莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯在血吸虫病防治中的用途

摘要

本发明涉及以下通式(1)表示的莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯在血吸虫病防治中的用途。通过体外抗血吸虫活性评价试验表明本发明的通式(1)表示的化合物具有良好的抗血吸虫活性，其中Radicicol、Monorden D、Monocillin II、Monocillin IV在10μg/mL的浓度下血吸虫的致死率超过90％，远高于临床首选药物吡喹酮，Monocillin I和Monocillin III的药效则略高于吡喹酮。

说明书

技术领域

本发明涉及β-雷琐酸大环内酯的新用途，具体来说涉及了莫纳西林类β-雷琐酸大环内 酯在血吸虫病防治方面的新用途。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康，影响社会经济发展的人畜共患寄生虫病，也是仅次 于疟疾的第二大热带寄生虫病，流行面广，危害严重。2006年前后统计数据显示全球有76 个国家，超过2亿人感染血吸虫，6.52亿人面临血吸虫感染威胁，1.2亿人呈现病状，其中 2千万病例为严重病例。据有关报告显示2008年全球有1750万血吸虫患者接受治疗，近1.9 亿患者迫切需要低价但有效的药物介入治疗。尽管在多数情况下有效药物的及时介入可以避 免该病直接引起的死亡，但是由血吸虫病所引起的疾病负担却十分普遍。2004年世界卫生组 织估计其疾病负担相当于170万个伤残调整寿命年(disability adjusted life year，DALY)， 血吸虫病可导致严重的器官病理变化、贫血、营养不良、生长迟缓、智力发育受损和劳动能 力下降甚至完全丧失等。其中慢性肠道型血吸虫病从腹痛和血稀便发展到肝脾肿大、门脉周 围肝组织纤维化和门静脉高压。泌尿生殖型血吸虫病引起血尿、排尿困难、肾盂积水、膀胱 钙化和其他严重后遗症，严重时可能导致肾衰竭和膀胱癌。因此，血吸虫流行区往往伴随着 贫穷落后和经济低迷，于是相关地区和国家更加不能提供足够的经费和资源进行有效的预防 和诊疗，并由此造成恶性循环，严重影响着疫区人们的生存健康、生活质量和当地的经济社 会的发展。

血吸虫在我国流行已有2100多年的历史，并一度大规模流行，曾使许多疫区田地荒芜、 村毁人亡。直到建国后，在政府和人民的有组织、有计划的血吸虫防治措施不断深入实施， 并随着经济社会的不断发展，血防形势才发生了深刻变化，血吸虫病的大规模流行得到了根 本性的遏制。但由于全国现有钉螺面积仍有37.4万公顷，传染源尚未完全清除，再加上人畜 流动、水灾泛滥、农业耕作习惯等原因，影响我国血吸虫病流行传播的自然和社会因素尚未 根本消除，有报告称至2010年底，我国沿长江流域的湖南、湖北、江西、江苏、安徽五省的 江湖洲滩地区和云南四川的部分山区仍有血吸虫病流行，全国血吸虫病仍有约32.5万例。因 此，我国血吸虫病疫情回升或反弹的威胁仍然存在，血防形势依然十分严峻。

尽管近一个世纪以来，先后有诸多化学药物在血吸虫病防治方面发挥过重要作用，如糖 和能量代谢抑制剂酒石酸锑钾、呋喃丙胺、硝硫氰胺，蛋白质抑制剂依米丁、环孢素、核酸 代谢抑制剂奥沙尼喹、尼立达唑，氧化还原抑制剂奥体普拉、青蒿素类、螺金刚烷臭氧化物， 作用于脂肪代谢的洛伐他汀，作用于虫体膜结构与功能的吡喹酮、Roll-3128，以及硫氧还蛋 白谷胱甘肽还原酶抑制剂等。但以上多数药物都因疗效差、毒性大、不良反应多等问题先后 被弃用。只有自上世纪70年代后期发现的对人体5种血吸虫均有疗效的药物吡喹酮作为临床 首选药物一直沿用至今。据统计，要满足撒哈拉沙漠以南的非洲国家流行区的吡喹酮供给就 需要每年约2亿美元的资金，可见当前全球在血吸虫防治中对吡喹酮的需求和依赖程度。

