病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA模板的应用

摘要

本发明涉及病毒基因组高度保守序列的应用，尤其涉及以肠道病毒基因组高度保守区作为模板来设计靶小配体RNA（sliRNA）。所得的sliRNA作为治疗病理性血管生成导致的相关疾病的治疗性活性成分。

说明书

交叉引用

本申请要求2010年9月20日提交的美国申请第12/886,446号的权益，该美 国申请的全部内容在此通过引用并入本文。

对序列表的引用

本申请包括通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且该序列表的全 部内容在此通过引用并入本文。在2011年9月19日创建的ASCII副本的名称为 Doc.No.4170050_1.txt，大小为9.28KB。

背景技术

小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是带有特定基因密码的短双 链RNA片段，功能长度一般为21-23核苷酸。siRNA与互补mRNA特异性结合， 使靶定的mRNA降解并失去功能。这种由siRNA有效介导的转录后的基因沉默 现象称之为RNAi（RNA干扰），其为自然存在于细胞中的防御机制。当双链 RNA进入细胞内时，其被切割成带有21-25个核苷酸的siRNA片段。所述片段 先与细胞内的其它成分结合以形成核酸蛋白复合体，称之为RNA诱导的沉默 复合物（RISC）。激活的RISC通过碱基配对靶向到同源mRNA上，从而切割 并降解mRNA，由此阻止细胞内特定的基因表达。siRNA不仅广泛应用于生物 医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、癌症、血管疾病、神经系统疾 病等具有广阔的前景。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是50岁以上的人视力不可逆性损害的主要 原因之一。AMD在临床上分为“干性”和“湿性”两型，湿性AMD发展快，是引 起失明的主要原因。其病理变化导致严重的视力障碍。AMD的表现包括视网 膜色素上皮细胞（RPE）功能受损和黄斑部脉络膜新生血管（CNV）。在一 些严重病例中还会出现液体渗出，RPE或神经上皮的脱离，血管破裂造成出血 性脱离。已发现许多细胞因子在CNV的生成过程中发挥着重要的调控作用， 所述细胞因子包括血管内皮细胞生长因子（VEGF）、VEGF受体（VEGFR）、 缺氧诱导因子（HIF）、血管生成素（Ang）和其它细胞因子，丝裂原活化蛋 白激酶（MAPK）及其它。

已对RNAi在抑制CNV方面的效力做了测试，Cashman等的研究表明 （Cashman SM等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2006；47(8)：3496-3504）， 将构建在腺病毒表达载体中的VEGF短发夹RNA（shRNA）玻璃体腔内注射于 VEGF165诱导的CNV小鼠模型。该注射治疗可有效地抑制VEGF的过表达并且 成功地阻止CNV的形成。证据显示shRNA腺病毒载体被递送（跨膜）至细胞 质并引发RISC的活化，使目标RNA降解。由于人们对腺病毒载体在临床应用 上的顾虑，尝试使用裸露（无传输介质）的VEGF siRNA使目标基因沉默。结 果显示通过裸露的“siRNA”抑制VEGF表达确实降低了在小鼠模型中CNV的形 成（Reich,S.J等人，Mol.Vis.2003；9：210–216）。

本领域仍然需要改良的、基于RNA的抑制剂，用于治疗如AMD和CNV的 疾病。

发明内容

一方面，本发明提供了一种调节Toll样受体（TLR）的sliRNA，该sliRNA 含有与病毒基因组序列的高度保守区的片段具有至少80%同源性的核苷酸序 列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与高度保守区的片段具有至少85%、 90%、95%、100%的同源性。在一些实施方式中，Toll样受体是Toll样受体3 （TLR3）。在一些实施方式中，高度保守区位于病毒基因组的选自5'非翻译 区（UTR）、3'UTR及开放阅读框（ORF）的区域。在一些实施方式中，病毒 是选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、人肠道孤病毒、微小核糖核酸病毒、 肠道病毒的人类病毒。在一些实施方式中，高度保守区序列位于SEQ ID NO:1 的241-263位。在一些实施方式中，sliRNA包括双链RNA，该双链RNA可为平 末端或可具有3’或5’突出端。在一些实施方式中，sliRNA的长度为14-25核苷 酸。在一些实施方式中，sliRNA包括位于核苷酸序列的3’端的1～2个DNA碱基。

另一方面，本发明提供sliRNA，该sliRNA包含具有以下序列的双链RNA 分子：

正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’(SEQ ID NO:14)

反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’,(SEQ ID NO:15)

或：

正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3’(SEQ ID NO:28)

反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3’(SEQ ID NO:29)

其中，N是选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶及其脱氧形式的核苷酸， 并且，其中，n是0～2的整数。在一些实施方式中，N是dT，且n为2。在一些实 施方式中，n为2。

再一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文提 供的sliRNA，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供了一种治疗病理性血管生成相关疾病的方法，所 述方法包括将药学有效剂量的本文提供的sliRNA给药至需要这种治疗的受治 者。在一些实施方式中，这些疾病选自：老年性黄斑变性（AMD）、糖尿病 视网膜病变及癌症。

另一方面，本发明提供了一种设计sliRNA的方法，所述方法包括从病毒 基因组序列中选择高度保守区，并测试包含与高度保守区的片段具有至少 80%、85%、90%、95%、100%同源性的核苷酸序列的RNA调节TLR（如TLR3） 活性的能力。

通过引用并入本文

如同将各单独的出版物、专利或专利申请通过引用单独并入本文中一样， 本文所提及的所有出版物、专利和专利申请均以相同的程度通过引用并入本 文。

附图说明

本发明的新特征由所附的权利要求书中的具体内容来阐述。为了更好地 理解本发明的特征和优点，以下将利用本发明原理通过说明书实施例和附图 进行详细阐明。

图1是巩膜-脉络膜/视网膜色素上皮细胞（RPE）铺片的荧光显微照片（放 大40倍）：绿色通道图片显示鬼笔环肽（Phalloidin）阳性的RPE细胞呈均匀 一致的六边形紧密排列（图1a），红色通道图片显示同工凝集素-B₄（iB4）- 阳性的血管内皮细胞（图1b），绿色-红色-蓝色通道的叠加图像显示出RPE、 血管内皮细胞和4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记的细胞核的重叠（图1c）。

图2a为在C57BL/6J小鼠体内通过激光光凝作用诱导的CNV小鼠模型的眼 球剖面图。图右下方箭头指示光凝斑在视乳头旁。图2b为氪激光光凝后5min 的眼底照片，箭头指示光凝斑和视网膜水肿；图2c是显微镜下下观察到的巩 膜-脉络膜/RPE的铺片显微照片（放大100×），箭头指示光凝斑在视神经旁。

图3是用共焦激光视网膜断层扫描仪记录的显微照片：眼底荧光血管造影 （FFA）检查显示C57BL/6J小鼠在氪激光光凝后发生血管改变。光凝后7天， 可在盘状荧光素渗漏处观察到光凝斑（图3a）；光凝后14天，可在荧光素渗 漏处明显地观察到光凝斑（图3b）（图中箭头所指为光凝部位）。光凝后28 天，在荧光渗漏处无明显光凝斑，并且出现瘢痕化（图3c）。

图4是在显微镜下观察到的脉络膜铺片的荧光显微照片（放大100倍）： 激光诱导的灼伤位于如图4d-f所示的环形缺损区内。在光凝后第4天，缺损区 内出现一些细胞碎片以及细胞核碎片（图4g-i）。到第7天时，在激光损伤区 可以看到同工凝集素-B4染色的CNV网。RPE细胞覆盖CNV复合体区域（图 4j-l）。第14天和第28天CNV面积无明显不同，但是与第7天的CNV面积相比 明显增加。

图5是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。激 光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红 色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图6是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 5%葡萄糖溶液处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、 同工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图7是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 阿瓦斯汀（Avastin）处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI （蓝色）、同工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内 皮细胞和RPE。

图8是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_1处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同 工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图9是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_2处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同 工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图10是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_3处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同 工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图11是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_4处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同 工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图12是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_5处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI（蓝色）、同 工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。

图13显示用ImageJ图像分析软件定量分析CNV的平均面积，图中显示每 个处理组均小于阴性对照组；siEv70_2处理组明显小于其它处理组。

图14是不同处理组VEGF mRNA表达水平：激光诱导的未处理的眼内的 VEGF mRNA水平明显高于其它处理组，在处理组中，siEv70_2处理组的VEGF mRNA水平为统计学意义上的最低水平。

图15显示实时PCR检测不同处理组TLR3的mRNA水平：siEv70_2处理组的 TLR3mRNA水平高于对照组。其它处理组与对照组相比没有明显差异。 siEv70_6（DNA：RNA杂交体）激活TLR3能力弱于具有同样序列的dsRNA （siEv70_2）。

图16显示实时PCR检测不同处理组IL12a mRNA水平：siEv70_2处理组的 IL12a mRNA水平高于对照组。其它处理组与对照组相比没有明显差异。 siEv70_6（DNA：RNA杂交体）激活IL12a能力弱于具有同样序列的dsRNA （siEv70_2）。

图17a和17b显示了病毒基因组的高度保守区。

图18a是pNF-κB-TA-luc的质粒图谱。图18b是不同处理组激活的NF-κB的 不同水平。

图19a显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100×）。 用siEv70_6处理的激光光凝后第7天的样品作为对照。细胞核、内皮细胞和RPE 分别用荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红色）和鬼笔环肽（绿色）标记。 siEv70_6（DNA：RNA杂交体）的CNV抑制效力弱于具有同样序列的dsRNA （siEv70_2）。图19b显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放 大100×）。用siEv70_7处理的激光光凝后第7天的样品作为对照。细胞核、内 皮细胞和RPE分别用荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红色）和鬼笔环肽 （绿色）标记。没有观察到明显的CNV抑制。

图20显示了经A）siEv70_2、B）阿瓦斯汀和C）5%葡萄糖刺激后观察到 的主动脉环内皮发芽情况。

图21显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100×）。 在CNV小鼠中评价注射siEv70_2抑制激光诱导的CNV的剂量效应关系。细胞 核、内皮细胞和RPE分别用荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红色）和鬼 笔环肽（绿色）标记。与未处理组（图21a-c）和阴性对照组（图21d-f）相比， siEv70_2（2μg）（图21m-o）处理组，siEv70_2（10μg）（图21p-r）处理组和 poly(I:C)阳性对照组（图21g-i）的CNV面积明显减少。siEv70_2（0.2μg）处 理组未观察到CNV抑制效果（图21j-l）。

图22显示了CNV面积的盒须图。Y轴表示CNV的面积，用平方微米（μm²） 表示。每个点对应一个CNV缺损（总数为247），包括siEv70_2（0.2μg）（n=41）、 siEv70_2（2μg）（n=52）、siEv70_2（10μg）（n=35）、poly(I:C)（n=39）、 GS（n=40）和未处理组（n=40）。

图23显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100倍）。 在激光诱导的CNV小鼠中评价玻璃体内注射BM01对CNV的抑制效果。细胞 核、内皮细胞和RPE分别用荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红色）和鬼 笔环肽（绿色）标记。与未处理组（图23a-c）和阴性对照组（图23d-f）相比， 在BM01处理组和poly(I:C)处理组（图23j-l和图23g-i）中CNV被明显抑制。

