蟾毒灵糖基化衍生物及其制法和在制备抗肿瘤药物中的用途

摘要

本发明公开了蟾毒灵糖基化衍生物及其制法和在制备抗肿瘤药物中的用途，蟾毒灵糖基化衍生物其结构如式I或式II所示，其合成方法是：用氯铬酸吡啶盐酸盐先将蟾毒灵氧化为酮式衍生物，再与甲氧胺盐酸盐进行亲核加成反应后，脱去一分子水生成肟式中间体，将肟式中间体与叔丁胺基甲硼烷盐酸盐复合物反应生成α和β两种构型的苷元，最后将这两种构型的苷元分别与还原糖反应生成蟾毒灵糖基化衍生物。本发明通过将蟾毒灵修饰为其糖基化衍生物，在保持、增强了抗肿瘤活性的同时还能增加水溶性。并且经体外实验证明，本发明所提供的蟾毒灵糖基化衍生物与其母体化合物蟾毒灵相比，降低了对正常细胞的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及蟾毒灵糖基化衍生物及其制法和在制 备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤一直是危害人类健康的重大疾病。据WHO统计，全世界每年的恶 性肿瘤新增病例约1000万，死亡约800万例。在我国，恶性肿瘤逐渐占到城市 居民死亡率的第一位。目前，恶性肿瘤的主要治疗方法包括手术、放疗和化疗。 其中化疗仍发挥着重要的作用，但临床上使用的大部分化疗药物多具有毒性大， 安全性低及易产生耐药性等缺点。研究高效低毒的抗肿瘤药物一直是全世界医 药界的热点。

天然产物是抗肿瘤药物的重要源泉。紫杉醇、长春碱、喜树碱等抗肿瘤药 物均来自天然产物。另外，一些天然产物毒性大，水溶性差，但经过结构修饰 后，也成为临床使用的抗肿瘤药物，例如依托泊苷和替尼泊苷。因此对天然有 效成分进行结构改造也是抗肿瘤药物研发的重要途径。

蟾酥为中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo  melanostictus Schneider）耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆汁加工而成（《中国药 典》）。蟾酥中含有乙型强心甾。这类成分不但具有很好的强心活性，也具有很 强的抗肿瘤活性。蟾毒灵为蟾酥中的主要活性成分。据报道，蟾毒灵对人白血 病细胞HL60、人胃癌细胞MGc-803、人肝癌细胞SMMC7721等具有抑制其增 殖及诱导其凋亡的作用[田昕，罗颖，刘云鹏，等.蟾毒灵诱导HL-60细胞凋亡 过程中对Bcl-2、Survivin、Smac/DIABLO表达的影响.中华血液学杂志，2006， (01)：21-24；陈小义，徐瑞成，陈莉，等.蟾毒灵对人胃癌细胞系MGc-803的 细胞毒作用.中草药，2000，(12)：920-922；陈小义，呼文亮，徐瑞成，等.蟾 毒灵对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒作用及生长相关基因表达的影响.中国药 理学与毒理学杂志，2001，(04)：293-296.]。作用机制研究表明，蟾毒灵的抗肿 瘤作用可能与其影响凋亡相关的基因（bcl-2、c-myc和Tiam1）有关（Y.Masuda, N et al.Leuk.Res.1995,19,549–556;K.Nobuko,et al.Oncogene1999,18： 2413–2421.）。

虽然蟾毒灵具有显著的抗肿瘤作用，但其对肿瘤细胞和正常细胞的毒性相 当，无选择性，并且其水溶性差。

发明内容

为了克服蟾毒灵选择性差（对肿瘤细胞和正常细胞的毒性相当）和水溶性 差的缺陷，本发明的首要目的是在蟾毒灵的3-位引入取代糖基，提供一种具有 抗肿瘤活性的蟾毒灵糖基化衍生物。本发明的蟾毒灵糖基化衍生物显著提高了 水溶性，同时仍然具有很强的抗肿瘤活性，并且对正常细胞的毒性明显降低。

本发明的另一目的在于提供上述的蟾毒灵糖基化衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述的蟾毒灵糖基化衍生物在制备抗肿瘤药物 中的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种蟾毒灵糖基化衍生物，其结构如式I或式II所示：

其中R为还原糖糖基，优选为D-葡糖糖（D-Glu）、L-葡糖糖（L-Glu）、岩 藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、来苏糖（Lxy）或阿拉伯糖基（Ara）。

