS缓冲溶液(浓度为5-25mg/mL，优选为20mg/mL) 中，通过超声分散(功率是250瓦)，重新得到纳米微球溶液用于检测。

通过动态光散射测定该PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的有效直径，通过扫描电镜观察 纳米颗粒的形貌。使用乙腈时，在超声破碎器的超声作用下，得到的是纳米级的颗粒。 动态光散射(DLS)的测试结果如图1(横坐标表示获得的PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的直 径，纵坐标表示检测的数量)所示，有效粒径是91.3nm，证实PLGA-PEG-RGD纳米颗 粒的大小是纳米级的；PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的扫描电镜照片如图2所示，由于纳米 颗粒的范围一般在1-100nm，从而进一步证实PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的大小是纳米级 的。

实施例3、PLGA-PEG-RGD纳米微球颗粒的体外凝血功能检测

血栓弹力图(thrombelastography，TEG)是针对全血标本的凝血分析仪，作为一 种测定凝血功能的检测方法，观察血液凝固过程的动态变化，包括凝血因子、血小板、 纤维蛋白以及纤维蛋白溶解的整个过程。通过测量各阶段的凝血情况可以分析出凝血 系统是否平衡。TEG中的R值即凝血反应时间，指血样开始运作至第一块可检测得到 的血凝块形成所需的时间，即纤维蛋白开始形成的时间。抽取健康志愿者的静脉血 (3.8％柠檬酸钠新鲜抗凝血)10mL，做TEG血栓弹力图(美国Haemoscope公司)。 分别设PBS对照组，RGD多肽组(0.1、0.2、2.0mg/mL)，PLGA-PEG-RGD组(纳米颗 粒分散液，分2.5mg/mL、5mg/mL两组)。

TEG的检测结果如图3所示，代表性的某一人份的TEG结果如图4所示，图4中， A)PBS对照组；B)PLGA-PEG-RGD组。PBS对照组、RGD多肽和PLGA-PEG-RGD纳米颗 粒的血栓弹力图结果(TEG)统计表如表1所示，可以看出，PLGA-PEG-RGD的凝血时间 是4.6分钟，小于5-10分钟的标准；血块形成速率是2.2分钟，在1-3分钟标准之 间；α角为60.3度，在53-72度之间；最大血块厚度是54mm，在50-70mm之间； LY30和EPL未能检测到；与PBS对照组和RGD(2mg/mL)相比，本发明合成的 PLGA-PEG-RGD(5mg/mL)组可以明显的缩短凝血时间，促进凝血，证明本发明合成的 PLGA-PEG-RGD具有促进凝血的效果。

表1PBS对照组、RGD多肽组、PLGA-PEG-RGD纳米颗粒组的血栓弹力图结果(TEG)统 计表

实施例4、纳米止血药的制备，PLGA-PEG-RGD纳米颗粒的体内凝血能力的检测

本发明的静脉用全身性纳米止血药，需用生理盐水或PBS将PLGA-PEG-RGD纳米 颗粒分散后才可以进行静脉注射，所述静脉用全身性纳米止血药的制备方法，可包括 以下步骤：

1)按实施例1中的方法制备PLGA-PEG-RGD纳米颗粒；

2)纳米微球的分散：用生理盐水(0.9％NaCl溶液)或PBS(配方：1.75mM KH₂PO₄， Na₂HPO₄，10.06mM NaCl，2.68mM KCl，pH7.2-7.4)悬浮纳米颗粒(5-25mg/mL，优 选为20mg/mL)，并超声分散(200-300瓦、60-120min，优选为250瓦、60min)， 得到纳米颗粒分散液。

用下述方法检测PLGA-PEG-RGD纳米微球颗粒的体内凝血能力：SD大鼠(雄性， 200g左右)，戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)。剖腹，切去肝中叶50％左右，造肝脏内 出血模型。分PBS对照组、RGD试验组(500μl/只，0.2mg/mL)、PLGA-PEG-RGD实 验组(500μl/只，5mg/mL)，尾静脉给药。

大鼠肝损伤静脉给药后，出血伤口的切面如图5(箭头为血块形成处)所示，可 以看出，PBS对照组的肝中叶切口表面光滑，未见有凝块形成，而在RGD和 PLGA-PEG-RGD实验组的切口处均有凝块形成，以减少出血，并且PLGA-PEG-RGD纳米 颗粒实验组形成的血凝块更多更大，更好的起到了凝血作用。而且与对照组相比，给 药组的血压在失血后1-2min很快升高到正常水平(如图6所示)。由上述结果可以 看出，本发明的PLGA-PEG负载RGD三肽的PLGA-PEG-RGD纳米颗粒具有高效的止血效 果，可以用作静脉用全身性纳米止血药。