图24显示CNV面积的盒须图。Y轴表示CNV的面积，用平方微米（μm²） 表示。每个点对应一个CNV缺损（总数为155），包括BM01（n=36）、poly(I:C) （n=39）、GS（n=40）和未处理组（n=40）。

具体实施方式

下面参考实施例以举例说明的目的对本发明的几个方面进行描述。应当 理解的是，以下列出的许多具体细节、关系和方法用以完整理解本发明。然 而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，本发明可不通过具体描述中 的一个或一个以上方法来实施而以其它方法实施。另外，本发明并不限于所 示的行为或事件的顺序，因为一些行为可能以不同的顺序和/或与其它行为或 事件同时出现。此外，并不要求所有示出的动作或事件均根据本发明的方法 来实施。

本文使用的术语是用于描述特定实施方式，而无意限定本发明。除非另 有明确说明，本文所用的单数形式（“a”，“an”和“the”）也意在包括复数形式。 此外，术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“带有”或同类用法用在具体实施 方式和/或权利要求书中，这些术语意在包括与术语“包括”类似的方式。

术语“约”或“大约”是指由本技术领域普通技术人员所确定的特定值的可 接受的误差范围，该误差范围部分取决于该值是如何被检测或确定的，即， 测量系统的限制。例如，本领域中“大约”可意味着每次实施在1或1个以上标准 偏差以内。可选地，“大约”可意味着高达给定值的20%，优选地为高达给定值 的10%，更优选地为高达给定值的5%，并且还更优选地为高达给定值的1%。 可选地，对于生物系统或过程而言，该术语可意味着在一个数量级之内，优 选地为某个值的5倍之内，更优选地为某个值的2倍之内。在本申请和权利要 求书中对具体值进行描述的条件下，除非另有说明，认为术语“约”是指在特定 值的可接受的误差范围内。

I.小配体RNA

一方面，本发明提供了与用于调节Toll样受体（TLR）的sliRNA有关的组 合物和方法，该RNA包括与病毒基因组序列的高度保守区的片段具有至少 80%同源性的核苷酸序列。

本文所述的小配体RNA（sliRNA）是指作为TLR配体的RNA。

术语“调节”或“调节表达”是指编码基因的核酸分子（如DNA或RNA）的 量或水平升高（刺激）或降低（抑制）。抑制通常为调节表达的优选形式， 并且mRNA通常为优选的靶核酸。

Toll样受体

Toll样受体（TLR）在识别病原体成分以及随后的激活先天免疫反应中发 挥重要作用，然后所述先天免疫反应的激活引发适应性免疫反应的产生。TLR 由引起与病原相关分子模式（PAMP）结合的大的胞外结构域、跨膜区结构域 和与分子结合并启动细胞免疫反应的细胞内Toll/白介素-1受体（TIR）结构域 组成。在哺乳动物体内已鉴别出至少10种特异性识别所有主要类别的病原体 的TLR成员，在小鼠中已鉴别出11种特异性识别所有主要类别的病原体的分子 模式的TLR成员。TLR与亲水性核酸至LPS范围内的多种多样的配体结合，而 且，异源二聚作用扩大了配体范围。TLR2和TLR4识别细菌细胞成分。TLR6 与TLR2结合识别多种细菌细胞壁成分（Mariotti等人，Diversity2009,1,7-18）。

在一些实施方式中，Toll样受体是Toll样受体3（TLR3）。

TLR3识别双链（ds）RNA。病毒在感染细胞中复制时产生dsRNA，这说 明其胞外结构域引起dsRNA结合（Akira等人.Biochem Soc Trans，2003；31： 637-642）。所观察到的TLR3的抗新生血管功能的建议机制为激活IL12和 IFN-γ，IL12和IFN-γ为已表现出抑制新血管形成的两个媒介（Voest等人.J Natl Cancer Inst，1995；87：581-586.19）。

RISC介导的基因沉默需要将siRNA递送到细胞质。然而，裸露的“siRNA” 不能透过生物膜。裸露的“siRNA”抑制CNV的秘密直到近期Kleinman等人 （Kleinman等人.Nature；2008；452：591-597）做了报道才被知晓。他们发 现基于裸露的“siRNA”对CNV的抑制是通过激活细胞表面Toll样受体3（TLR3） 而实现的，而不是通过RISC实现的，且抑制不依赖于RNA序列。最近，另一 科研组证实“siRNA”介导的通过TLR3的信号转导能够抑制通过实验的方式诱 导的CNV，而不依赖于“siRNA”靶定的基因（Maloney等人.Ophthalmic Res， 2010；44:237-241）。

sliRNA的化学组成

本发明所述的sliRNA包括单链或双链的寡核苷酸。

本文使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”是指一种具有双链结构的核糖核 酸分子或核糖核酸分子的复合物，所述双链结构的核糖核酸分子包含如本文 所定义的两条反向平行的且基本互补的核酸链。形成双链结构的两条链，可 以是一个较大的RNA分子的不同部分，或是单独的RNA分子。当这两条链为 一个较大的RNA分子的不同部分时，这两条链由在形成双链结构的一条链的 3’端和另一条链的5’端之间的连续的核苷酸链连接，连接的RNA链称为“发卡 环”。当两条链由不同于上述在形成双链结构的一条链的3’端和另一条链的5’ 端之间的核苷酸的连续链的共价方式连接时，连接的结构称为“接头”。RNA 链可以含有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数是最短链的dsRNA的 核苷酸数。除了双体结构之外，dsRNA还可以包含一个或一个以上核苷酸悬 垂部分。本文所述的dsRNA也被称为“小配体RNA”或“sliRNA”。

本文所述的“核苷酸悬垂部分”是指一种不配对的核苷酸或当dsRNA的一 条链的3’端延伸超出另一条链的5’端时从dsRNA的双链结构中突出的核苷酸， 反之亦然。“平端”或“平末端”是指在dsRNA的末端没有不配对的核苷酸，即， 无核苷酸悬垂部分。“平末端的”dsRNA是在其整个长度范围内均为双链的 dsRNA，即，在分子的任一端都无核苷酸悬垂部分。

术语“反义链”是指包括与病毒基因组序列高度保守区序列的相应部分基 本互补的区域的dsRNA链。本文所述的术语“互补区域”是指反义链中的与序列 （例如，本文所定义的靶序列）基本互补的区域。当互补区域与高度保守区 的序列不完全互补时，只允许错配发生在末端区域，如果存在错配，一般是 在末端区域或者例如，在5'和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸范围内的区 域。

本文所述术语“正义链”是指包括与反义链的区域基本互补的区域的 dsRNA链。正义链一般是与从病毒基因组转录而来的RNA相同的链，优选地 是编码蛋白质的RNA。

术语“同源性”是指两个或两个以上多聚核苷酸序列之间的关系，如通过序 列比对确定。同源性还指多聚核苷酸序列之间的序列关联度，如由序列的字 符串之间的匹配确定。已有许多检测两个多聚核苷酸序列之间同源性的方法， 并且该术语是本领域技术人员众所周知的（见如分子生物学序列分析，von  Heinje,G.,科学出版社（1987）；以及引物序列分析，Gribskov.,M.and Devereux, J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)）。本文所述的术语“基本相同”是 指dsRNA的正义链与靶基因的相应部分之间存在非常高度的同源性（如100% 序列同源性）。然而，本发明还可使用具有超过90%或95%序列同源性的 dsRNA，因此可以容忍由基因突变、应变多态性或进化趋异导致的预期的序 列变异。尽管100%同源性是典型的，但是dsRNA可以包括RNA和高度保守区 序列之间的单个或多个碱基对的随机错配。

在一种实施方式中，dsRNA的至少一个末端含有1至4个核苷酸的，通常 为1或2个核苷酸的个单链核苷酸悬垂部分。出乎意料地，包含至少一个核苷 酸悬垂部分的dsRNA具有优于其平末端对照物的抑制性能。在一些实施方式 中，只有一个核苷酸悬垂部分可以增强dsRNA的活性，而不影响它的整体稳 定性。仅仅包含一个悬垂部分的dsRNA被证实在体内特别稳定和有效，同时 在不同的细胞、细胞培养基、血液、血清中也特别稳定和有效。一般地，单 链悬垂部分位于反义链的3’端，或可选地，位于正义链的3’端。dsRNA也可以 含有平末端，其一般位于反义链的5’端。这些dsRNA被证实具有提高的稳定性 和抑制活性，因此允许给药低剂量，即，少于每天5mg/kg受试者体重。在一 种实施方式中，dsRNA的反义链在超出正义链的3’端和5’端分别具有1-10个核 苷酸悬垂部分。在一种实施方式中，dsRNA的正义链在3’端和反义链的5’端分 别具有1-10个核苷酸悬垂部分。在另一实施方式中，悬垂部分中的核苷酸中的 一个或一个以上可被硫代磷酸酯核苷替代。

在一些实施方式中，sliRNA包含具有连接至RNA:RNA双链的3’端或5’端 的0、1、2、3、4或5个DNA碱基对的RNA:RNA双链。在一些实施方式中，优 选地为DNA碱基对连接至3’端。碱基对可具有1、2、3或4个核苷酸悬垂部分。 在一些实施方式中，优选地为平末端DNA碱基对。在一些实施方式中，DNA 优选地为T或dT。

在一些实施方式中，sliRNA包含在核苷酸序列的3’端的1、2、3、4或5个 脱氧核糖核苷酸碱基。所述碱基可以是：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌 呤（A）、尿嘧啶（U）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧腺苷（dA）、 或脱氧胸苷（dT），或其类似物。

在本发明中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸 （DNA）的寡聚体或多聚体，或模拟物。

本文所述术语“寡核苷酸”包括天然的和/或修饰的单体或键合的线性或环 状寡聚体，包括脱氧核糖核苷类、核糖核苷类、其取代形式和α-异头物形式、 肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯，及其它类似 物。寡核苷酸能够通过单体-单体相互作用（例如，Watson-Crick型碱基配对， 或反式型碱基配对，等等）的常规模式特异性地结合靶多 核苷酸。

寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同的区域组成。在本发明中，“嵌合的 寡核苷酸”或“嵌合体（chimeras）”是含有两个或两个以上化学上不同的区域 的寡核苷酸，其中，每个区域由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常包 括至少一个修饰的核苷酸区域和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体 的酶的底物的区域，其中，所述至少一个修饰的核苷酸区域赋予一种或一种 以上有益性能（如，提高对核酶的耐受性、提高细胞的摄取、提高RNA靶的 结合亲和力）。例如，RNase H是一种细胞的核酸内切酶，其切割RNA:DNA 双链中的RNA链。因此，RNase H的激活导致RNA靶被切割，从而大大增强了 反义链抑制基因表达的效力。因此，和与相同目标区域杂交的硫代磷酸酯脱 氧寡核苷酸相比，当使用嵌合的寡核苷酸时，通常可通过较短的寡核苷酸得 到可比较的结果。RNA靶的切割通常可以用凝胶电泳检测，如有必要，也可 以用本领域熟知的相关核酸杂交技术。