上述的蟾毒灵糖基化衍生物的合成方法，包括以下步骤：

（1）将蟾毒灵与氧化剂以摩尔比1:2混合，溶于有机溶剂中，室温下反应 后，硅胶柱色谱分离，得到蟾毒灵3位氧化的中间体Bufalinone；

（2）将氧化产物Bufalinone与有机胺盐酸盐以摩尔比1:2.5混合，溶于有 机溶剂中，加入碱性试剂，室温条件下反应，得到肟式中间体；

（3）在肟式中间体中加入3倍肟式中间体摩尔量的还原剂，然后用有机溶 剂溶解，冰水浴条件下反应，硅胶柱色谱分离，得到蟾毒灵3位α和β两种构型 的苷元异构体；

（4）分别将步骤（3）得到的两种苷元异构体与还原糖置于有机溶剂中反 应，经高效液相分离得到如式I或式II所示结构的蟾毒灵糖基化衍生物；

步骤（1）所述的氧化剂优选氯铬酸吡啶盐酸盐（PCC），有机溶剂优选 CH₂Cl₂，反应时间优选2.5h；

步骤（1）所述的硅胶柱色谱分离，是用体积比1:1的环己烷/乙酸乙酯混合 溶液梯度洗脱；

步骤（2）所述的有机胺盐酸盐优选甲氧胺盐酸盐，有机溶剂为甲醇，碱性 试剂为吡啶，反应时间为2.5-3h；

步骤（3）所述的还原剂优选叔丁胺基甲硼烷盐酸盐复合物，有机溶剂为体 积比为2:1的二氧六环/乙醇混合液，反应时间3.5h；

步骤（3）所述的硅胶柱色谱分离，是用体积比4:1的环己烷/乙酸乙酯混合 溶液梯度洗脱；

步骤（4）所述的还原糖是葡萄糖、岩藻糖、木糖、来苏糖或阿拉伯糖；

步骤（4）所述的有机溶剂是体积比为3:1的二甲基甲酰胺/乙醇混合液，反 应时间为48h；

步骤（4）所述的高效液相分离，具体是：高效液相色谱柱（waters，C18， 5μm，20×250mm），流速8ml/min，检测波长296nm，流动相45%的乙腈-水。

本制备方法中所得的化合物，通过紫外光谱，红外光谱，质谱和核磁共振方 法进行结构鉴定，并用HPLC法进行纯度检测。

本发明的蟾毒灵糖基化衍生物及其药物上可接受的成盐化产物可与药用常 见辅料和载体结合，制备抗肿瘤药物的组合物，从而达到预防或治疗的效果。 上述药物可根据实际的需要选择合适的剂型，如片剂、注射剂、栓剂、气雾剂、 纳米制剂等。

本发明蟾毒灵糖基化衍生物及其药物上可接受的成盐化产物制备成的药物 组合物，可用于治疗多种肿瘤，包括：前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、 结肠癌、宫颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、口腔癌或白血病。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明通过将蟾毒灵修饰为其糖基化衍生物，在保持、增强了抗肿瘤 活性的同时还能增加水溶性。并且经体外实验证明，本发明所提供的蟾毒灵糖 基化衍生物与其母体化合物蟾毒灵相比，降低了对正常细胞的毒副作用。

（2）本发明蟾毒灵糖基化衍生物的结构新颖，对肿瘤细胞具有良好的抑制 效果，水溶性好，毒副作用低，具备较高的开发价值。

（3）本发明的合成方法安全性好，产率高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此。

实施例1

蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）取bufalin（4.13g，0.0107mol）置于50ml圆底烧瓶中，加入CH₂Cl₂（35ml）搅拌至完全溶解，缓慢加入PCC（氯铬酸吡啶盐酸盐）(4.60g,0.0214 mol)，室温下匀速搅拌2.5h。将混合物过滤，滤液减压浓缩。通过硅胶柱层析 （体积比1:1的环己烷/乙酸乙酯混合液）得反应产物Bufalinone（3.9g，0.0102 mol，产率95%）。

对步骤（1）中得到的产物进行结构分析。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.35环己烷/乙酸乙酯1：1）。

波谱信息：ESI-MS m/z：385.5[M+H]⁺，407.4[M+Na]⁺，791.4[2M+H]⁺，823.3 [2M+Na]⁺。¹H NMR（CDCl₃，300MHz）δ7.83（1H，dd，J=9.7，2.6Hz,H-22）， 7.22（1H，d，J=2.6Hz，H-21），6.23（1H，d，J=9.7Hz,H-23），2.62（1H， t，J=14.2Hz,H-4a,2.46（1H，dd，J=9.4,6.1Hz,H-17），2.33（m，1H），2.19 （m，2H），2.19-1.20（m，19H），0.983（s，3H），0.703（s，3H）。¹³C（CDCl₃， 75MHz）δ212.9，162.5，148.6，146.9，122.7，115.3，85.0，51.2，48.4，43.7， 42.15，42.13，40.7，37.1，36.8，36.7，35.2，32.7，28.7，26.6，22.6，21.5， 21.0，16.6。

根据以上波谱信息，鉴定化合物Bufalinone化学式为C₂₄H₃₂O₄，其结构如下 式所示。

（2）取Bufalinone（3.9g，0.0102mol）置于50ml圆底烧瓶中，加入28ml CH₃OH超声至全部溶解，加入吡啶（4.88ml），甲氧胺盐酸盐（2.56g，0.0306mol）， 室温搅拌2.5-3h。将混合物减压浓缩蒸干溶剂，用1mol/l的HCl水溶液洗涤后， 再用饱和食盐水洗，CH₂Cl₂萃取（4×15ml），MgSO₄干燥，减压浓缩有机层， 得肟式异构体混合物Bufalinone oximes（3.78g，0.009mol，产率90%）。取部 分肟式异构体混合物进行分离，得肟式异构体纯品IIa和IIb。

对（2）中得到的肟式异构体混合物进行结构鉴定。

化合物IIa的理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.57环己烷/乙酸乙酯1:1）。

波谱信息：ESI-MS414.4[M+H]⁺，436.4[M+Na]⁺，849.3[2M+Na]⁺。¹H NMR （CDCl₃，300MHz）δ7.83（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.21（1H，d，J=2.5Hz）， 6.23（1H，d，J=9.7Hz），3.77（s，3H），2.44（m，1H），2.00，1.68（m，2H）， 2.18，1.76（m，2H），2.12，1.84（m，2H），1.51，1.24（m，2H），1.68（m， H），1.50（m，H），0.91（s，3H），0.68（s，3H）。¹³C NMR（CDCl₃，75MHz） δ162.6，160.5，148.6，147.0，122.8，115.3，85.2，61.1，51.2，48.5，43.5，42.2， 40.8，36.3，35.8，35.7，32.7，32.0，28.8，26.5，22.9，21.4，21.2，20.5，16.6。