当前我国用于人畜体内抗血吸虫的药物主要为吡喹酮和青蒿素类衍生物(青蒿琥酯和蒿 甲醚)。吡喹酮是一种高效低毒广谱抗吸虫和绦虫的药物，其中对血吸虫的作用，主要对尾蚴 感染人畜体内3小时内的童虫和24天以后的成虫有非常显著杀虫效果，而对其它时段发育的 童虫和早期成虫的作用效果差或几乎无效，故主要用于临床治疗已确诊的患者或病畜，在现 场人畜同步化疗中被广泛应用的目的是为了消除已感染有血吸虫的传染源或/和通过减少虫 荷，以控制病情。其弊端在于无法在感染初期(发病前)作用于血吸虫，只能“先病后治”， 而患者病发后即使治疗很成功，也已经造成了肌体损伤，患者的健康和工作效能已经明显受 到了影响。

此外，吡喹酮已被广泛使用了30余年，其抗虫效果也正在下降，抗药虫株不时产生，据 报道曼氏血吸虫对吡喹酮已产生了抗药虫株，日本血吸虫对吡喹酮已产生了一定的耐药性(即 杀虫效果较10余年前有明显减低)。青蒿素类衍生物是我国从中草药黄花蒿中研制出来的一 种抗恶性疟和抗血吸虫童虫药物，可作用于尾蚴感染人畜体内第8天～21天童虫，但在现场 防治中仅用于接触疫水频繁的人群，每两周用药一次，起到预防血吸虫病发生的作用，而且 该药物会引起神经系统和消化系统症状毒副作用，并对胚胎产生影响，可使早期胚胎死亡， 因此研发新型的抗血吸虫药物势在必行。

β-雷琐酸大环内酯(β-Resorcylic acid lactones)是一类由真菌经过聚酮合成途径 产生的一类的结构独特的苯并14元环大环内酯。尽管已报道的β-雷琐酸大环内酯数量不多， 但其中不少具有多种独特的生物活性。如具抑制细胞因子IL-1α、IL-β、IL-6、TNF-α释 放和抑制PTK及JNK/p38Pathways活性的antibiotic LL-Z1640-2、具抗真菌活性的 hypothemycin和monocillin I，以及具抑制植物根生长的zeaenol和antibiotic LL-Z1640-1 等。莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯(Monocillins)是其中重要的一类，研究报道较多，它 们在化学结构上有个共同的特点，就是大环的2’位均有羰基取代。莫纳西林类β-雷琐酸大 环内酯中radicicol的生物活性研究报道最多，它不仅具有明显的抗细菌、抗真菌和抗疟原 虫活性，同时具有很好的抗肿瘤活性。但迄今为止，尚未有关于β-雷琐酸大环内酯用于血 吸虫病防治方面的报道。

本发明所涉及的化合物均为莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯，其结构由以下通式(1)表 示：

式(1)

其中：

化合物1：R₁＝Cl，R₂+R₃＝0，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为双键，C-7’ 和C-8’之间为单键；或

化合物2：R₁＝Cl，R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-7’和C-8’之间均为双键，C-5’ 和C-6’之间为单键；或

化合物3：R₁＝H，R₂+R₃＝0，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为双键，C-7’ 和C-8’之间为单键；或

化合物4：R₁＝R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-7’和C-8’之间均为双键，C-5’ 和C-6’之间为单键；或

化合物5：R₁＝H，R₂+R₃＝0，C-3’和C-4’之间为双键，C-5’和C-6’之间，以及C-7’和 C-8’之间均为单键；或

化合物6：R₁＝R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为单键，C-7’和 C-8’之间为双键。

化合物1即文献1(Delmotte P，Delmotte-Plaquee J.Nature，1953，171：344)已 报导的Radicicol，其结构由下述式(1)-1表示：

式(1)-1

化合物2即文献2(Hellwig V，Mayer-Bartschmid A，Müller H.J Nat Prod，2003， 66(6)：829-837)已报导的Monorden D，其结构由下述式(1)-2表示：

式(1)-2

化合物3即文献3(Ayer W A，Lee S P，Tsuneda A，Hiratsuka Y.Can J Microbiol， 1980，26：766-773)已报导的Monocillin I，其结构由下述式(1)-3表示：

式(1)-3

化合物4即文献3已报导的Monocillin II，其结构由下述式(1)-4表示：

式(1)-4

化合物5即文献3已报导的Monocillin III其结构由下述式(1)-5表示：

式(1)-5

化合物6即文献3已报导的Monocilllin IV，其结构由下述式(1)-6表示：

式(1)-6

发明内容

本发明的目的在于开发出通式(1)表示的莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯在血吸虫病防 治方面的用途。

我们通过体外抗血吸虫活性评价试验发现通式(1)表示莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯 对血吸虫有显著的致死活性，从而实现了本发明的目的。

本发明的通式(1)表示的莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯可用于血吸虫病的防治，尤其 是人体、家畜或螺类因血吸虫感染引发的疾病的预防和治疗。