在一些实施方式中，被修饰的寡核苷酸的区域包括至少一个在糖环的2’ 位被修饰的核苷酸，最优选地为2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟修饰的 核苷酸。在其它优选的实施方式中，RNA修饰包括在RNA的3’端的嘧啶核糖 上的2’-氟、2’-氨基和2’氧-甲基修饰、脱碱基残基或反碱基。这种增加的亲 和力的效果大大提高了sliRNA的寡核苷酸对基因表达的抑制。RNA靶的切割 通常由凝胶电泳证实。在另一优选的实施方式中，嵌合的寡核苷酸还被修饰 以增强核酸酶耐受性。细胞含有多种可降解核酸的外源或内源核酸酶。对核 苷酸和核苷的许多修饰已显示出使合并了修饰的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷 酸更耐受核酸酶消化。核酸酶耐受性通常通过如下方式来检测：使寡核苷酸 与细胞提取物或分离的核酸酶溶液共孵育并且通过凝胶电泳测量完整的寡核 苷酸随时间推移其完整程度的变化。与未修饰的寡核苷酸相比，为了提高其 核酸酶耐受性而被修饰的寡核苷酸维持其完整性持续一段更长的时间段。已 经证实了对多种寡核苷酸的修饰增强或赋予核酸酶耐受性。

本发明更加优选地为包含至少一个硫代磷酸修饰的寡核苷酸。在某些情 况下，提高靶结合亲和力的寡核苷酸修饰还能够独立地增强核酸酶的耐受性。 一些理想的修饰见De Mesmaeker et al.Acc.Chem.Res.1995,28:366-374。

没有必要在给出的寡核苷酸的所有位点进行统一修饰，事实上，上述的 多个修饰可以掺入到单个的寡核苷酸或甚至寡核酸中的单个核苷中。本发明 也包括如上文定义的作为嵌合的寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一实施方式中，本发明中的核酸分子与另一基团偶联，所述基团包 括但不限于：脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽类、碳水化合物、脂 质、多聚碳氢化合物。本领域中的技术人员会认识到，这些分子可以被连接 到包括核酸分子的任何核苷酸中的一个或一个以上的的糖、碱或磷酸基团上 的多个位点。

本发明中的寡核苷酸可以通过熟知的固相合成技术方便地且常规地制 备。包括Applied Biosystems在内的不同供应商提供这些合成设备。其它任何 合成方法也都可以使用，寡核苷酸的实际合成方法恰好在本技术领域普通技 术人员的能力范围之内。众所周知，也可以使用类似的技术制备诸如硫代磷 酸酯和烷基化衍生物之类的其它寡核苷酸。还众所周知的是，使用类似的方 法和市售的改性单体（amidite）和定孔玻璃珠（CPG）产品，如生物素、荧 光素、吖啶或补骨脂素改性单体，和/或CPG合成荧光标记的、生物素化的或 其它修饰的寡核苷酸，例如胆固醇改性的寡核苷酸。

根据本发明，修饰的应用（例如，用LNA单体来增强效力、特异性和作 用时间及拓宽寡核苷酸的给药途径）由诸如MOE、ANA、FANA、PS等的现 有化学品构成（参考：Uhlman编的反义寡核苷酸在医疗化学中的最新进展， Current Opinions in Drug Discovery&Development2000Vol3No2）。修饰可 通过用LNA单体替换现有寡核苷酸中的一些单体来实现。LNA修饰的寡核苷 酸的尺寸可与母体化合物类似或更大，或优选地更小。优选地，这些LNA修 饰的寡核苷酸包含少于约70%，更优选地少于约60%，最优选地少于约50%的 LNA单体，并且它们的尺寸为约10至25个核苷酸，更优选地为约12-20个核苷 酸。

优选的修饰的寡核苷酸骨架，包括但不限于：硫代磷酸酯、手性硫代磷 酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基-烷基-磷酸三酯、甲基或其它烷基膦酸 盐（包括3’烯基膦酸盐和手性膦酸盐）、次膦酸盐、氨基磷酸酯（包括3'-氨基 氨基磷酸酯和氨基-烷基-氨基磷酸酯）、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、 硫代烷基磷酸三酯和具有正常的3'-5'连接键的硼化磷酸酯，这些硼化磷酸酯的 2'-5'连接的类似物，和具有反转极性的那些骨架，其中，相邻的几对核苷单位 连接方式为3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括 在内。

教导了制备上述含磷键的代表性的美国专利，包括但不限于：美国专利： 3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423； 5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496； 5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111； 5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050，上述美国专利中的每一个通过 引用并入本文。

优选的不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有由如下方式形成的骨 架：短链烷基或环烷基核苷间键合，混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键合， 或一个或一个以上短链杂原子或杂环核苷间键合。这些骨架包括具有吗啉代 键合（部分从核苷的糖部分中形成）的那些骨架；硅氧烷骨架、硫化物、亚 砜和砜骨架；formacetyl和硫代formacetyl骨架；亚甲基formacetyl和硫代 formacetyl骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基联 氨基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其它含有混合的N、O、S 和CH₂基团的骨架。

教导了制备上述寡核苷酸的方法的代表性的美国专利包括，但不限于： 美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033； 5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677； 5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046； 5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437和5,677,439， 上述美国专利中的每一个通过引用并入本文。

在其它优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键合（即， 骨架）被新的基团取代。保留碱基单元用于与适当的核酸目标化合物杂交。 表现出具有优异的杂交性质的一个这样的寡聚化合物（寡核苷酸的模拟物） 被称作为肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的 骨架取代，具体而言，是被氨基乙基甘氨酸骨架取代。核酸碱基被保留，并 直接或间接连接至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导了制备PNA化合物的 方法的代表性的美国专利，包括但不限于：美国专利：5,539,082；5,714,331 和5,719,262，该美国专利中的每一个通过引用并入本文。更进一步地，对PNA 化合物的教导也可在Nielsen等人的文章中（Science,1991,254,1497-1500）找 到。

在一些本发明更优选的实施方式中，含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和含 杂原子骨架（特别是-CH₂-NH-O-CH₂-、被称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨 架的-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-、-CH₂ON(CH₃)-CH₂-、-CH₂N(CH₃)-N(CH₃)CH₂-和 -ON(CH₃)-CH₂-CH₂-）的寡核苷酸，其中天然的磷酸二酯骨架被表示为上述 引用的美国专利5,489,677中的-O-P-O-CH₂-，和上述引用的美国专利5,602,240 中的酰胺骨架。还优选地是具有上述引用的美国专利5,034,506中的吗啉代骨 架结构的寡核苷酸。

修饰的寡核苷酸还可以含有一个或一个以上取代的糖基团。优选的寡核 苷酸在2’位包括以下基团中的一个：OH、F、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N- 链烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基可以 被或不被C-CO烷基或C₂-CO烯基和炔基取代。特别优选地为， O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH_2nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n和m可以是1至约10。其它优选的寡核苷酸 在2'位包括以下基团中的一个：C-CO，（低级烷基、取代的低级烷基、烷芳 基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、氯、溴、CN、CF₃、 OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、 氨基烷基氨基、多聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、 嵌入剂，用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸 的药效学特性的基团，和具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2’-甲 氧基乙氧基（2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-（2-甲氧基乙基）或2’-MOE） （Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504），即：烷氧基烷氧基基团。 进一步优选的修饰包括2’-二甲基氨基-氧-乙氧基，即，O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团， 也被称为2’-DMAOE，如以下本文实施例中所述，以及2’-二甲基氨基-乙氧基- 乙氧基（本领域也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE），即： 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂，下面本文的实施例中也有描述。

其它优选的修饰包括2'-甲氧基（2'-OCH₃）、2'-氨基丙氧基 （2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂）和2'-氟（2'-F）。寡核苷酸其它位置上也可以进行类 似的修饰，特别是3'末端核苷酸或2’-5’连接的核苷酸中的糖的3'位上和5'末端 核苷酸的5'位上。寡核苷酸也可含有糖模拟物，如环丁基代替呋喃戊糖基糖。 教导了制备这些修饰的糖结构的方法的代表性的美国专利包括但不限于：美 国专利：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137； 5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909； 5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920， 上述美国专利中的每一个通过引用并入本文。

寡核苷酸可以还包括核碱基（通常称为简单地称为“碱基”）修饰或替换。 如本文所用，“未修饰”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤（A）、鸟嘌呤 （G）和嘧啶碱基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。修饰的核碱 基包括其它合成或天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羟甲基胞嘧 啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基 衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸 腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶， 6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（伪尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8- 卤代、8-氨基、8-硫代、8-烷硫基、8-羟基、和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤， 5-卤代（特别是5-溴代、5-三氟甲基）和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7- 甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和 7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

此外，核碱基包括在美国专利3,687,808中公开的那些核碱基，以及在John  Wiley&Sons等人（The Concise Encyclopaedia of Polymer Science And  Engineering.1990:858-859,Kroschwitz,J.I.,ed），Englisch等人（Angewandle  Chemie,International Edition.1991,30:613），Sanghvi,Y.S（Chapter15, `Antisense Research and Applications’，pages289-302,Crooke,S.T.and Lebleu, B.ea.,CRC Press,1993）的文章中所公开的那些核碱基。这些核碱基中的一些 在增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力方面特别有用。这些核碱基包括5- 取代嘧啶，6-氮杂腺嘌呤嘧啶和N-2、N-6取代的嘌呤和0-6取代嘌呤，所述N-2、 N-6取代的嘌呤和0-6取代嘌呤包括2-氨丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔 基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已表现出使核酸双链的稳定性增加0.6-1.2℃ （Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds,‘Antisense Research and  Applications’,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278）并且5-甲基胞嘧啶取 代为目前优选的碱基取代，甚至当其与2'-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时为更 加优选的。

教导了制备上述修饰的核碱基及其它修饰的核碱基的方法的代表性美国 专利包括但不限于：美国专利3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066； 5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177； 5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692和5,681,941， 上述美国专利中的每一个通过引用并入本文。

本发明的寡核苷酸的另一修饰包括将一个或一个以上基团或偶合物化学 连接至寡核苷酸，从而增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。

这样基团包括但不限于：脂质基团（例如，胆固醇基团（Letsinger等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556）），胆酸（Manoharan等人.,Bioorg. Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060），硫醚（例如己基-S-三苯甲基硫醇 （Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770）），硫代胆固醇（Oberhauser等人, Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538），脂肪族链（例如，十二烷基二醇 （dodecandiol）或十一烷基残基（Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327-330; Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54）），磷脂（例如二-十六烷基-外消 旋甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋甘油-3-H-膦酸酯（Manoharan等 人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654;Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18, 3777-3783）），聚胺或聚乙二醇链（Mancharan等人,Nucleosides&Nucleotides, 1995,14,969-973），或金刚烷乙酸（Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36, 3651-3654），棕榈基基团（Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264, 229-237），或十八胺或己基氨基-羰基-叔氧胆固醇基团（Crooke等人,J. Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937）。

教导了制备这些寡核苷酸偶合物的方法的代表性的美国专利，包括但不 限于：美国专利：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313； 5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124； 5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046； 4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263； 4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830； 5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250； 5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475； 5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371； 5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，上述美国专利中的 每一个通过引用并入本文。

sliRNA的序列

在一些实施方式中，核苷酸序列与本文提供的病毒基因组高度保守区的 片段具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