根据以上质谱、一维波谱数据及二维谱信息，鉴定化合物IIa化学式为 C₂₅H₃₅NO₄，其结构如下式所示。

化合物IIb的理化性质：白色粉末（TLC Rf=0.63环己烷/乙酸乙酯1：1）。

波谱信息：ESI-MS414.5[M+H]⁺，436.3[M+Na]⁺，849.5[2M+Na]⁺。¹H NMR （CDCl₃，300MHz）δ7.77（1H，dd，J=9.7，2.6Hz），7.15（1H，d，J=2.6Hz）， 6.17（1H，d，J=9.7Hz），3.73（s，3H），2.03，1.70（m，2H），2.19，1.74（m， 2H），2.15，1.85（m，2H），1.89，1.23（m，2H），1.55，1.25（m，2H），2.46 （m，H），1.65（m，H），1.54（m，H），0.87（s，3H），0.62（s，3H）。¹³C NMR （CDCl₃，75MHz）δ162.4，160.5，148.4，146.8，122.7，115.1，85.0，60.9， 51.0，48.2，42.1，41.6，40.5，36.6，36.5，35.4，32.6，28.6，26.7，26.4，25.4， 22.9，21.3，20.9，16.4。

根据以上质谱、一维波谱数据及二维谱信息，鉴定化合物Bufalinone oxime  IIb化学式为C₂₅H₃₅NO₄，其结构如下式所示。

可见，IIa与IIb为碳氮双键的构型异构体。

（3）取肟式混合物Bufalinone oximes（400mg，0.969mmol）置于35ml 高压反应管中，加入二氧六环3ml，无水乙醇1.5ml，超声至样品完全溶解。冰 浴冷却20min至0℃后，置于冰水浴中，向反应管中加入叔丁胺基甲硼烷盐酸 盐复合物（261.0mg，3.0mmol），再缓慢逐滴加入10%HCl水溶液（2.61ml）， 匀速搅拌3.5h后，加入NaCO₃终止反应，CH₂Cl₂萃取（4×15ml），MgSO₄干燥 有机层，减压浓缩，得苷元3a，3b混合物。通过硅胶柱层析，用体积比4:1的 环己烷/乙酸乙酯混合液梯度洗脱，得到苷元III（88.5mg，0.213mmol，产率 22%），最后用乙酸乙酯洗脱，得到苷元IV（175mg，0.426mmol，产率43%）。

对（3）中得到的产物III进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.35环己烷/乙酸乙酯1:1）。

波谱数据：ESI-MS416.4[M+H]⁺，438.4[M+Na]⁺，831.4[2M+H]⁺，853.3 [2M+Na]⁺。¹H NMR（CDCl₃，300MHz）δ7.84（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.21 （1H，d，J=2.5Hz），6.24（1H，d，J=9.7Hz），3.53（s，3H），3.24（s，1H）， 2.46（m，1H），2.17,1.70（m，2H），2.04，1.67（m，2H），1.44，1.33（m，2H）， 1.38，1.23（m，2H），1.45，1.35（m，2H），1.69，1.15（m，2H），1.86，1.27 （m，2H），1.81，1.23（m，2H），1.84，1.35（m，2H），1.62（m，1H），1.51 （m，1H），1.43（m，1H），0.90（s，3H），0.67（s，3H）。¹³C NMR（CDCl₃， 75MHz）δ162.3，148.4，146.8，122.7，115.1，85.3，62.3，54.9，51.1，48.2， 42.3，40.8，36.5，35.7，35.4，32.7，30.2，28.6，28.5，26.5，23.7，22.7，21.2， 21.1，16.4。

根据以上波谱信息，鉴定化合物III化学式为C₂₅H₃₇NO₄，其结构如下式所 示。

对（3）中得到的产物IV进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.25环己烷/乙酸乙酯1：1）。

波谱性质：ESI-MS416.3[M+H]⁺，438.3[M+Na]⁺，831.5[2M+H]⁺， 853.4[2M+Na]⁺。¹H NMR（CDCl₃，300MHz）δ7.83（1H，dd，J=9.7，2.5Hz）， 7.21（1H，d，J=2.5Hz），6.24（1H，d，J=9.7Hz），3.54（s，3H），2.90（s， 1H），2.43（m，1H），2.17,1.71（m，2H），2.06，1.66（m，2H），1.80，1.02 （m，2H），1.83，1.36（m，2H），1.47，1.31（m，2H），1.71，1.27（m，2H）， 1.60，1.17（m，2H），1.54，1.45（m，2H），1.38，1.16（m，2H），1.63（m， 1H），1.51（m，1H），1.40（m，1H），0.91（s，3H），0.67（s，3H）。¹³C NMR （CDCl₃，75MHz）δ162.4，148.4，146.8，122.7，115.2，85.3，62.6，60.3，51.1， 48.2，42.5，41.4，40.8，36.4，35.4，35.1，32.7，31.0，28.6，27.1，25.3，23.4， 21.5，21.1，16.4。

根据以上波谱信息，鉴定化合物IV化学式为C₂₅H₃₇NO₄，其结构如下式所 示。

（4）取苷元III（45mg，0.108mmol），D-(+)-葡萄糖（39.0mg，0.217mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3:1(1204μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应 后混合物经减压浓缩除去反应溶剂，将残余物溶于甲醇中，选用制备型高效液 相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min， 检测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=15.02min， 得到糖基化产物苷1a（26mg，0.045mmol，产率42%）。