本发明通式(1)表示的化合物中的一个或者两个及两个以上可以直接制成药物作为血吸 虫病预防和治疗使用，也可以与其它药物合用，以增强预防和治疗效果或降低其毒副作用、 降低成本。本发明通式(1)表示的化合物的药物组合可以是固体形式，如粉剂、颗粒剂、脂 质体等，其固体载体可以是无毒、生物可降解的、亲水性或疏水性物质，也可以是液体形式， 如溶液、乳浊液、混悬液等，其液体载体可以是水、亲水性或疏水性有机溶剂及其各种比例 在水中的混合物。

本发明的通式(1)表示的莫纳西林类β-雷琐酸大环内酯的制备方法包括以下步骤：

(1)将拟青霉Paecilomyces sp.SC0924CGMCC No.2900在大米固体培养基上，黑暗中 于24～28℃静置培养10～30天，得到固体发酵培养物，所述的大米固体培养基由质量比1∶1 的大米和水组成，上述菌株已于2009年2月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，已公开于中国专利ZL200910037639.6中；

(2)将得到的固体发酵培养物用乙醇浸提，将乙醇水溶液减压浓缩除去乙醇后，用氯仿 萃取，萃取物浓缩得到氯仿提取物；

(3)将氯仿提取物进行正相硅胶柱层析，以体积比100∶0～80∶20的氯仿-甲醇混合溶剂 进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上石油醚-丙酮体积比1∶1展开 时比移值0.5～0.8的流份，合并浓缩后再用正相硅胶柱层析，以体积比90∶10～50∶50的石 油醚-丙酮混合溶剂为洗脱液，合并石油醚-丙酮体积比75∶25洗脱部分用甲醇重结晶得到通 式(1)表示的，R₁＝R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-7’和C-8’之间均为双键，C-5’ 和C-6’之间为单键的化合物4；或

将上述重结晶后剩余的部分经聚酰胺柱层析，用体积分数40％～80％乙醇洗脱，其中聚酰 胺柱体积分数50％乙醇洗脱部分经反相硅胶柱层析，用体积分数40％～70％甲醇洗脱，收集66 ％甲醇洗脱部分得到通式(1)表示的，R₁＝Cl，R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-7’和 C-8’之间均为双键，C-5’和C-6’之间为单键的化合物2，收集63％甲醇洗脱部分得到通式(1) 表示的，R₁＝R₂＝R₃＝H，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为单键，C-7’和C-8’ 之间为双键的化合物6；或

合并石油醚-丙酮体积比70∶30～65∶35洗脱部分，经聚酰胺柱层析，用体积分数40％～ 80％乙醇洗脱，其中聚酰胺柱体积分数45％乙醇洗脱部分经反相硅胶柱层析，用体积分数50％～ 65％甲醇洗脱，收集薄层板上氯仿-丙酮体积比9∶1展开时比移值0.4～0.6的流份，以HPLC 纯化(流动相为体积分数55％甲醇)，收集保留时间约为45min的产物得到通式(1)表示的， R₁＝H，R₂+R₃＝0，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为双键，C-7’和C-8’之间 为单键的化合物3，收集保留时间约为56min的产物得到通式(1)表示的，R₁＝H，R₂+R₃＝0， C-3’和C-4’之间为双键，C-5’和C-6’之间，以及C-7’和C-8’之间均为单键的化合物5；或

取上述聚酰胺柱体积分数50％乙醇洗脱部分用甲醇重结晶得到通式(1)表示的，R₁＝Cl， R₂+R₃＝0，C-3’和C-4’之间，以及C-5’和C-6’之间均为双键，C-7’和C-8’之间为单键的 化合物1。

通过体外抗血吸虫活性评价试验表明本发明的通式(1)表示的化合物均具有良好的抗血 吸虫活性，其中化合物1、2、4、6在10μg/mL的浓度下血吸虫的致死率超过90％，远高于 临床首选药物吡喹酮，化合物3和5的药效则略高于吡喹酮。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：本发明通式(1)表示的化合物的制备

将拟青霉Paecilomyces sp.SC0924 CGMCC No.2900菌种接种在11.50L大米固体培养基 (质量比1∶1的大米和水)上，黑暗中于26℃静置培养得到固体发酵培养物。将得到的固体 发酵培养物用1.5倍体积的95％乙醇浸提3次，每次24h，将乙醇水溶液减压浓缩除去乙醇后， 用等体积氯仿萃取3次，萃取物浓缩得到氯仿提取物97.50g。

将氯仿提取物经正相硅胶柱层析(硅胶100～200目，450g)，以体积比100∶0～80∶20的 氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上石油醚- 丙酮体积比1∶1展开时比移值0.5～0.8的流份，合并浓缩后再经正相硅胶柱层析(硅胶100～ 200目，300g)，以体积比90∶10～50∶50的石油醚-丙酮梯度洗脱：