在一些实施方式中，高度保守区序列位于序列SEQ ID NO:1的241-263位。

II.小配体RNA的设计方法

另一方面，本发明提供了一种设计sliRNA的方法，所述方法包括选择病 毒基因组序列的高度保守区，测试RNA调节Toll样受体（TLR）（例如，Toll 样受体3（TLR3））的活性的能力，所述RNA包含与所述高度保守区的片段 具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。

可在本发明中使用的病毒序列可以是本领域中熟知的任何病毒。适合的 病毒包括但不限于：单链RNA（ssRNA）病毒、双链RNA（dsRNA）病毒。

在一些实施方式中，病毒是dsRNA病毒，包括但不限于：传染性胰腺坏 死病毒、传染性腔上囊病病毒、维多利蠕孢菌病毒、囊状病毒、减毒病毒属、 分病毒、α潜隐病毒属、β潜隐病毒属、轮状病毒属等。

在一些实施方式中，病毒是ssRNA病毒，包括但不限于：冠状病毒属、 SARS、头甲病毒、虱P病毒、Plautia stali肠病毒、蚜虫病毒、琉璃叶蝉病毒1 （HoCV-1）、家蟋病毒、海洋RNA病毒属、肠道病毒属、鼻病毒、脊髓灰质 炎病毒、感冒病毒、甲型肝炎病毒、脑心肌炎病毒、副肠孤病毒、马乙型鼻 病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、樱桃锉叶病毒、温州蜜柑矮缩病毒、 Sequi病毒属、托拉多病毒、矮化病毒属、线虫传多面体病毒、黑悬钩子坏死 病毒、诺瓦克病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、β 四病毒属、ω四病毒属、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯（Sindbis）病毒、 切昆贡亚病毒、戊型肝炎病毒、疱疹病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、麻疹 病毒、腮腺炎病毒、尼帕（Nipah）病毒、Hendra病毒、狂犬病病毒、伊派病 毒、拉沙病毒、Lujo病毒、淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒、Mobala病毒、Mopeia 病毒、Amapari病毒、查帕雷病毒、Flexal病毒、Guanarito病毒、胡宁病毒、 拉丁美洲病毒、Machjupo病毒、花漾病毒、Paraná病毒、伯钦特病毒、Pirital 病毒、Sabiá病毒、塔卡里伯病毒、它米阿米病毒、白水阿罗约病毒、汉坦病 毒、Dugbe病毒、布尼奥罗病毒、立夫特山谷热病毒、流感病毒、鲑传贫病毒、 索戈托病毒属、丁型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等。

在选择病毒之后，从不同数据库（如GenBank）中获得不同种属和/毒株 的病毒基因组序列，或者对所述病毒基因组序列重新测序。优选地，不同种 属和/毒株的病毒来源于人类或接近于人的灵长类，如猴子、狐猴、黑猩猩等。

然后，用本领域熟知软件（如GCG package）将不同种属和/毒株的病毒 基因组序列进行比对以识别高度保守区。这里的“高度保守区”是指序列的一个 区段，或延伸部分，其在不同种属和/毒株的病毒之间是保守的。优选地，区 段的同源性为75%至100%，优选地为90%至100%。

在确定高度保守区之后，将高度保守区的片段的序列用于设计本发明的 sliRNA。

在一些实施方式中，高度保守区位于病毒基因组的选自5'非翻译区 （UTR）、3'UTR和开放阅读框（ORF）的区域。

sliRNA具有本文所描述的结构、序列和化学组成（如，修饰）。

在一些实施方式中，sliRNA的长度为约14至约25bp，优选地为约17至约 23bp（如17、18、19、20、21、22、23、24、25），优选地，GC含量为约30%-60%,， 更优选地为约35%、40%、45%、50%或55%。

优选地，sliRNA与人类基因，特别是人类的功能性基因没有同源性。一 般地，sliRNA与人类基因没有同源性，或同源性少于50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、95%或95%。

在一些实施方式中，sliRNA包含双链RNA，该双链RNA可以是平末端或 带有3’或5’悬垂部分。在一些实施方式中，sliRNA的长度为14～25核苷酸。

在一些实施方式中，sliRNA具有连接至RNA:RNA双链的5’和/或3’端的1、 2、3、4或5个DNA碱基。在一些实施方式中，DNA碱基连接至3’端，优选地， 形成平末端。

设计的sliRNA用本文提供的或本领域熟知的方法合成。

用本文提供的或本领域熟知的体外实验、体内实验或动物模型测试合成 的sliRNA调节TLR（如TLR3）的能力。

在一些实施方式中，通过测试TLR3、IL12、NF-κB或其它生物标记物的 表达水平（mRNA和/或蛋白）来评价sliRNA调节TLR3的能力。

在一些实施方式中，用本发明提供的大鼠主动脉环测试或NF-κB活性测试 来检测sliRNA。

在一些实施方式中，用本发明提供的小鼠CNV模型来检测sliRNA。

一般地，设计并合成一批sliRNA，优选地，所述sliRNA包括所有可能的 已知病毒基因组的sliRNA。在一些实施方式中，设计具有一个或一个以上涵 盖整个病毒基因组高度保守区的重叠碱基的一系列sliRNA。

在确定一个或一个以上主要sliRNA后，可以进一步通过调整序列、结构、 修饰等对所述主要sliRNA进行优化，从而获得预期的特征，诸如DM和PK。

sliRNA的特征包括但不限于：稳定性、功效和毒性。

sliRNA可以优化成与本文提供的或本领域熟知的递送系统相偶联。

III.处理方法

另一方面，本发明提供一种治疗病理性血管生成相关疾病的方法，所述 方法包括将本文提供的药学有效量的sliRNA给药于需要这种治疗的受治者。 在一些实施方式中，这些疾病选自：眼新生血管疾病，如糖尿病视网膜病变 （DR）、老年性黄斑变性（AMD）、葡萄膜炎、实质层角膜炎（SK）及癌 症。

本文所述的术语“受治者”或“个体”是指患有疾病等的个体，所述个体包括 哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物例子包括但不限于：哺乳动物种类中的任 一成员：人类、非人类的灵长类（如黑猩猩）和其它猿类及猴类；耕作动物 （如牛、马、绵羊、山羊、猪）；家养动物（如兔、狗和猫）；包括啮齿类 在内的实验动物（如大鼠、小鼠和豚鼠），及其它。非哺乳动物的例子包括 但不限于：鸟类、鱼类及其它。在本文中所提供的方法和组合物的一些实施 方式中，哺乳动物是人类。

IV.药物组成及递送

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本文 所提供的sliRNA，以及药学上可接受的载体。

本发明提供了用于治疗病理性血管生成相关疾病的sliRNA分子制剂。依 照相应疾病的给药方式，药物的相关剂型发生改变，并且所述药物的相关剂 型对于保持sliRNA分子的活性而言是适当的。例如，对于与合适递送系统配 套的可注射药物而言，剂型可以是冻干粉。

任选地，上述药物剂型可以含有任何药学上可接受的佐剂，只要合适的 递送系统对于保持sliRNA分子的活性而言是合适的且适当的。

例如，在眼科药物临床应用上，本发明的sliRNA可以溶解在无RNA酶的 无菌水中。sliRNA浓度被调整到1μg/μL。轻轻混合后进行玻璃体内注射。每 两个星期注射一次，4周为一个疗程。

在另一个优选的实施方式中，对病人的治疗包括与其它疗法联合给予一 种或一种以上RNA化合物，所述其它疗法，例如，化疗、放疗、手术、抗炎 剂等。其它药剂可以在给药RNA化合物之前、之后给药或与RNA化合物联合 给药。

本发明的RNA化合物包括任何药学上可接受的盐、酯或这类酯的盐，或 任何其它化合物，所述任何药学上可接受的盐、酯或这类酯的盐，或任何其 它化合物在将其给药于包括人类在内的动物之后能够提供（直接或间接）其 具有生物活性的代谢物或残余物。因此，例如，本发明还涉及本发明的化合 物的前药和药学上可接受的盐、这些前药的药学上可接受的盐和其它生物等 同物。

术语“前药”是指一种治疗制剂，其被制备成可在体内或细胞内通过内源性 酶或其它化学成分和/或条件的作用转化为活性形式（即，药物）的无活性形 式。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的生理上和药学上可接受 的盐，即保留期望的母体化合物的生物活性而不带来不需要的毒性作用的盐。

药学上可接受的碱加成盐通过诸如碱金属和碱土金属或有机胺之类的金 属或胺形成。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙及类似物。胺包括N,N’- 二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲 基葡糖胺和普鲁卡因（见如Berge等人，Pharmaceutical Salts.J.Pharma Sci., 1977,66,119）。所述酸性化合物的碱加成盐通过以常规方式使足以生成盐的 量的期望的碱与游离酸形式接触来制备。游离酸的形式可以通过以常规方式 使酸与盐形式接触并且分离游离酸再生。游离酸形式与它们各自的盐在诸如 极性溶剂中的溶解度之类的某些物理性质方面稍有不同，但除此之外，就本 发明的目的而言，盐等同于它们各自的游离酸。

如本文所用，“药品加成盐”包括本发明的组合物的组分中的一种的酸形式 的药学上可接受的盐。这些盐包括胺的有机酸盐或胺的无机酸盐。优选的酸 式盐是盐酸盐、乙酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它合适药学上可接 受的盐是本领域技术人员众所周知的并且包括多种无机酸和有机酸的碱式 盐，所述无机酸例如，盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸，所述有机酸例如，有机 羧酸、有机磺酸、有机硫酸、有机磷酸或N-取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙 酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、 酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉 桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、 扑酸、烟酸或异烟酸、以及氨基酸，如合成天然蛋白质所涉及的20种α-氨基酸， 如谷氨酸或天冬氨酸，所述有机酸还例如苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙 磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、2- 或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、N-环己基氨基磺酸（伴随环己基氨基磺酸 酯形成），或其它酸性有机化合物，如抗坏血酸。也可以通过药学上可接受 的阳离子制备化合物的药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的阳离子是 本领域的技术人员众所周知并且包括碱金属、碱土金属、铵和季铵阳离子。 碳酸盐或碳酸氢盐也是可能的。对于寡核苷酸而言，优选的药学上可接受的 盐的实例包括但不限于：（I）与阳离子形成的盐，所述阳离子如钠、钾、铵、 镁、钙、聚酰胺（如精胺和亚精胺）等；（II）与无机酸形成的酸加成盐，所 述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；（III）与有机酸形成的 盐，所述有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、 柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、 萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；和（IV）与元 素的阴离子形成的盐，所述阴离子如氯、溴和碘。

本发明的RNA化合物可用于诊断、治疗、预防并且可用作研究试剂和试 剂盒。对于治疗而言，怀疑患有疾病或失调的动物，优选地为人类通过给药 本发明的RNA化合物来治疗，所述动物，优选地为人类可通过调节靶基因的 表达来进行治疗。本发明化合物可以通过将有效量的sliRNA化合物加至合适 的药学上可接受的稀释剂或载体中用于药物组合物中。本发明的RNA化合物 和方法的应用也可以用于疾病预防方面。