对（4）中得到的糖基化产物1a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.59环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱性质：ESI-MS m/z：578.5[M+H]⁺，600.5[M+Na]⁺，1177.5[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，300MHz）δ8.23（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.48（1H，d， J=2.5Hz），6.32（1H，d，J=9.7Hz），4.69（1H，d，J=8.7Hz），4.47（m，1H）， 4.26（m，1H），4.25（m，1H），3.89（m，1H），4.54，4.36（m，2H），3.96（s， 3H），2.20，1.85（m，2H），2.02，1.86（m，2H），2.00，1.58（m，2H），1.43， 1.33（m，2H），1.35，1.13（m，2H），1.63，1.07（m，2H），3.87（m，1H）， 2.49（m，1H），2.02（m，2H），1.87（m，2H），0.87（s，3H），0.82（s，3H）。 ¹³C NMR（Pyridine-d₅，75MHz）δ162.1，149.2，147.5，123.9，115.1，91.4，84.2， 80.5，80.3，71.7，71.3，63.8，62.9，62.2，51.3，48.7，42.3，42.0，40.7，36.5， 35.9，35.3，32.9，32.1，29.4，27.8，25.2，23.6，22.4，21.5，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物苷元1a化学式为 C₃₁H₄₇NO₉，结构如下式所示，是蟾毒灵-3β-N-D-葡萄糖苷：

（5）取苷元IV（50mg，0.125mmol），D-(+)-Glucose（43.4mg，0.241mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3:1(1339μl)，于40℃匀速搅拌48h。将反 应后混合物减压浓缩除去反应溶剂后，将残余物溶于甲醇中，通过制备型高效 液相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min， 检测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=17.38min， 得糖基化产物苷1b（35mg，0.061mmol，产率48%）。

对（4）中得到的糖基化产物1b进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.48环己烷/乙酸乙酯3:7）。

波谱数据：ESI-MS m/z578.4[M+H]⁺，600.3[M+Na]⁺，1177.3[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，300MHz）δ8.33（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.56（1H， d，J=2.5Hz），6.44（1H，d，J=9.7Hz），4.90（1H，d，J=8.7Hz），4.57（m， 1H），4.39（m，1H），4.31（m，1H），3.98（m，1H），4.63，4.47（m，2H）， 4.06（s，3H），2.27，1.93（m，2H），1.90，1.60（m，2H），3.66（m，1H）， 2.58（m，1H），2.07（m，2H），2.26（m，2H），1.02（m，2H），0.97（s，3H）， 0.89（s，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅，75MHz）δ162.1，149.2，147.5，123.9， 115.1，91.4，84.2，80.5，80.3，71.7，71.3，63.8，62.9，62.2，51.3，48.7，42.3， 42.0，40.7，36.5，35.9，35.3，32.9，32.1，29.4，27.8，25.2，23.6，22.4，21.5， 17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物1b化学式为C₃₁H₄₇NO₉及结构如下式所示，是蟾毒灵-3α-N-D-葡萄糖苷。

蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷的抗肿瘤活性实验，包括以下项目：

（1）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对前列腺癌 细胞DU145（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的DU145细胞（RPMI1640，含有10%v/v胎牛血清），用质量 体积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液 100μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度的蟾毒灵-3-N-D- 葡萄糖苷，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml）,4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振 荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同 时作图并用SPASS13.0软件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

（2）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对前列腺癌 细胞PC3（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的PC3细胞（RPMI1640，含有10%v/v胎牛血清），用质量体 积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液100 μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖 苷，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μL MTT 溶液（5mg/ml）,4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振荡15min 左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并 用SPASS13.0软件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

（3）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对激素依赖 性前列腺癌细胞LNCaP（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的LNCaP细胞（DMEM，含有10%v/v胎牛血清），用质量体 积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液100 μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体 积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml）, 4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振荡15min左右，置酶标 仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPASS13.0软 件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

（4）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对乳腺癌细 胞MCF-7（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的MCF-7细胞（RPMI1640，含有10%v/v胎牛血清），用质量 体积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液 100μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度的蟾毒灵-3-N-D- 葡萄糖苷，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml）,4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振 荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同 时作图并用SPASS13.0软件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

（5）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对宫颈腺癌 细胞HeLa（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的HeLa细胞（RPMI1640，含有10%v/v胎牛血清），用质量体 积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液100 μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度的蟾毒灵-3-N-D-葡萄 糖苷，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μL MTT 溶液（5mg/ml）,4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振荡15min 左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并 用SPASS13.0软件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

（6）采用MTT法检测本实施例制得的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷对正常细胞 Vero（购自美国模式培养物保藏所ATCC）增殖的抑制作用。

取单层培养的Vero细胞（RPMI1640，含有10%v/v胎牛血清），用质量体 积比0.25%的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上（每空加入细胞悬浮液100 μL，细胞数为3000个）。接种24小时后，加入不同浓度的蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖 苷，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μL MTT 溶液（5mg/ml）,4小时后离心弃上清液，加入DMSO（100μL/孔），振荡15min 左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并 用SPASS13.0软件求得半数抑制浓度（IC₅₀）。

采用上述方法比较了蟾毒灵-3β-N-D-葡萄糖苷(1a)和蟾毒灵-3α-N-D-葡萄糖 苷(1b)对肿瘤细胞DU145，PC3，LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑 制活性。其中糖基化产物1a对上述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为 0.48±0.13，0.32±0.12，0.51±0.09，0.71±0.12，0.90±0.14μM，而对正常细胞Vero 的IC₅₀值大于20μM。糖基化产物1b对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为 1.82±0.21，2.44±0.31，2.05±0.20，2.01±0.12，2.32±0.23μM。与1a相似，1b 对正常细胞Vero的IC₅₀值也大于20μM。蟾毒灵对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为 0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08，0.54±0.07μM，蟾毒灵对正常细 胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-3-N-D-葡萄糖苷油水分配系数测定实验

