由种公牛体外受精率对种公牛精子体内受胎率的评价方法

摘要

一种由种公牛体外受精率对种公牛受胎率的评价方法，属于动物繁殖技术领域，将COCs分别用牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液洗后，放入牛卵母细胞成熟液中培养后，放入用BO-AB液获能的牛精子滴中受精；再用IVC SOF液脱掉颗粒细胞，把脱掉颗粒细胞的卵子放入SOF液中培养，测出体外受精卵裂率；同时进行人工授精，测出种公牛的受胎率，通过卵裂率与受胎率的关联性对种公牛进行评价。本发明的优点是利用种公牛精子体外受精率，较快的估测出种公牛的实际受胎能力，及时了解种公牛繁育能力，省去了人工授精检测个体种公牛繁育能力需要耗费大量时间、人力和财力的问题，节约了资源。

说明书

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，特别涉及一种由种公牛体外受精率对种公 牛精子体内受胎率的评价方法。

背景技术

随着牛冷冻精液的广泛应用，种公牛个体的品质也受到越来越多的重视。 种公牛繁育能力直接影响着冷冻精液的品质，在采精前了解种公牛个体的繁育 能力是非常重要的，但是通过人工授精来检测个体种公牛的繁育能力需要耗费 大量的人力、财力和时间。因此如果能够通过种公牛精子体外受精率评价其在 体内的受胎率，既可节约资源，又可较快的估测出种公牛的实际受胎能力，及 时了解所有种公牛的繁育能力。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种由种公牛体外受精率对种公牛精子体内受胎 率的评价方法，该技术原理是利用种公牛精子体外受精率与体内受胎率的相关 性，通过种公牛精子的体外受精率达到评价种公牛精子实际受胎率范围的目的 。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过种公牛体外受精率评 价种公牛受胎率的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

1、配制试剂：

按照牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液、牛体外受精液BO-A、BO- B、BO-AB、牛体外受精培养液Stock A、Stock B、Stock C、Stock D、Stock  X、Stock Y、Stock Z、IVC SOF液的次序排列；

（1)配制牛卵母细胞捡卵液：

H-M199+10%FBS

4℃保存，使用期限为一个月;

（2）配置牛卵母细胞成熟液:

M199+1μg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS

4℃保存，使用期限为一个月;

（3）配制牛体外受精液BO：

4℃保存，使用期限为一个月;

（4）配制牛体外受精液BO-A：

现配现用;

（5）配制牛体外受精液BO-B：

现配现用;

（6）配制牛体外受精液BO-AB：

等量BO-A与BO-B混合；

现配现用;

（7）配制牛体外受精培养液Stock A：

4℃保存，使用期限为一个月;

（8）配制牛体外受精培养液Stock B：

4℃保存，使用期限为一个月;

（9）配制牛体外受精培养液Stock C：

4℃保存，使用期限为一个月;

（10）配制牛体外受精培养液Stock D：

4℃保存，使用期限为一个月;

（11）配制牛体外受精培养液Stock X：

4℃保存，使用期限为一个月;

（12）配制牛体外受精培养液Stock Y：

4℃保存，使用期限为一个月;

（13）配制牛体外受精培养液Stock Z：

4℃保存，使用期限为一个月;

（14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液：

SOF液体总体积 10ml stockA 1ml stockB 1ml stockC 100μl stockD 100μl stockX 100μl stockY 100μl stockZ 100μl NEAA 100μl EAA 200μl BSA 0.08g P/S 10μl 酚红 10μl 超纯水 7.18ml

4℃保存，使用期限为一个月;

2、体外受精：

（1）牛卵细胞的成熟培养：

①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水中 ,用20ml注射器17^#针头抽取直径在2- 8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘- 卵母细胞复合体COCs；

②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液分别放在38.5℃，5%的二氧 化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液 洗一遍，牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500μl牛卵 母细胞成熟液，再加入500μl石蜡油，按照每孔50- 120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进 行成熟培养22h；

（2）体外受精：

①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO- A，B配制牛体外受精液BO-B；将配置好的牛体外受精液BO- A使用0.2μm过滤器过滤到新的50ml烧杯中，配好的牛体外受精液BO- B使用0.2μm过滤器过滤到新的50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预 热；

②取牛原精1000万，加入预热的牛体外受精液BO-A 5ml，将精子轻轻混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml 预热的牛体外受精液BO- A轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液 BO-AB将牛精子浓度稀释为1000万/ml；

③将②处理好的精液在35mm皿中做100μl的精子滴，做好后加入石蜡油放 入培养箱中；

④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出步骤2（1）②成熟22h 的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO- AB中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵 ，38.5℃，5%CO₂培养箱中培养6h；