本发明还包括药物组合物和剂型，所述药物组合物和剂型包括本发明的 RNA化合物。本发明的药物组合物可通过多种方式给药，所述多种方式取决 于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。给药可以是局部给药（包 括眼部给药和粘膜给药（包括阴道及直肠递送）），肺部给药（如通过吸入 （包括由雾化器吸入）粉末或气溶胶），气管内给药，鼻内给药，表皮和经 皮给药，口服给药或胃肠外给药。

本发明的药物组合物包括但不限于：溶液、乳液和含脂质体的剂型。这 些组合物可由多种成分形成，所述多种成分包括但不限于：预先形成的液体、 自乳化固体和自乳化半固体。

本发明的药物组合物包括用量为0.5mg-3mg/眼的sliRNA。

本发明的药物组合物每月（约28天）给药一次。

本发明的某些组合物还在剂型中掺入载体化合物。如本发明所用，“载体 化合物”或“载体”是指核酸或类似物，它是惰性的（即本身不具有生物活性）， 但其通过体内过程被识别为核酸，所述体内过程通过例如降解生物活性的核 酸或促进其从循环中去除降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载 体化合物的联合给药（通常后者的物质是过量的）可导致从肝脏、肾脏或其 它额外循环储存库中回收的核酸的量大幅减少，这大概是由于载体化合物和 核酸竞争一个共同的受体。例如，当其与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、polycytidic 酸或4-乙酰氨基-4'异硫氰基-均二苯乙烯-2,2'双磺酸联合给药时（Miyao等人， Antisense Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等人，Antisense&Nucl.Acid  Drug Dev.,1996,6,177-183），可以降低部分硫代磷酸酯寡核苷酸在肝组织中 的回收。

本发明的某些实施方式提供药物组合物，所述药物组合物含有一种或一 种以上RNA化合物和一种或一种以上通过非TLR相关机制起作用的其它化疗 剂。

这些化疗剂的实例包括但不限于：抗癌药，如放线菌素D、柔红霉素、阿 霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、 6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷（CA）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、氟尿苷 （5-FUdR）、甲氨蝶呤（MIX）、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、鬼臼乙叉 甙、替尼泊甙、顺铂和己烯雌酚（DES）（见The Merck Manual of Diagnosis and  Therapy,15th Ed.,Berkow等人,eds.,1987,Rahway,N.J.,pages1206-1228）。

还可将抗炎药和抗病毒药物与本发明的组合物联合，所述抗炎药包括但 不限于：非甾体抗炎药物和皮质类固醇，所述抗病毒药物包括但不限于利： 巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦、更昔洛韦。（The Merck Manual of Diagnosis and  Therapy,15th Ed.,Berkow等人,eds.,1987,Rahway,N.J.,pages2499-2506and 46-49,respectively）。其它非反义化疗剂也在本发明的范围内。两个或更多联 合的组合物可以一起或依次使用。

在另一个相关的实施方式中，本发明的组合物中可包含一种或一种以上 RNA化合物，特别是具有不同序列的sliRNA。两个或更多联合的化合物可以 一起或依次使用。

核酸递送系统

优选的本发明的实施方式包括通过合适的核酸递送系统给药上述RNA寡 核苷酸中的至少一种，如在美国专利申请公开20090247604中所公开的，其公 开的内容通过引用并入本文。

在一种实施方式中，该系统包括可操作地连接至多核苷酸的非病毒载体。 这样的非病毒载体的实例包括单独的寡核苷酸或与合适的蛋白质、多糖或脂 质制剂结合的寡核苷酸。

此外，合适的核酸递送系统包括病毒载体，通常包括来自腺病毒、腺相 关病毒（AAV）、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒或日本-脂质体（HVJ） 复合物中的hemagglutinatin病毒中的至少一种的序列。优选地，所述病毒载体 包括可操作地连接至多核苷酸的强真核启动子，例如，巨细胞病毒（CMV） 启动子。

此外，优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学偶合物。逆转录病毒 载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于艾滋病毒的病毒。一种优选的基于HIV 的病毒载体包括至少两种载体，其中，gag和pol基因来自于HIV基因组，env 基因来自于另一病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体（如正 痘（orthopox）或禽痘（avipox）载体），疱疹病毒载体（如单纯疱疹病毒（HSV） 载体）（Geller,A.I等人，J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F等人，in DNA  Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford  England)(1995)；Geller,A.I等人，Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:907603(1993)； Geller,A.I等人，Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990)），腺病毒载体（LeGal  LaSalle等人，Science,259:988(1993);Davidson等人，Nat.Genet.3:219(1993); Yang等人，J.Virol.69:2004(1995)）和腺相关病毒载体（Kaplitt,M.G等人， Nat.Genet.8:148(1994)）。

痘病毒载体将基因导入到细胞质中。禽痘病毒载体只能介导核酸短期表 达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒（HSV）载体可为一些发 明的实施方式中的现象。相对于腺相关病毒，腺病毒载体介导更短期（例如， 约小于一个月）的表达，在一些实施方式中，腺病毒载体可显示出表达期长 得多。选择的特定载体取决于靶细胞和处理条件。

选择适当的启动子可以很容易地完成。优选地，本领域技术人员可使用 高表达启动子。合适的启动子的例子为763个碱基对的巨细胞病毒（CMV）启 动子。Rous肉瘤病毒（RSV）（Davis等人，Hum Gene Ther4:151(1993)）和 MMT启动子也可以使用。用天然的启动子可以表达某些蛋白质。还可以包含 可增强表达的其它元件，如增强子，或可提高表达水平的系统，如tat基因和tar 元件。这些表达盒随后可以插入到载体中，如质粒载体（如pUC19、pUC118、 pBR322），或包括如大肠杆菌的复制起点其它已知的质粒载体（Sambrook等 人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory  press,(1989)）。启动子在下文讨论。质粒载体还可以包括选择标记，如氨苄 青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，条件是标记多肽对处理的生物体的代谢不产生 不利影响。在合成的递送系统中，表达盒也可以结合到核酸结合部分，如PCT 专利WO95/22618中所公开的系统。

如果需要的话，本发明的多核苷酸也可以与微小递送载体一同使用，所 述微小递送载体例如阳离子脂质体和腺病毒载体。对于脂质体制备步骤，靶 向和递送目标物而言，可参见Mannino and Gould-Fogerite,Bio Techniques，6： 682（1988）。还可参见Felgner and Holm，Bethesda Res.Lab.Focus，11(2)： 21(1989)和Maurer，R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus，11(2)：25(1989)。

复制缺陷型重组腺病毒载体可以根据已知的技术制备（Quantin等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等人，J.Clin. Invest.,90:626-630(1992)；Rosenfeld等人，Cell,68:143-155(1992)）。

另一种优选的反义寡核苷酸递送方法是使用可产生胞内反义寡核苷酸的 单链DNA制造载体。参见例如Chen et al,Bio Techniques,34：167-171（2003）， 其全部内容通过引用并入本文。

核酸的有效剂量为特定表达蛋白，待靶定的特定的心律失常、病人和他 或她的临床状况、体重、年龄、性别等的函数。

一个优选的递送系统是其中掺入了多聚核苷酸中的一种或一种以上（优 选地约一个多核苷酸）的重组病毒载体。优选地，本发明方法中使用的病毒 载体的pfu（斑形成单位）为约10⁸至约5×10¹⁰pfu。在将多核苷酸与非病毒载体 联合给药的实施方式中，常用的有效剂量为约0.1ng至约4000μg，例如，约1ng 至约100μg。

本发明的实施方式还涉及用于表达RNA寡核苷酸的表达载体构建体，所 述RNA寡核苷酸含杂合启动子基因序列并具有强组成型启动子活性或在期望 的情况下可被诱导的启动子活性。

在整个申请中，术语“表达构建体”是指包括任何类型的遗传构建体，其含 有用于编码基因产物的核酸，在所述构建体中，部分或全部核酸编码序列能 被转录。转录本可以翻译成蛋白质，但它不需要。在某些实施方式中，表达 包括基因的转录和mRNA翻译成基因产物。在其它实施方式中，表达仅包括转 录编码目标基因的核酸。

编码基因产物的核酸是在启动子的转录控制下。“启动子”是指被细胞的合 成机制识别的或引入的合成机制识别的DNA序列，需要所述DNA序列启动基 因的特异性转录。短语“转录控制下”是指该启动子位于和核酸有关的正确位置 和方向以控制RNA聚合酶启动和基因表达。

本文所述的术语“启动子”是指聚集在聚合酶起始位点周围的一组转录控 制模块。反复考虑的是如何识别来源于多种病毒启动子分析的启动子，所述 多种病毒启动子包括用于HSV胸苷激酶（TK）和SV40早期转录单元的那些启 动子。启动子由不连续的功能模块构成，每个模块由约7bp至20bp的DNA组成， 并含有用于转录激活子或阻遏子蛋白的一个或一个以上识别位点。

每个启动子中的至少一个模块起到定位RNA合成的起始位点的作用。所 述模块的最好的已知实例为TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子中，如 哺乳动物的末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因启动子中， 覆盖起始位点的不连续的元件自身有助于固定起始位点。

额外的启动子元件调节转录起始位点的频率。典型地，虽然最近许多启 动子显示出在起始位点的下游也含有功能元件，但是这些额外的启动子元件 位于该区域起始位点上游的30bp至110bp区域。在启动子元件之间的间距通常 是可变的，这样当元件相对彼此反向或移动时，启动子功能被保护。在tk启动 子上，在活性开始减退之前，启动子元件之间的间距可以提高到相距50bp。 依赖于启动子，单个元件看上去可协同作用或独立作用从而激活转录。

用于控制目标核酸序列的表达的特定启动子被认为是不重要的，只要它 能够指导靶细胞中的核酸表达。因此，当靶定人体细胞时，优选的是将核酸 编码区域放置于能在人体细胞中表达的启动子附近并在其控制下。一般来说， 这样的启动子可包括人类启动子或病毒启动子。

在不同实施方式中，可以用人类巨细胞病毒（CMV）即早基因启动子、 SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素 启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶，以获得目标编码序列的高水平表达。也可考虑 用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目标编 码序列的表达，条件是表达水平满足预期目标。通过使用具有已知属性的启 动子，可以优化转染或转化后目标蛋白的表达水平和模式。

对响应特定生理信号或合成信号而被调节的启动子的选择可以诱导基因 产物的表达。例如，在转基因表达或利用多顺反子载体进行的转基因表达对 细胞（在该细胞中产生载体）产生毒性的情况下，理想的是禁止或减少转基 因中的一个或一个以上转基因的表达。可对生产细胞系产生毒性的转基因实 例为促凋亡基因和细胞因子基因。在转基因产物可能是有毒性的情况下，几 种诱导型启动子系统可用于病毒载体生产。