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-D-葡萄糖苷(1a)和蟾毒灵-3α-N-D-葡萄糖 苷(1b)的油水分配系数（logP），1a的logP为1.915，1b的logP为1.926，而相 同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，1a与1b的水溶性均较蟾毒灵好。

小结：从以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-D-葡萄糖苷(1a)的抗肿瘤活性与 蟾毒灵相似。而蟾毒灵-3α-N-D-葡萄糖苷(1b)的抗肿瘤活性弱于蟾毒灵，但两种 D-葡萄糖苷对正常细胞的毒性均较蟾毒灵低。并且1a与1b的水溶性均较蟾毒 灵好。

实施例2

蟾毒灵-L-葡萄糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中制备苷元方法。

（4）取苷元III（46mg，0.108mmol），L-葡萄糖（39.0mg，0.217mmol）加 入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1204μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应后 混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液相 色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检测 波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=16.02min，得到糖 基化产物苷2a（26mg，0.045mmol，产率42%）。

对（4）中得到的糖基化产物2a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.61环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱性质：ESI-MS m/z：578.4[M+H]⁺，600.5[M+Na]⁺，1177.2[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.25（1H，dd，J=9.6，2.4Hz），7.48（1H，d， J=2.4Hz），6.35（1H，d，J=9.6Hz），4.72（1H，d，J=8.6Hz），4.46（m，1H）， 4.28（m，1H），4.22（m，1H），3.88（m，1H），4.55，4.35（m，2H），3.94（s， 3H），3.83（m，1H），2.50（m，1H），2.18，1.87（m，2H），2.16，1.45（m， 2H），1.79，1.33（m，2H），1.69，1.51（m，2H），1.28，1.09（m，2H），2.19 （m，1H），1.87（m，1H），1.73（m，1H），1.75（m，1H），1.42（m，1H）， 0.89（s，3H），0.81（s，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅，100MHz）δ162.1，149.2， 147.5，123.8，115.1，90.9，84.3，80.5，80.2，71.7，71.6，63.6，62.9，57.1， 51.4，48.8，42.2，40.8，37.0，36.5，35.8，32.8，31.0，29.5，29.4，27.2，23.9， 23.7，22.1，21.6，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物2a为蟾毒灵-3α-N-L- 葡萄糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₉，结构如下式所示。

（5）取苷元IV（50mg，0.125mmol），L-(-)-Glucose（43.4mg，0.241mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1.3ml)，于40℃匀速搅拌48h。将反 应后混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂后，样品溶于甲醇中，通过制备型高效 液相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min， 检测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=13.29min，得 糖基化产物苷2b（35mg，0.061mmol，产率48%）。

对（5）中得到的糖基化产物2b进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.44环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱数据：ESI-MS m/z578.3[M+H]⁺，600.3[M+Na]⁺，1177.0[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.24（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.47（1H，d， J=2.5Hz），6.35（1H，d，J=9.7Hz），4.88（1H，d，J=8.8Hz），4.53（m，1H）， 4.38（m，1H），4.28（m，1H），3.61（m，1H），4.49，4.25（m，2H），3.98（s， 3H），2.16，1.85（m，2H），2.15-0.90（m，19H），0.89（s，3H），0.81（s，3H）。 ¹³C NMR（Pyridine-d₅，100MHz）δ162.1，149.2，147.5，123.9，115.1，91.1， 84.2，80.5，80.3，71.7，71.4，63.8，62.9，62.0，51.4，48.7，42.3，42.1，40.8， 36.5，35.6，35.2，32.8，30.9，29.4，27.8，26.4，23.6，22.2，21.5，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物2b为蟾毒灵-3α-N-L- 葡萄糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₉，结构如下式所示。

蟾毒灵-L-葡萄糖苷的抗肿瘤活性实验，包括以下步骤：

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物2a和2b对肿瘤细胞DU145， PC3，LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。其中糖基化产物糖 基化产物2a对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.16±0.05，0.49±0.12，0.42±0.09， 0.59±0.14，0.88±0.14μM。而对2a对正常细胞Vero的IC₅₀值为11.7±1.3μM。 2b对上述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为1.47±0.11，2.46±0.103， 1.15±0.40，1.66±0.32，2.43±0.13μM。而2b对正常细胞Vero的IC₅₀值大于20μM。 蟾毒灵对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08， 0.54±0.07μM。蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-L-葡萄糖苷油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-L-葡萄糖苷(2a)和蟾毒灵-3α-N-L-葡萄糖 苷(2b)的油水分配系数（logP），2a的logP为1.896，2b的logP为1.913，而相 同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，2a与2b的水溶性均较蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-L-葡萄糖苷(2a)的抗肿瘤活性与 蟾毒灵相似，而蟾毒灵-3α-N-L-葡萄糖苷(2b)的抗肿瘤活性弱于蟾毒灵。但两种 L-葡萄糖苷对正常细胞的毒性均较蟾毒灵低。并且2a与2b的水溶性均较蟾毒 灵好。

实施例3

蟾毒灵-D-岩藻糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中的步骤。

（4）取苷元III（42mg，0.101mmol），D-岩藻糖（33.6mg，0.205mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3:1(1122μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应后 混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液相 色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检 测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=11.57min，得 到糖基化产物苷3a（22mg，0.039mmol，产率39%）。

对（4）中得到的糖基化产物3a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.52环己烷/乙酸乙酯3：7）