（3）受精卵的体外发育培养：

经步骤2（2）④受精6h后，用培养箱中预热的IVC SOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500μl IVC SOF液上盖500μl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；　

（4）体外卵裂率检测：受精48小时统计卵裂率；

卵裂率=正常卵裂的胚胎/用于受精的卵子数；

3、人工输精：

（1）母牛的选择：

A、青年牛16-18月龄、体重275-350Kg；

B、经产牛产后60- 90天、子宫复旧良好；发情规律、产后第二次自然发情时输精;

（2）精液的选择：

按照国家标准，选取解冻后精子活力大于30%，畸形率小于20%，每毫升精液 中细菌菌落数小于1000个，顶体完整率大于40%，37℃存活时间大于4小时的 种公牛细管冷冻精液；

（3）母牛发情鉴定：

A、外部观察法：主要是根据母牛的外部和精神状态来判断发情的状况;

B、阴道检查法：用阴道开张器观察阴道的黏膜、分泌物和子宫颈口的变化 来判断母牛的发情状况;

C、直肠检查法：主要是检查卵巢的卵泡发育情况;

（4）冻精的解冻与人工输精：

输精时间和母牛排卵时间为发情结束后6-12小时，越接近越好；

（5）种公牛受胎率统计：输精60天后检测母牛是否怀孕

受胎率=怀孕母牛头数/输精母牛总头数

4、种公牛体外受精卵裂率与人工授精受胎率关联性比较评价标准

评价标准分级 体外受精卵裂率范围 人工授精受胎率评价范围 1 45%—60% 40±5% 2 60%—80% 50±5% 3 ＞80% 60±5%

本发明的优点和有益效果是：利用种公牛精子体外受精率与体内受胎率的 相关性，通过种公牛精子体外受精率评价其在体内的受胎率，既可节约资源， 又可较快的估测出种公牛的实际受胎能力，及时了解所有种公牛的繁育能力。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本 领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进 和变化都应视为在本发明的保护范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限 定。实施例中M199购买于美国GIBCO,货号为11150，H- M199购买于美国GIBCO公司,货号为12340，其它没有特别指出的试剂均为市售产 品。

本发明中出现的英文缩写字母的解释如下：

FBS－胎牛血清；E2-雌二醇；FSH－垂体促卵泡素；

LH―垂体促黄体素；Glucose－葡萄糖；Na Pyrucate－丙酮酸钠；

BSA-牛血清白蛋白;Na-lactate-乳酸钠；L-Glutamine-L-谷氨酰胺；

Sodium citrate-柠檬酸钠；myo-Inositol-肌醇；NEAA－非必需氨基酸；

EAA－必需氨基酸；P/S－青霉素/链霉素；IVC 　SOF－合成输卵管液；

stock－贮存液；

实施例1：1、把屠宰场收集的3h之内的新鲜牛卵巢，用无菌生理盐水冲洗3 次并浸泡在干净的生理盐水中；用20ml注射器17^#针头抽取直径在2- 8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘- 卵母细胞复合体COCs；将拣出的COCs放入在38.5℃的二氧化碳培养箱中平衡1h 的牛卵母细胞捡卵液中洗一遍，牛卵母细胞成熟液中洗两遍，按照每孔50枚的 数目放入每孔含有500μl牛卵母细胞成熟液，上盖500μl石蜡油的四孔板中，38. 5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；

2、取50ml烧杯2个，分别标记为A和B：烧杯A配制牛体外受精液BO- A40ml，烧杯B配制牛体外受精液BO-B6ml，配置好的牛体外受精液BO-A、BO- B分别使用0.2μm过滤器过滤到新的烧杯中，并放入37.5℃恒温水浴锅中预 热；

3、取种公牛冷冻精液一支解冻后放入15ml离心管中，加入预热的牛体外 受精液BO- A5ml，将精子轻轻混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml 牛体外受精液BO- A轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，加入1ml牛体外受精液B O-AB，将精子浓度稀释为1000万/ml；

4、用步骤3处理好的精液在35mm皿中做100μl的精子滴，做好后加入石蜡油 ，放入38.5℃，5%二氧化碳培养箱内；

5、打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h后的牛卵细胞 ，在预热的牛体外受精液BO- AB中洗3次，拿出步骤4做好的精子滴，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%CO₂培养箱中培养6h；

6、经步骤5受精处理6h后，将受精卵从培养箱中拿出，用培养箱中预热的 IVC SOF液脱掉其颗粒细胞，然后把处理好的受精卵放入预热的每孔含500μl IVC SOF液上盖500μl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；

7、体外卵裂率检测：受精48小时统计卵裂率；

卵裂率=正常卵裂的胚胎/用于受精的卵子数；　

6头种公牛体外受精卵裂率统计

牛号 体外受精卵裂率 15505930 56%(28/50) 15510187 47%(17/36) 15510205 80%(44/55) 15510145 72%(43/60) 15503763 95%(46/48) 15503863 94%(44/48)