蜕皮激素系统（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）就是一个 这样的系统。该系统被设计为允许调节哺乳动物细胞中的目标基因的表达。 该系统由严格的调控表达机制构成，该表达机制实际上不允许基础水平的转 基因表达，但具有200倍以上的诱导性。该系统基于果蝇的异源二聚体蜕皮激 素受体，当蜕皮激素或诸如幕黎甾酮A之类的模拟物与受体结合时，该受体激 活启动子以开启下游转基因的表达，从而获得高水平的mRNA转录本。在这个 系统中，异源二聚体受体的两种单体通过一个载体进行组成型表达，而驱动 目标基因表达的蜕皮激素响应启动子位于另一个质粒上。因此，将该类系统 构建到目标基因转移载体中是有用的。含目标基因的质粒和含有受体单体的 质粒在生产细胞系中的共转染可以产生基因转移载体而不产生潜在毒性转基 因的表达。在适当时间，转基因的表达可以被蜕皮激素或幕黎甾酮A激活。

另一种有用的可诱导系统是Tet-Off^TM或Tet-On^TM系统（Clontech公司，帕 罗奥图，加州）。该系统也允许待响应诸如多西环素之类的四环素或四环素 衍生物而被调节的基因高水平表达。在Tet-On^TM系统中，基因表达在多西环素 存在的条件下被启动，而在Tet-Off^TM系统中，基因表达在无多西环素的情况 下启动。这些系统基于两个来自大肠杆菌的四环素抗性操纵子的调控元件。 四环素阻遏结合的四环素操纵子序列和四环素阻遏蛋白。目标基因被克隆到 质粒中，在所述质粒中，目标基因位于具有四环素响应元件的启动子之后。 第二质粒含有称为四环素控制的反式作用子的调节元件，在Tet-Off^TM系统中 所述调节元件由源于疱疹单纯病毒和野生型四环素阻遏子的VP16区域构成。 因此，在无多西环素时，转录是以组成型方式启动的。在Tet-On^TM系统中，四 环素阻遏子不是野生型的且在存在多西环素的条件下激活转录。对于基因治 疗载体的生产而言，Tet-Off^TM系统将是优选的，这样，生产细胞可以在四环 素或多西环素存在下生长，并阻止潜在毒性转基因的表达，但当载体被导入 到患者身体中时，基因表达以组成型方式启动。

在一些情况下，理想的是调节基因治疗载体中的转基因表达。例如，取 决于期望的表达水平，可使用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳 动物细胞中，CMV即早期启动子经常用于提供强转录激活。当期望降低转基 因的表达水平时，还可使用效力较低的CMV启动子的修饰版本。当希望在造 血细胞中表达转基因时，逆转录病毒启动子，如源于MLV或MMTV的LTR被 经常使用。取决于所期望的效果可使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV  LTR、HIV-1和HIV-2LTR，如源于E1A、E2A或MLP区域、AAV LTR、花椰 菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒的腺病毒启动子。

在一个优选的实施方式中，组织特异性启动子用于影响特定组织或细胞 中的转录，从而减少对非靶组织的潜在毒性或不良影响。例如，可将诸如PSA、 前列腺碱性蛋白、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶（hK2）之 类的启动子用于前列腺中的靶基因表达。

IRES：在本发明的某些实施方式中，内部核糖体进入位点（IRES）元件 用于产生多基因或多顺反子、信使。IRES元件能够绕过依赖5'甲基化帽的翻译 的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。已描述了来源于小核糖核酸病 毒家族（脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎）中的两名成员的IRES元件，以及来源 于哺乳动物信使的IRES。IRES元件可被连接到异源开放阅读框中。多个开放 阅读框可以被一同转录，分别由IRES分离，建立多顺反子信使。凭借IRES元 件，每一个开放阅读框易接近核糖体，进行有效的翻译。多个基因可通过使 用单个启动子/增强子转录单个信使而被高效表达。

任何异源开放阅读框可以被连接到IRES元件上。这包括由独立的基因编 码的分泌蛋白基因、多亚单位蛋白基因，细胞内或膜结合蛋白基因和可选择 的标记物基因。用这种方法，可通过单一构建体和单一选择性标记物将若干 蛋白的表达同时构建到细胞中。

试剂盒

在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括一种或一种以 上本文所提供的RNA寡核苷酸。这些寡核苷酸可以包括一个或一个以上修饰 的核酸碱基，更短或更长的片段，修饰后的键和类似物。在另一方面，本发 明提供靶向细胞的核酸序列和分子的试剂盒，所述细胞的核酸序列和分子与 在治疗诸如感染性疾病生物体、AMD、血管生成相关疾病、癌症、自身免疫 疾病等的疾病中调节免疫反应有关。

在一种实施方式中，一种试剂盒包括：（a）本文提供的RNA，和（b） 将治疗有效量的RNA寡核苷酸给药于细胞或个体的说明书。在一些实施方式 中，该试剂盒可以包含用于给药RNA寡核苷酸的药学上可接受的盐或溶液。 任选地，试剂盒可进一步包括标签形式的或单独插页形式的的合适操作参数 的说明。例如，试剂盒可具有告知医生或实验室技术人员制备一定剂量RNA 寡核苷酸的标准说明。

任选地，该试剂盒可以进一步包含一个标准品或对照信息，以便病人样 本可以与对照信息标准比较来确定RNA寡核苷酸的测试量是否为符合例如肿 瘤缩小的治疗量。

本发明的实施方式可在没有理论研究支持的条件下实施。此外，在理论 研究存在的条件下，可理解的是申请人不受已有理论的约束。

实施例

应当理解的是，下面的实施例仅用于阐明本发明，但不限制本发明。

需要说明的是，如果不指定，以下实施例中的百分比都是重量百分比含 量wt%。

实施例1

为了开发可通过激活TLR3抑制CNV的基于sliRNA的眼药，我们选择肠道 病毒作为sliRNA的设计模板。肠道病毒是一组直径为20nm至30nm的ssRNA病 毒。在血清型分类上，它们有67种。我们选择了病毒的高度保守的5’非翻译区 （5’UTR）作为模板来设计靶RNA。我们也选择ORF和3’UTR的高度变异序列 作为模板设计对照RNA。分别将基于以上设计的化学合成的小RNA玻璃体内 注射到小鼠CNV模型的眼中。结果显示来源于高度保守的RNA序列（5’UTR） 的CNV抑制效率明显高于那些通过位于ORF和3’UTR中的高度变异区序列设 计的RNA。我们也发现在眼组织样品中，与两个RNA对照组相比，基于高度 保守的RNA序列的CNV的抑制上调了TLR3和它的信号通路蛋白-IL12（白介素 12）的mRNA水平并下调了VEGF mRNA水平。

这些数据证实病毒基因组中高度保守区序列可以用作设计TLR3RNA配 体（小配体RNA，sliRNA）的模板。通过有效和序列依赖性激活TLR3通路， sliRNA可以潜在用于治疗AMD的CNV和其它病理性血管生成相关疾病，诸如 糖尿病视网膜病变、癌症等。

我们首先发现作为有效激活TLR3配体的RNA靶模板序列位于肠道病毒 （包含67种小RNA病毒）的高度保守5’UTR区。序列（SEQ ID NO:1）如下：

1 ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt

61 accccggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctttcc caagtaactt tagaagaaat

121 aaactaatgt tcaacaggag ggggtacaaa ccagtaccac cacgaacaca cacttctgtt

181 tccccggtga agttgcatag actgtaccca cggttgaaag cgatgaatcc gttacccgct

241 taggtacttc gagaagccta gtatcatctt ggaatcttcg atgcgttgcg atcagcactc

301 taccccgagt gtagcttggg tcgatgagtc tggacacccc acaccggcga cggtggtcca

361 ggctgcgttg gcggcctacc catggctagc accatgggac gctagttgtg aacaaggtgc

421 gaagagccta ttgagctacc tgagagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaacca

481 cggagcaaat gctcacaatc cagtgagtgg tttgtcgtaa tgcgcaagtc tgtggcggaa

541 ccgactactt tgggcgtccg tgtttccttt tatttttatt atggctgctt atggtgacaa

601 tctgagattg ttatcatata gctattggat tagccatccg gtga

(SEQ ID NO:1).

经与NCBI数据库中RNA病毒基因组比对，我们发现RNA病毒基因组的 5’UTR是高度保守的（图17a）。并且5’UTR高度保守区与脊髓灰质炎病毒、 柯萨奇病毒、埃可病毒和肠道病毒68-71、微小RNA病毒具有同源性。

我们用5’UTR高度保守区作为模板设计激活TLR3的sliRNA。随机设计的 sliRNA与四种、两种或一种病毒同源，与四种病毒同源的sliRNA与人类编码 基因不同源。

表1：随机设计sliRNA的基因库比对

选择与四种病毒同源的siEv70_2进行体外实验验证。

细胞水平检测NF-κB活性

双链病毒RNA（dsRNA）被TLR3识别。病毒dsRNA结合到TLR3启动IL12、 IFN-γ诱导的天然免疫应答。我们本研究的目的是检测在SMCC-7721细胞中由 siEv70_2诱导的NF-κB活性，用报道的TLR3激动剂Poly(I:C)（Invivogen，美国） 作为阳性对照。种植SMCC-7721细胞并按操作说明用脂质体（lipofectamine） 2000（Invitrogen，美国）转染pNF-κB-TA-luc质粒（图18a）。pNF-κB-TA-luc 质粒上有可以诱导萤火虫荧光素酶表达的NF-κB的结合位点，。

SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基（Invitrogen，美国） 培养，转染pNF-κB-TA-luc和pRL-SV40质粒（Promega，美国）（含海肾荧 光素酶基因的pRL-SV40作为内部对照）。转染后6小时，用含siEv70_2或 Poly(I:C)的培养基进行换液。24小时后，按操作说明在生物发光检测仪（BioTek  Synergy HT，美国）上用双荧光素酶测试试剂盒（Promega，美国）检测NF-κB 的转录活性。

结果：根据萤火虫荧光素酶发光值/海肾荧光素酶发光值，我们比较了 siEv70_2与Poly(I:C)诱导的NF-κB的活性。siEv70_2和Poly(I:C)组之间的单因素 方差分析显示前者NF-κB活性比后者高得多（P＜0.001），这说明siEv70_2作 为TLR3的激动剂强于Poly(I:C)（图18b）。

动脉环试验

按Mangiameli等人（Mangiameli等人，J Transl Med2007;5:38）先前所描 述的，用体外大鼠动脉环试验研究抗血管生成。24孔板用150μL的基质胶（BD， 美国）包被。从6-8周龄的雄性SD大鼠上取胸主动脉并立即转移到含冷冻无血 清的DMEM培养基（Gibco，美国）的培养盘中。用微型解剖镊和虹膜切开剪 小心去除主动脉周围的纤维脂肪组织，注意不要损伤动脉壁。主动脉沿横切 面切成1mm长，用内皮细胞培养液（ECM）漂洗数次。主动脉环放到24孔板 中并用另一50μL基质胶包被。主动脉环用1mL的内皮细胞培养基培养2天。培 养板置于37℃、加湿CO₂中，并每天换液。当微血管开始分支时，留一些含主 动脉环的孔作为对照，其它孔用siEv70_2、阿瓦斯汀和5%葡萄糖处理。培养 板再培养4天。该检测以双盲方式从0（最小阳性）到5（最大阳性）的进行评 分。每个数据点测定6次。

结果：对主动脉环进行评分，每组6个重复，比较每组的平均分值。siEv70_2 和阿瓦斯汀均抑制了主动脉环血管发芽。siEv70_2和5%葡萄糖组之间的单因 素方差分析显示出显著误差（P<0.001）（图20）。