合并石油醚-丙酮75∶25洗脱部分用甲醇重结晶得到无色结晶产物250mg，经检测其正 离子ESIMSm/z317[M+H]⁺，339[M+Na]⁺；负离子ESIMSm/z315[M-H]^-，351[M+ Cl]^-；¹H NMR(溶剂：氘代吡啶)数据见表1，证明是Monocillin II；

将上述重结晶后剩余的部分经聚酰胺柱层析(聚酰胺800～100目，20g)，用体积分数 40％～80％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部分再经反相硅胶柱层析(ODS DMi020T，150g)，用 体积分数40％～70％甲醇洗脱，收集66％甲醇洗脱部分得到白色粉末产6mg，经检测其正离 子ESIMSm/z351[M+H]⁺，373[M+Na]⁺；负离子ESIMSm/z349[M-H]^-；¹H NMR(溶 剂：氘代二甲基亚砜)数据见表2，证明是Monorden D；或收集63％甲醇洗脱部分得到白色 粉末产物38mg，经检测其正离子ESIMSm/z319[M+H]⁺，341[M+Na]⁺；负离子ESIMSm/z 317[M-H]^-；¹H NMR(溶剂：氘代氯仿)数据见表3，证明是Monocillin IV；

合并石油醚-丙酮体积比70∶30～65∶35洗脱部分，经聚酰胺柱层析(聚酰胺800～100目， 165g)，用体积分数40％～80％乙醇洗脱，其中聚酰胺柱45％乙醇洗脱部分经反相硅胶柱层析 (ODS DMi020T，150g)，用体积分数50％～65％甲醇洗脱，收集薄层板上氯仿-丙酮体积比9∶1 展开时比移值0.4～0.6的流份，以HPLC(Shimadzu LC-6AD高效液相色谱仪，YMC-pack ODS-A C18柱：5μm，250mm×20mm，流动相为体积分数55％甲醇)纯化，收集保留时间约为45min 的无色结晶产物30mg，经检测其正离子ESIMSm/z331[M+H]⁺，353[M+Na]⁺；负离子 ESIMSm/z329[M-H]^-，365[M+Cl]^-；¹H NMR(溶剂：氘代氯仿)数据见表4，证明 是Monocillin I；收集保留时间约为56min的无色结晶产物250mg，经检测其正离子ESIMS m/z333[M+H]⁺，355[M+Na]⁺；负离子ESIMSm/z331[M-H]^-，367[M+Cl]^-； ¹H NMR(溶剂：氘代氯仿)数据见表5，证明是Monocillin III；

上述聚酰胺柱体积分数50％乙醇洗脱部分用甲醇重结晶得到无色结晶产物350mg，经检 测其正离子ESIMSm/z365[M+H]⁺，387[M+Na]⁺；负离子ESIMSm/z363[M-H]^-； ¹H NMR(溶剂：氘代吡啶)数据见表6，证明是Radicicol。

表1.Monocillin II的¹H NMR数据(溶剂：氘代吡啶)

表2.Monorden D的¹H NMR数据(溶剂：氘代二甲基亚砜)

表3.Monocillin IV的¹H NMR数据(溶剂：氘代氯仿)

续表3

表4.Monocillin I的¹H NMR数据(溶剂：氘代氯仿)

表5.Monocillin III的¹H NMR数据(溶剂：氘代氯仿)

表6.Radicicol的¹H NMR数据(溶剂：氘代吡啶)

实施例2：实施例1化合物的抗血吸虫活性

实验用血吸虫(Schistosoma japonicum Katsurada)由阳性钉螺(来源于洞庭湖现场自 然感染的钉螺，湖南省血防所提供)释放出的尾蚴脱尾所得血吸虫童虫，阳性对照吡喹酮为 南京制药厂有限公司产品。供试样品和阳性对照用少量DMSO溶解，并以1640培养基稀释成 2mg/mL(DMSO的最终浓度小于体积分数0.5％)的供试液。

实验在12孔板中进行，在最终浓度含供试液20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL，以及 胎牛血清终浓度为10％的1640培养基中，每孔加入血吸虫童虫100～130条进行培养，并以 等浓度的吡喹酮作为阳性对照，以0.5％的DMSO培养基溶液作为空白对照，每个样品剂量水 平均设3个平行孔。培养72h后，采用终浓度为0.05％的美兰染色90min后在显微镜下观 察，虫体任何部位出现明显紫蓝色者为活虫体，否则为死虫体。结果见表7。

表7.通式(1)表示的化合物1～6的体外抗血吸虫活性