8、人工输精：

（1）母牛的选择：

A、青年牛16-18月龄、体重275-350Kg；

B、经产牛产后60- 90天、子宫复旧良好；发情规律、产后第二次自然发情时输精；

（2）精液的选择：

按照国家标准，选取解冻后精子活力大于30%，畸形率小于20%，每毫升 精液中细菌菌落数小于1000个，顶体完整率大于40%，37℃存活时间大于4小 时的6头种公牛细管冷冻精液；；

（3）母牛发情鉴定：

A、外部观察法：主要是根据母牛的外部和精神状态来判断发情的状况；

B、阴道检查法：用阴道开张器观察阴道的黏膜、分泌物和子宫颈口的变化 来判断母牛的发情状况；

C、直肠检查法：主要是检查卵巢的卵泡发育情况；

（4）冻精的解冻与人工输精：

母牛发情结束后6— 12小时，将细管冻精直接放入40℃左右的温水中，20秒钟左右取出，用消毒 纱布抹干细管外围水分，再用剪刀剪去封口端，将细管装入消毒的输精器内 ，输精人员采用直肠把握输精法进行人工输精，即左手进入直肠，摸清子宫 颈后，左手心朝右侧握住子宫颈，无名指平行握在子宫颈外口周围，右手持 装有精液的输精器，向左手心中深插，输精器即可进入子宫颈外口。然后多 处转换方向向前深插，同时用左手将子宫颈前段稍作抬高，使输精器通过子 宫颈管内皱襞，直至进入子宫体时，应向后抽退一点，然后缓慢地将精液注 入，再轻轻地抽出输精器；

（5）种公牛受胎率统计：输精60天后检测母牛是否怀孕

受胎率=怀孕母牛头数/输精母牛总头数

6头种公牛的人工授精受胎率统计

牛号 人工授精受胎率 15505930 38.48%(279/725) 15510187 43.3%(265/612) 15510205 48.13%(206/428) 15510145 48.45%(204/421) 15503763 56.23%(203/361) 15503863 57.93%(976/1671)

9、种公牛体外受精卵裂率与人工授精受胎率关联性比较评价标准

根据本发明的种公牛体外受精卵裂率与人工授精受胎率对6头种公牛进行 评价：

从它们的结果可以看出：评价标准级别越高，其种公牛的繁育能力越强。

实施例2：种公牛受胎率常规评价的方法：

1、按照国家标准，选取解冻后精子活力大于30%，畸形率小于20%，每毫升 精液中细菌菌落数小于1000个，顶体完整率大于40%，37℃存活时间大于4小时 的任意挑选3头种公牛细管冷冻精液；

2、主要在规模化奶牛场进行，参配母牛随机选择正常发情母牛，经直肠检 查无生殖系统疾病的泌乳牛，母牛发情主要通过以下方法鉴定：

A、外部观察法：主要是根据母牛的外部和精神状态来判断发情的状况；

B、阴道检查法：用阴道开张器观察阴道的黏膜、分泌物和子宫颈口的变化 来判断母牛的发情状况；

C、直肠检查法：主要是检查卵巢的卵泡发育情况；

3、冻精的解冻与人工输精：

母牛发情结束后6— 12小时，将细管冻精直接放入40℃左右的温水中，20秒钟左右取出，用消毒 纱布抹干细管外围水分，再用剪刀剪去封口端，将细管装入消毒的输精器内 ，输精人员采用直肠把握输精法进行人工输精，即左手进入直肠，摸清子宫 颈后，左手心朝右侧握住子宫颈，无名指平行握在子宫颈外口周围，右手持 装有精液的输精器，向左手心中深插，输精器即可进入子宫颈外口。然后多 处转换方向向前深插，同时用左手将子宫颈前段稍作抬高，使输精器通过子 宫颈管内皱襞，直至进入子宫体时，应向后抽退一点，然后缓慢地将精液注 入，再轻轻地抽出输精器；

4、种公牛受胎率统计：输精60天后检测母牛是否怀孕

受胎率=怀孕母牛头数/输精母牛总头数

5、跟踪统计三头种公牛的人工授精受胎率，2年内得到的统计数据如下：

牛号 人工授精受胎率 15503330 46.7%（214/380) 15504217 56.04%(1100/1963) 15504884 59.70%(1184/1912)

通过统计一定量的人工授精受胎率，评价种公牛的受胎率。

由此可以得出如下结论：可以通过种公牛精子体外受精率，较快的估测出 种公牛的实际受胎能力，从而及时了解种公牛繁育能力，省去了人工授精检测 个体种公牛繁育能力需要耗费大量时间、人力和财力的问题，节约了资源。