DNA-RNA杂交链和dsDNA链：

注意：siEv70_6是DNA-RNA杂交链，siEv70_7是dsDNA链。

根据以上序列设计的双链sliRNA的长度小于30bp。sliRNA作为胞膜TLR3 的外源性配体来激活TLR3的信号通路，从而抑制病理性血管生成相关疾病。

sliRNA序列位于上述核酸模板的241-263碱基对处，其序列如下：

正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’(SEQ ID NO.:14)

反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’(SEQ ID NO:15)，

或：

正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3’(SEQ ID NO:28)

反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3’(SEQ ID NO:29)，

其中，N是碱基，其可为胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、尿 嘧啶（U）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧腺苷（dA）、或脱氧 胸苷（dT）；n是0～2的整数。

换句话说，双链sliRNA分子的主链序列为：

正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUA-3’(SEQ ID NO:2)

反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUA-3’(SEQ ID NO:3)，

或子序列：

正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCC-3’(SEQ ID NO:30)

反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCU-3’(SEQ ID NO:31)。

在优选的实施方式中，3’端的“Nn“序列是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。

特别地，可以从SEQ ID NO:1序列中选择sliRNA。

为了验证本发明的设计思想，用作为高度同源的靶序列且与人类基因组 非同源的肠道病毒Ev70（基因库登录号：DQ201177）的5’UTR作为模板设计 sliRNA；用ORF和3’UTR非保守区作为模板设计阴性对照sliRNA。VEGF抗体 药阿瓦斯汀作为阳性对照。设计了如下实验方案来测试sliRNA治疗病理性血 管生成相关疾病的效果：

1）建立CNV小鼠模型，使其新脉络膜血管生成的病理状况接近于人AMD 疾病。

2）用荧光染色的方法评价sliRNA对CNV的作用。

3）用定量RT-PCR的技术比较sliRNA治疗前后的CNV小鼠视网膜组织中 TLR3、VEGF、KDR和IL12a的基因表达。

我们用小鼠作为AMD动物模型，药物剂型为双链特异性sliRNA冻干粉。

实施例2

AMD动物模型的建立

仪器、试剂和材料

仪器：5.4mm手持式接触镜（Ocular Instruments，Bellevue，WA，美国）， 氪红激光光凝仪（Lumenis,美国）、荧光显微镜（Eclipse TS100；Nikon，Tokyo， 日本），眼前节裂隙灯显微照相系统（Coherent,Novus2000，美国），共焦 激光视网膜断层扫描仪（Heidelberg retinatomo-graph II，HRT II;Heidelberg， 德国），Karl Storz兽医检查内镜（STORZ，德国）。

实验动物：C57BL/6J小鼠，体重20-30g。

材料和试剂：0.3%戊巴比妥钠（45mg/kg），复方托吡卡胺和去氧肾上腺 素（Alcon Fort Worth,TX，美国），10%荧光素钠（广西梧州制药股份有限公 司），4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司），4',6-二脒基-2-苯基吲哚 盐酸盐（DAPI），与Alexa Fluor488结合的鬼笔环肽和与Alexa Fluor568结合 的同工凝集素-B4（Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR）。

CNV动物模型构建

通过激光光凝法诱导CNV。简言之，通过腹腔内注射（i.p.）45mg/kg戊 巴比妥钠对C57BL/6J小鼠进行麻醉，1%复方托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素的 混合物扩瞳。用氪红色激光光源（波长647.1nm，功率260mW，斑点大小50μm， 照射时间0.05s）诱导激光光凝。激光束通过角膜前5.4mm手持式接触镜和裂 隙灯显微照相系统传递。在视盘周围6点和12点方向，距视盘2个视乳头直径 的位置产生两个缺损点，有气泡产生说明激光照射时Bruch膜被击破，认为产 生损伤。后续评价中排除无气泡产生或有视网膜出血的损伤。操作者戴上面 具，用眼底照相检查激光烧伤的一般条件，眼底荧光血管造影（FFA）和平铺 的巩膜-脉络膜/视网膜色素上皮复合物的荧光染色评价CNV面积。

眼底照相和眼底荧光血管造影（FFA）

全身麻醉的情况下进行眼底照相检查（戊巴比妥钠，0.3%，45mg/kg，i.p.）， 并且用带有Nikon D90数码相机的Karl Storz兽医内镜进行扩瞳（局部1%托吡 卡胺和2.5%去氧肾上腺素）。

眼底镜检查后，用共聚焦激光同步血管造影系统（Heidelberg  retinatomo-graph II，HRT II；Heidelberg，德国）进行FFA检查。腹腔内注射 荧光素染料（10mL/kg的2%荧光素钠）后2min、5min、15min及30min拍照， 并在30min时进行血管造影，用于比较不同处理组的功效。

荧光染色

处死动物后摘除眼球。巩膜-脉络膜/RPE复合物铺片用荧光素标记的同工 凝集素-同工凝集素-B4（红色）染色以定量CNV的面积。用DAPI（蓝色）复 染复合物中的细胞核，用鬼笔环肽（绿色）复染复合物中的RPE层。

激光诱导光凝之后第7天，通过IP注射过量戊巴比妥钠处死小鼠。摘出眼 球，放入pH为7.3的4%多聚甲醛的PBS溶液中固定1h。在解剖显微镜下，去除 眼前节，从视神经乳头中剥离并分离视网膜神经上皮层。剩下的眼杯在4℃下 潮湿腔室中用20ng/μl的DAPI溶液、10ng/μl同工凝集素-B4溶液和0.002U/μl鬼 笔环肽溶液培养，同时轻轻晃动持续4小时。将4个放射状切口朝向视神经乳 头，以使巩膜-脉络膜/RPE复合物平铺于载玻片上。封片待查。

荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）观察：将CNV复合物的图像分别 收集在蓝色（DAPI）。红色（同工凝集素-同工凝集素-B4）和绿色（鬼笔环 肽）荧光通道中。在所有通道中，所有图像的分辨率均为1392×1040像素， 深度均为8bit。

眼底照相、FFA和荧光染色验证小鼠CNV模型

在普通的B6小鼠视网膜中，如通过鬼笔环肽染色所示的，RPE细胞以六 边形排列于巩膜-脉络膜/RPE复合物铺片的顶部（图1a），没有观察到来自同 工凝集素-B4的信号（图1b），DAPI标记的RPE细胞核通过叠加图像识别（图 1c）。眼底照片图像显示视网膜上的激光灼烧呈白垩样光斑，认为这是视网 膜急性水肿（图2）。第4天时，灰白色水肿明显。第7天时仍可见视网膜水肿， 出血开始吸收。第14天时视网膜水肿消失，大部分出血被吸收。第28天时由 于色素过度沉着形成瘢痕。FFA检查中，激光光凝后5min，光凝处可见荧光着 色。光凝后第7天，出现圆盘状荧光素渗漏（图3a），第14天时，光斑处荧光 素渗漏逐渐增强（图3b）；第28天时，在激光诱导的光凝斑处观察到较少的 荧光素渗漏，并且出现瘢痕（图3c）。激光诱导的灼烧位于图4d-f中所示的环 形缺损区内。光凝后第4天，在缺损区内部出现一些细胞碎片以及细胞核碎片 （图4g-i）。第7天时，在激光损伤区可以看到同工凝集素-B4染色的CNV网。 RPE细胞覆盖CNV复合物的区域（图4j-l）。在第7天、第14天和第28天时，平 均CNV面积分别为8.03±0.53×10³μm²、16.69±4.78×10³μm²和 15.23±4.47×10³μm²。第14天与第28天的CNV面积相差不大，但与第7天的CNV 面积相比，第14天与第28天的面积均明显增加。

本实施例说明FFA和荧光染色可用于定性和定量评估氪激光诱导的 CNV。这些方法可为抗血管生成药物的疗效研究提供可靠数据。

实施例3

siRNA的制备和CNV模型的玻璃体内注射

仪器、试剂和材料

寡核苷酸合成仪（GE，美国），微量注射器（Hamilton Co.,Reno,NV， 美国）。

材料和试剂：sliRNA（百奥迈科生物，中国），阿瓦斯汀（Genentech， 美国），5%葡萄糖溶液（百奥迈科生物，中国）等。

sliRNA序列：

*siEv70_2为肠道病毒70（EV70）高度保守序列。siEv70_1、siEv70_3、 siEv70_4、siEv70_5为非保守序列。序列来源于基因库登录号：DQ201177。

sliRNA设计

人肠道病毒70（EV70）的5’UTR区为肠道病毒家族中高度保守并且经 NCBI核酸序列数据库中比对其与人基因组没有同源性。我们综合考虑sliRNA 的二级结构的稳定性、Tm值和GC含量设计了sliRNA序列。我们选择病毒基因 组的保守区作为模板来设计靶向TLR3的sliRNA，并且选择病毒基因组ORF和 3’UTR的非保守区作为模板来设计阴性对照sliRNA。

sliRNA化学合成

通过寡核苷酸合成仪（GE，美国）合成并纯化sliRNA正义链和反义链。 将正义链和互补的反义链退火以形成sliRNA双链并冷冻（1OD/管）。

玻璃体内注射sliRNA

将sliRNA双链的冻干粉用5%葡萄糖溶液溶解，得到溶液浓度为1-2μg/μL。 将1μL sliRNA玻璃体内注射到CNV模型的双眼。玻璃体内注射阿瓦斯汀（1μL/ 眼，25mg/mL）、VEGF抗体药物作为阳性对照。具体注射方法包括：1）前 房穿刺，2）放出少许房水，3）在解剖显微镜下，在距角膜缘约1mm的位置， 用带有32-g针头的2.5μL哈密尔顿注射器（Hamilton Co.,Reno,NV）将sliRNA 溶液注射入玻璃体腔内。

在不同时间点，进行眼底摄像检查、FFA检查、荧光染色以比较不同处理 之后的CNV。ImageJ软件用于定量CNV的密度和面积。

实施例4

通过荧光染色筛选sliRNA靶标

仪器、试剂和材料

仪器：5.4mm手持式接触镜（Ocular Instruments，Bellevue，WA），氪红 色激光光凝仪（Lumenis，美国）、荧光显微镜（Eclipse TS10；Nikon，Tokyo， 日本），眼前节裂隙灯显微照相系统（Coherent,Novus2000，美国），共焦 激光视网膜断层扫描仪（Heidelberg retinatomo-graph II，HRT II；Heidelberg， 德国）等。

材料和试剂：0.3%戊巴比妥钠（45mg/kg），盐酸丙美卡因 （S.A.ALCON-COUVERUR N.V），1%复方托吡卡胺（日本参天制药株式会 社），10%荧光素钠（广西梧州制药股份有限公司），4%多聚甲醛（国药集 团化学试剂有限公司）等。

荧光染料：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），与Alexa Fluor488结合的 鬼笔环肽（Invitrogen-Molecular Probes,Eugene,OR）以及与Alexa Fluor568结 合的同工凝集素-B4（Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR）等。