波谱性质：ESI-MS m/z：562.4[M+H]⁺，584.4[M+Na]⁺，1145.3[2M+Na]⁺。 ¹H（Pyridine-d₅，300MHz）δ8.25（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.48（1H，d，J= 2.5Hz），6.35（1H，d，J=9.7Hz），4.51（1H，d，J=8.7Hz），4.69（m，1H）， 4.15（m，1H），4.10（m，1H），3.83（m，1H），3.88（s，3H），2.19，1.89（m， 2H），2.14，1.56（m，2H），2.13，1.75（m，2H），1.67，1.26（m，2H），1.43， 1.13（m，2H），3.80（m，1H），2.51（m，1H），1.83（m，1H），2.28（m，2H）， 1.91（m，2H），1.78（m，1H），1.45（m，2H），1.59（d，3H，J=6.4Hz），0.89 （s，3H），0.84（s，3H）。¹³C（Pyridine-d₅，75MHz）δ162.1，149.2，147.5， 123.9，115.1，91.4，84.3，77.1，73.1，72.8，68.3，63.3，57.2，51.4，48.8， 42.3，40.8，37.1，36.3，35.9，32.8，31.1，30.0，29.4，27.6，24.0，23.9，21.8， 21.7，17.4，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物苷元3a化学式为 C₃₁H₄₇NO₈，结构如下式所示。

（5）取苷元IV（51mg，0.125mmol），D-(+)-Fucose（38.2mg，0.233mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1300μl)，于40℃匀速搅拌48h。将反 应后混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂后，样品溶于甲醇中，通过制备型高效 液相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min， 检测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=13.81min， 得糖基化产物苷3b（35mg，0.062mmol，产率49%）。

对（5）中得到的糖基化产物3b进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.42环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱数据：ESI-MS m/z562.3[M+H]⁺，584.3[M+Na]⁺，1145.3[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.23（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.47（1H，d， J=2.5Hz），6.36（1H，d，J=9.7Hz），4.62（1H，d，J=8.7Hz），4.73（m，1H）， 4.15（m，1H），4.10（m，1H），3.87（s，3H），3.68（m，1H），2.51（m，1H）， 2.20，1.89（m，2H），2.20-0.90（m，19H）,1.58（d，3H，J=6.3Hz），0.90（s， 3H），0.86（s，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅，100MHz）δ162.1，149.2，147.5， 123.9，115.2，91.9，84.2，77.2，73.1，72.8，68.5，63.5，62.2，51.3，48.7， 42.4，40.8，36.58，36.52，35.2，32.9，32.2，31.4，29.4，27.7，25.3，23.6， 22.3，21.5，17.5，17.2。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物3b为蟾毒灵-3α-N-D- 岩藻糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₈，结构如下式所示。

蟾毒灵-D-岩藻糖苷的抗肿瘤活性实验

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物3a和3b对肿瘤细胞DU145， PC3，LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。其中糖基化产物3a 对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.55±0.02，0.25±0.05，0.36±0.09，0.39±0.10， 0.85±0.12μM。而对3a对正常细胞Vero的IC₅₀值大于20μM。糖基化产物3b 对上述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为2.01±0.13，4.68±0.24，1.58±0.21， 2.06±0.10，3.32±0.34μM。而3b对正常细胞Vero的IC₅₀值大于20μM。蟾毒灵 对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08， 0.54±0.07μM。蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-D-岩藻糖苷的油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-D-岩藻糖苷(3a)和蟾毒灵-3α-N-D-岩藻糖 苷(3b)的油水分配系数（logP），3a的logP为2.902，3b的logP为2.918，而相 同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，3a与3b的水溶性均较蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-D-岩藻糖苷(3a)的抗肿瘤活性与 蟾毒灵相当，而蟾毒灵-3α-N-D-岩藻糖苷(3b)的抗肿瘤活性弱于蟾毒灵。但两种 D-岩藻糖苷对正常细胞的毒性均较蟾毒灵低。并且，3a与3b的水溶性均较蟾毒 灵好。

实施例4

蟾毒灵-L-岩藻糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中制备苷元方法。

（4）取苷元III（45mg，0.108mmol），L-岩藻糖（35.6mg，0.217mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3:1(1204μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应 后混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液 相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检 测波长296nm，用45%的乙腈水溶液作为流动相，保留时间t_R=16.52min，得 到糖基化产物苷4a（27mg，0.048mmol，产率45%）。

对（4）中得到的糖基化产物4a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.60环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱数据：ESI-MS m/z：562.5[M+H]⁺，584.3[M+Na]⁺，1145.2[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.23（1H，dd，J=9.7，2.4Hz），7.47（1H， d，J=2.4Hz），6.34（1H，d，J=9.7Hz），4.49（1H，d，J=8.7Hz），4.66（m， 1H），4.11（m，1H），4.07（m，1H），3.72（m，1H），3.81（s，3H），2.17， 1.86（m，2H），2.11，1.88（m，2H），1.81，1.32（m，2H），1.45，1.38（m， 2H），1.37，1.14（m，2H），3.79（m，1H），2.50（m，1H），1.78（m，1H）， 2.16（m，2H），2.15（m，2H），1.98（m，2H），1.78（m，1H），1.65（m，2H）， 1.53（s，3H，J=6.3Hz），0.90（s，3H），0.84（m，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅， 100MHz）δ162.1，149.2，147.5，123.9，115.2，91.3，84.4，77.1，73.0，72.8， 68.7，63.3，57.1，51.4，48.8，42.3，40.9，37.1，36.6，35.9，32.9，31.2，29.6， 29.4，27.2，24.0，23.8，22.1，21.7，17.3，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物4a为蟾毒灵-3β-N-L- 岩藻糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₈，结构如下式所示。

（5）取苷元IV（45mg，0.108mmol），L-岩藻糖（38mg，0.232mmol）加 入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1205μl)，于40℃匀速搅拌48h。将反应 后混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂后，样品溶于甲醇中，通过制备型高效液 相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检 测波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=14.38min，得糖 基化产物苷4b（31mg，0.055mmol，产率51%）。

对（5）中得到的糖基化产物4b进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.47环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱数据：ESI-MS m/z562.2[M+H]⁺，584.2[M+Na]⁺，1145.1[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.23（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.47（1H，d， J=2.5Hz），6.36（1H，d，J=9.7Hz），4.63（1H，d，J=8.7Hz），4.71（m，1H）， 4.20（m，1H），4.10（m，1H），3.96（s，3H），3.67（m，1H），2.49（m，1H）， 2.19，1.87（m，2H），2.18-0.90（m，19H）,1.57（d，3H，J=6.4Hz），0.88（s， 3H），0.81（s，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅，100MHz）δ162.1，149.2，147.5， 123.9，115.2，91.9，84.2，77.2，73.1，72.8，68.5，63.5，62.2，51.3，48.7， 42.4，40.8，36.58，36.52，35.2，32.9，32.2，31.4，29.4，27.7，25.3，23.6， 22.3，21.5，17.5，17.2。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物4b为蟾毒灵-3α-N-L- 岩藻糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₈，结构如下式所示。

蟾毒灵-L-岩藻糖糖苷的抗肿瘤活性实验

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物4a和4b对肿瘤细胞DU145， PC3，LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。其中糖基化产物4a 对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.22±0.01，0.12±0.04，0.32±0.06，0.55±0.14， 0.45±0.10μM，而对4a对正常细胞Vero的IC₅₀值为10.8±1.2μM。糖基化产物 4b对上述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为1.46±0.04，2.07±0.53, 1.25±0.12，1.69±0.22,2.42±0.20μM，4b对正常细胞Vero的IC₅₀值大于20μM。 蟾毒灵对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08， 0.54±0.07μM。蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-L-岩藻糖糖苷油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-L-岩藻糖苷(4a)和蟾毒灵-3α-N-L-岩藻糖 苷(4b)的油水分配系数（logP），4a的logP为2.898，4b的logP为2.907，而相 同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，4a与4b的水溶性均较蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-L-岩藻糖苷(4a)的抗肿瘤活性与 蟾毒灵相似，而蟾毒灵-3α-N-D-岩藻糖苷(4b)的抗肿瘤活性弱于蟾毒灵。但两种 L-岩藻糖苷对正常细胞的毒性均较蟾毒灵低。并且，4a与4b的水溶性均较蟾毒 灵好。

实施例5

蟾毒灵-D-来苏糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中制备苷元方法。

（4）取苷元III（41mg，0.099mmol），D-来苏糖（28.9mg，0.217mmol）加 入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1098μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应后 混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液相 色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检测 波长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=11.65min，得到 糖基化产物苷5a（29mg，0.053mmol，产率54%）。

对（4）中得到的糖基化产物5a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.63环己烷/乙酸乙酯3：7）

波谱性质：ESI-MS m/z：548.1[M+H]⁺，570.3[M+Na]⁺，1117.2[2M+Na]⁺。 ¹H（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.25（1H，dd，J=9.9，2.8Hz），7.48（1H，d，J=2.8Hz）， 6.35（1H，d，J=9.9Hz），4.71（1H），4.81（m，1H），4.38（m，1H），4.21（m， 1H），4.40，3.64（m，2H），3.89（m，1H），3.92（s，3H），2.46（m，1H）， 2.16，1.83（m，2H），2.08，1.34（m，2H），1.80，1.35（m，2H），1.29，1.08 （m，2H），2.03（m，2H），1.77（m，1H），1.81（m，1H），1.49（m，2H）， 1.35（m，2H），0.89（s，3H），0.79（s，3H）。¹³C（Pyridine-d₅，100MHz）δ162.1， 149.2，147.5，123.0，115.1，84.3，82.6，73.2，71.3，67.8，63.3，61.8，57.2， 51.4，48.8，42.3，40.8，36.59，36.53，35.8，32.8，31.0，29.7，29.4，27.,2， 23.8，22.1，21.6，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物5a为蟾毒灵-3β-N-D- 来苏糖苷，其化学式为C₃₀H₄₅NO₈，结构如下式所示。

蟾毒灵-D-来苏糖苷的抗肿瘤活性实验

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物5a对肿瘤细胞DU145，PC3， LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。其中糖基化产物5a对上 述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.75±0.10，0.48±0.03，0.36±0.08， 0.28±0.08，0.48±0.09μM，而5a对正常细胞Vero的IC₅₀值为10.40±1.20μM。 蟾毒灵对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05,0.49±0.08， 0.54±0.07μM。蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-D-来苏糖苷油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-D-来苏糖苷(5a)的油水分配系数（logP）， 5a的logP为2.313，而相同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，5a的水溶性 较蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-D-来苏糖苷(5a)的抗肿瘤活性与 蟾毒灵相当，但对正常细胞的毒性较蟾毒灵低。并且，5a的水溶性均较蟾毒灵 好。

实施例6

蟾毒灵-D-阿拉伯糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中制备苷元方法。

（4）取苷元3b（40mg，0.096mmol），D-阿拉伯糖（28.9mg，0.192mmol） 加入反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1071μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应 后混合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液 相色谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min， 检测波长296nm，用45%的乙腈水溶液作为流动相，保留时间t_R=15.52min， 得到糖基化产物苷6a（28mg，0.051mmol，产率53%）。

对（4）中得到的糖基化产物6a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.57环己烷/乙酸乙酯3：7）。