组织铺片及荧光染色

摘除眼球用于巩膜-脉络膜/RPE复合物铺片。用荧光染料DAPI（蓝色）、 同工凝集素-B4（红色）及鬼笔环肽（绿色）分别对细胞核、内皮细胞和RPE 进行染色。

巩膜-脉络膜/RPE铺片及染色：在视网膜的激光光凝后5min、4天、7天、 14天和28天将小鼠处死。摘出眼球并立即放入pH为7.3的4%多聚甲醛的PBS溶 液中固定1小时。在解剖显微镜下，去除眼前节，从视神经乳头中剥离并分离 视网膜神经上皮层。剩下的眼杯在4℃下潮湿腔室中用20ng/μL的DAPI溶液、 10ng/μL的同工凝集素-B4溶液和0.002U/μL的鬼笔环肽溶液培养，并轻轻晃动 持续4小时。使4个放射状切口朝向视神经乳头以使巩膜-脉络膜/RPE复合物在 载玻片上平铺。覆盖样品并密封用于显微镜分析。

荧光显微镜检查：在荧光显微镜下观察CNV的形态。使用蓝色（DAPI）、 红色（同工凝集素-B4）和绿色（鬼笔环肽）通道分别获得CNV复合物图像。 所有通道中，所有图象采用1392×1040像素的分辨率和8bit的深度记录。

结果分析

激光光凝后7天的样本用作对照（Campos等人，2006）。细胞核、内皮 细胞和RPE分别由荧光DAPI（蓝色）、同工凝集素-B4（红色）和鬼笔环肽（绿 色）标记（图5-12）。

同工凝集素-B4（红色）对内皮细胞进行染色，以评估血管新生（CNV）， 红色通道的图像用于评估sliRNA和阿瓦斯汀处理的CNV的抑制效力。与阴性 对照组（图5、图6）相比较，siEv70_2处理组（图9）和阿瓦斯汀阳性对照组 （图7）中的CNV的面积显著减小。在其它组（图8、图10、图11、图12）中 没有观察到CNV抑制作用。

ImageJ图像分析软件用于定量CNV的平均面积。各个处理组的CNV平均面积 小于阴性对照，siEv70_2处理组明显进一步小于其它处理组。（图13）

实施例5

对TLR3激活的定量RT-PCR分析

仪器、试剂和材料

iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国），离心机（Eppendorf，德国）， 玻璃匀浆器等。

材料和试剂：96孔qPCR板（Bio-rad，美国），RISO^TMRNA提取试剂（百 奥迈科生物，中国），SYBR Green I（Invitrogen，美国），Icycler iQ标准液 （Bio-rad，美国），AMV反转录试剂盒（Promega，美国），Taq DNA聚合 酶（百奥迈科生物，中国）、阿瓦斯汀（Genentech，美国）等。

用于定量RT-PCR分析的引物：

处理的小鼠CNV模型与未处理组：

编号 组 处理方法 1 正常 未处理 2 激光诱导 未处理 3 阿瓦斯汀 阿瓦斯汀（25mg/ml，1μl） 4 GS 葡萄糖溶液（5%（m/v），1μl） 5 siEv70_2 sliRNA（1μg/μL，1μL） 6 siEv70_3 sliRNA（1μg/μL，1μL） 7 siEv70_4 sliRNA（1μg/μL，1μL） 8 siEv70_5 sliRNA（1μg/μL，1μL）

定量RT-PCR

从CNV小鼠模型眼球分离RNA

在1mL RISO试剂中将整个眼球进行匀浆并在15-30℃孵育5min以分离核 蛋白复合物，加入0.2ml氯仿，用手振荡15s。样品室温静置2-15min，然后 12,000rpm条件下，4℃离心15min。离心后，混合物分为三相：红色底相含酚 氯仿提取物；中间相；和无色上清水相。只有RNA保留在无色水相中。将0.4mL 的水相转移到干净的管中，并加入0.4mL的异丙醇沉淀RNA。混合物在12,000 rpm，4℃离心10min得到RNA沉淀。用1ml的75%乙醇洗涤RNA沉淀，混合物 再次在12,000rpm，4℃离心10min得到RNA沉淀。弃掉上清后，空气干燥沉淀 5-10min。在260-280nm吸收波长处检测RNA的纯度和量。进一步用甲醛变性 琼脂糖电泳分析RNA的完整性和纯度。

反转录酶合成cDNA第一链：将提取的RNA用AMV逆转录酶反转录，从 而合成cDNA第一链。将1μg RNA模板在70℃加热10min，随后取出置冰上 5min。反应混合物包含：5μlL的5×逆转录缓冲液，1μg Oligo(dT)₁₅，2.5μl dNTP， 40单位的RNA核糖核酸酶抑制剂，30单位AMV逆转录酶。通过添加无RNase 的水将最终反应体积调节至25μl。反应置于42℃下进行1小时并通过添加 ddH₂O至体积为200μl结束反应。

定量RT-PCR：用基因特异性引物检测样本中三种基因IL12a、TLR3、VEGF 的mRNA表达水平，同时使用管家基因GAPDH作为加载对照。25μl反应混合 物包括：5μl模板cDNA，2.5μl10×PCR缓冲液，0.5μl dNTP（每种10mM）， 0.5μl5’引物（10μM），0.5μl3’引物（10μM），1.5μl SYBR Green I（2000 倍稀释），0.25μl Icycler iQ标准液（100倍稀释），0.25μl Taq DNA聚合酶， 14μLddH₂O。PCR反应循环45次：95℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火 30s，72℃延伸30s。

结果分析：

图14显示各实验处理组中VEGF mRNA的水平：激光诱导而未处理的眼睛 中VEGF mRNA的水平显著高于处理组中的VEGF mRNA的水平，siEv70_2处 理组中VEGF mRNA的水平在统计学意义上最低。

图15显示各处理组中TLR3mRNA的水平：siEv70_2处理组中TLR3mRNA 的水平比正常对照组高。并且其它处理组与正常对照组相比没有显著差异。

图16显示各处理组中IL12a mRNA的水平：siEv70_2处理组中IL12a mRNA 的水平比正常对照组高。并且其它处理组与正常对照组相比没有显著变化。

虽然sliRNA根据位于241-263nt的肠道病毒基因组的高度保守区设计并且 在C57BL/6J小鼠CNV模型中证实了其抗AMD效力，但是设计的基本原则可扩 展到任何种类的病毒高度保守区并且可进行任何改变和应用。

虽然本文描述并显示了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人 员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是为了举例说明。本领域的技术人 员显然可作出多种修改、改变和替换而不偏离本发明。应当理解的是，本文 描述的本发明实施方式的各种替代方案可以用于实施本发明。后附的权利要 求意在限定本发明的范围和覆盖这些权利要求的范围及其等同范围内的方法 和结构。

实施例6

siEv70_2通过TLR3抑制CNV的剂量依赖性

AMD动物的模型构建，sliRNA制备、玻璃体内注射、脉络膜铺片和荧光 染色的具体操作步骤与实施例1-4相同。

sliRNA双链冻干粉用5%葡萄糖溶液分别稀释至终浓度0.2μg/μL、2μg/μL 和10μg/μL。激光损伤后48小时，将1μL的sliRNA玻璃体内注射至CNV小鼠的 双眼内。玻璃体内注射聚肌苷-聚胞苷酸（Poly(I:C)）（1μL/眼，0.2μg/μL） 和0.5%（m/v）葡萄糖溶液分别作为阳性对照和阴性对照。Poly(I:C)是一种合 成的双链RNA模拟物，其存在于一些病毒中。已知Poly(I:C)与在一些哺乳动物 细胞的细胞膜内表达的TLR3相互作用，激活核因子κB（NF-κB）通路，产生I 型干扰素（IFN）和细胞因子（Alexopoulou et al.Nature，2001；413，732-8）。

激光诱导光凝后12天，处死小鼠并摘出眼球。将所有眼杯进行铺片并用 特定的荧光染料染色。用Image J软件计算CNV密度和面积。

处理的CNV小鼠模型与未处理组：

编号 组 处理方法 1 未处理 激光诱导未注射 2 GS 注射5%（m/v）葡萄糖溶液 3 poly(I:C) poly(I:C)（0.2μg/眼）（InvivoGen，美国） 4 siEv70_2(0.2μg) siEv70_2（0.2μg/眼） 5 siEv70_2(2μg) siEv70_2（2μg/眼） 6 siEv70_2(10μg) siEv70_2（10μg/眼）

结果分析

评价CNV小鼠中注射siEv70_2抑制激光诱导的CNV的量效关系。未处理 组或注射介质GS作为阴性对照，注射Poly(I:C)作为阳性对照。

如图21所示的代表性图，内皮细胞用同工凝集素-B4（红色）染色，用于 评价新生血管生成（CNV），红色通道的照片用于评价sliRNA和Poly(I:C)处 理后抑制CNV的效果。与未处理组（图21a-c）和阴性对照组（图21d-f）相比， siEv70_2（2μg）（图21m-o）、siEv70_2（10μg）（图21p-r）处理组和Poly(I:C) 阳性对照组（图21g-i）的CNV面积显著减少。siEv70_2（0.2μg）处理组（图 21j-l）中没有观察到CNV抑制效果。

统计学分析显示，与未处理组相比，siEv70_2（2μg）、siEv70_2（10μg） 和Poly(I:C)分别显著抑制了CNV的66.0%（P<0.001）、64.0%（P<0.001）和47% （P<0.001）。然而，与未处理组相比，siEv70_2（0.2μg/眼）和GS处理组没 有显著的CNV抑制。

实施例7

BM01通过TLR3抑制CNV

BM01是siEv70_2的子序列，序列如下：

正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCdTdT-3’(SEQ ID NO:32)

反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUdTdT-3’(SEQ ID NO:33)。

AMD的动物模型构建，sliRNA制备、玻璃体内注射、脉络膜铺片和荧光 染色的具体操作步骤与实施例1-4相同。sliRNA双链冻干粉用5%葡萄糖溶液稀 释至终浓度2μg/μL。激光损伤后48小时，将1μL的sliRNA玻璃体内注射至CNV 小鼠的双眼中。玻璃体内注射Poly(I:C)（1μL/眼，0.2μg/μL）和0.5%（m/v） 葡萄糖溶液分别作为阳性对照和阴性对照。

激光诱导光凝后12天，处死小鼠并摘出眼球。将所有眼杯进行铺片并用 特定荧光染料染色。用Image J软件计算CNV密度和面积。

小鼠CNV模型处理组与未处理组：

编号 组 处理方法 1 未处理 激光诱导没有注射 2 GS 注射5%（m/v）葡萄糖溶液 3 poly(I:C) poly(I:C)(0.2μg/眼)（InvivoGen，美国） 4 BM01 BM01(2μg/眼)（百奥迈科生物，中国）

结果分析

在激光诱导的CNV小鼠中评价玻璃体内注射BM01对CNV的抑制作用。未 处理组或注射介质GS作为阴性对照，注射Poly(I:C)作为阳性对照。代表性的 图（图23）显示与未处理组（图23a-c）和阴性对照组（图23d-f）相比，BM01 处理组和Poly(I:C)处理组（图23j-l和图23g-i）的CNV面积显著减少。

统计学分析显示，与未处理组相比，BM01和Poly(I:C)分别抑制CNV的 52.0%(P<0.001)和47%(P<0.001)。