波谱数据：ESI-MS m/z：548.5[M+H]⁺，570.5[M+Na]⁺，1117.6[2M+Na]⁺。 ¹H NMR（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.25（1H，dd，J=9.7，2.4Hz），7.46（1H，d， J=2.4Hz），6.36（1H，d，J=9.7Hz），4.50（1H，d，J=8.7Hz），4.77（m，1H）， 4.29（m，2H），4.16（m，1H），3.71（m，1H），3.86（s，3H），2.17，1.84（m， 2H），1.81，1.27（m，2H），1.42，1.14（m，2H），1.35，1.12（m，2H），3.79 （m，1H），2.48（m，1H），1.79（m，1H），1.93（m，2H），1.84（m，1H）， 1.46（m，2H），0.90（s，3H），0.84（m，3H）。¹³C NMR（Pyridine-d₅，100MHz） δ162.1，149.2，147.5，123.9，115.2，91.8，84.3，76.5，70.2，69.3，69.2，63.3， 57.3，51.4，48.8，42.3，40.8，37.1，36.6，35.9，32.8，31.2，29.7，29.4，27.2， 24.1，23.8，22.1，21.7，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物6a为蟾毒灵-3β-N-D- 阿拉伯糖苷，其化学式为C₃₀H₄₅NO₈，结构如下式所示。

蟾毒灵-D-阿拉伯糖苷的抗肿瘤活性实验

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物6a对肿瘤细胞DU145，PC3， LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。其中糖基化产物6a对上 述肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.80±0.10，0.36±0.07,0.17±0.05， 0.19±0.04，0.32±0.05μM，而6a对正常细胞Vero的IC₅₀值为11.3±0.80μM。蟾 毒灵对上述肿瘤细胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08， 0.54±0.07μM。蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-D-阿拉伯糖苷油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-D-阿拉伯糖苷(6a)的油水分配系数 （logP），6a的logP为2.324，而相同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，6a 的水溶性较蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-D-阿拉伯糖苷(6a)的抗肿瘤活性 与蟾毒灵相当，但对正常细胞的毒性较蟾毒灵低。并且，6a的水溶性均较蟾毒 灵好。

实施例7

蟾毒灵-D-木糖苷的合成，包括以下步骤：

（1）-（3）同实施例1中制备苷元方法。

（4）取苷元III（43mg，0.104mmol），D木糖（28.9mg，0.192mmol）加入 反应管中，溶解于DMF/AcOH3：1(1151μl)，于40℃匀速搅拌48h。反应后混 合物减压浓缩干燥除去反应溶剂，将样品溶于甲醇中，选用制备型高效液相色 谱柱（waters，C18，5μm，20×250mm）分离纯化样品，流速8ml/min，检测波 长296nm，用45%的乙腈/水溶液作为流动相，保留时间t_R=12.49min，得到糖基 化产物苷7a（22mg，0.040mmol，产率38%）。

对（4）中得到的糖基化产物7a进行结构鉴定。

理化性质：白色粉末（TLC R_f=0.54环己烷/乙酸乙酯3：7）

波谱性质：ESI-MS m/z：548.5[M+H]⁺，570.6[M+Na]⁺，1117.7[2M+Na]⁺。 ¹H（Pyridine-d₅，400MHz）δ8.23（1H，dd，J=9.7，2.5Hz），7.47（1H，d，J=2.5Hz）， 6.35（1H，d，J=9.7Hz），4.59（1H，d，J=8.6Hz），4.43（m，1H），4.25（m， 1H），4.18（m，1H），4.41，3.69（m，2H），3.98（s，3H），3.85（m，1H）， 2.10，1.86（m，2H），2.0，1.39（m，2H），1.97，1.50（m，2H），2.50（m， 1H），2.16（m，H），1.86（m，1H），1.78（m，1H），1.75（m，1H），1.69（m， 1H），1.42（m，1H），0.89（s，3H），0.84（d，3H）。¹³C（Pyridine-d₅，100MHz） δ162.0，149.3，147.5，123.8，115.1，92.0，84.3，80.5，71.5，71.0，69.1，63.6， 57.4，51.5，48.8，42.3，40.9，37.1，35.9，35.8，32.9，31.1，30.1，29.4，27.5， 24.1，24.0，23.2，21.8，17.1。

根据质谱、核磁共振一维及二维谱信息，鉴定化合物7a为蟾毒灵-3β-N-D- 木糖苷，其化学式为C₃₀H₄₅NO₈，结构如下式所示。

蟾毒灵-D-木糖苷的抗肿瘤活性实验

采用与实施例1中同样的方法检测糖基化产物7a对肿瘤细胞DU145，PC3， LNCaP，MCF-7，HeLa和正常细胞Vero的抑制活性。糖基化产物7a对上述肿 瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.24±0.06，0.56±0.03，0.35±0.08，0.28±0.16，0.86±0.13 μM。而对7a对正常细胞Vero的IC₅₀值为14.7±2.6μM。蟾毒灵对上述肿瘤细 胞株的IC₅₀值为0.34±0.06，0.58±0.04，0.67±0.05，0.49±0.08，0.54±0.07μM。 蟾毒灵对正常细胞Vero的IC₅₀值为0.71±0.14μM。

蟾毒灵-D-木糖苷油水分配系数测定

采用经典摇瓶法测定蟾毒灵-3β-N-D-木糖苷(7a)的油水分配系数（logP），7a 的logP为2.338，而相同条件下蟾毒灵的logP为3.625。可见，7a的水溶性较 蟾毒灵好。

小结：由以上结果可以看出，蟾毒灵-3β-N-D-木糖苷(7a)的抗肿瘤活性与蟾毒 灵相当，但对正常细胞的毒性较蟾毒灵低。并且，7a的水溶性均较蟾毒灵好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。