鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺

摘要

本发明涉及一种鸡球虫病防治制剂，具体为一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺。解决鸡球虫病预防及治疗的问题。鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，然后制成微胶囊，所述微胶囊制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.05-0.8%（w/v）、CaCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡球虫病防治制剂，具体为一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺。 

背景技术

鸡球虫病（coccidiosis）是由顶复器门艾美耳属的艾美耳球虫中的一种或几种寄生于鸡肠道粘膜上皮内引起的一种寄生性原虫病。Coccidiosis是一种普遍发生，危害十分严重的疾病。寄生于鸡体内的艾美耳球虫据报道有9种之多，其中作为病原体而引起重视的有柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫（E. acervulina）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）、毒害艾美耳球虫（E. necatrix）、布氏艾美耳球虫（E. brunetti）五种。柔嫩艾美耳球虫是鸡球虫中最常见、致病力最强的一种，主要侵害鸡盲肠及其附近区域。15～30日龄雏鸡发病率最高，可达50%～70%，死亡率为20%～30%，严重时高达80%以上；发病耐过的雏鸡生长发育变慢，成年鸡则很少发病，少数为带虫者，但对蛋鸡产蛋影响较大。据Allen报道世界各地每年仅球虫病造成的经济损失就达80亿美元。随着集约化养鸡业的日益发展和耐药性虫株的不断出现，本病的危害将日趋严重，因此，如何防治本病是目前养鸡业的重要课题之一。 

在现阶段鸡球虫病仍然是以化学药物为主要防治手段，但药物防治面临着日益严重的三大问题的困扰：耐药虫株的出现速度超过了新药的研制开发速度，并且耐药虫株的产生还会造成多种球虫混合感染难以控制的恶性循环；药物残留严重危害人类健康和影响禽产品出口；化学药物防治球虫病对免疫力产生抑制。而且现有的抗球虫药主要在球虫感染的早期或中期（无性繁殖期），但对感染出现血便等临床症状后球虫的有性繁殖期及抗损伤作用甚微或无作用。因此，鸡感染球虫后一旦出现临床症状，目前所用的抗球虫药就收效甚微，从而使鸡球虫病的死亡率居高不下，给养鸡业带来巨大的经济损失。再者使用这些药物血药浓度常出现“峰谷”现象，且毒性强，动物应激大、使用不便；鉴于化学防治的上述缺陷，提出了球虫病免疫预防和治疗手段，高免血清和高免卵黄可与各个阶段的球虫进行特异性结合，将其特异性清除或杀灭，或使其致病力减弱，但因血清数量有限, 成本高和易出现过敏反应等不易广泛使用。 

故本发明研究方向选择了来源广泛、成本低、无过敏反应且有营养作用的高免卵黄抗体（IgY）进行研究，以免疫治疗和免疫防御为手段，控制鸡球虫病的发生以及用于治疗。E.tenella特异性卵黄抗体(IgY)在体外能结合在E.tenella子孢子的表皮膜抗原上，有降低子孢子的致病力和溶解子孢子作用；实验还发现E.tenella子孢子与特异性卵黄抗体在体外随作用时间的延长其数量逐渐减少,作用24h子孢子可减少47.6%，而且随作用时间的变化,子孢子由原来的香蕉形或长纺锤形变为葫芦形、梭形、梨形和小杆状等,并断裂、轮廓模糊不清。我们的研究结果还表明：IgY在鸡口服3h后开始出现于盲肠中，6h达到高峰，抗体滴度为7.75，IgY的效价较原液降低了3个滴度，在6h以后IgY的浓度逐渐下降，在口服后10h时降低到3.00。鉴于上述研究结果，所以有必要研究开发一种口服缓释制剂，使卵黄抗体靶向作用位点时减少抗体滴度的损耗，并且可使IgY以足够的浓度在靶位点（鸡盲肠及其附近区域）长效作用，这也是本研究的主要目的之一。该制剂可以降低IgY滴度的损耗，提高非缓释性IgY在肠道中的效价1~2个滴度，从而减少卵黄抗体的使用量以及增强药效的发挥。 

通过缓释技术可改善药物在体内的药物动力学特征，提高生物利用度，延长药物有效浓度的持续时间，减少给药次数，增强疗效、减轻禽群的应激。缓释剂是一种现代给药系统，可较持久地传递药物，用药后能在较长时间持续释药以达到长效作用的制剂，从而可减少给药次数与剂量。口服虽然是最常用和较方便的一种给药方式，但在实际应用中药物释放往往受到胃肠道排空速率的影响，口服生物粘附微球与一般缓释制剂相比，扩大了与胃肠道的接触面积，并且由于使用了生物粘附性材料，微球长时间地粘附于胃肠道粘膜上，延长了释药时间，有利于药物的释放与吸收。如果时间和资金允许，本研究还将尝试筛选一种生物黏附性材料，使E.tenella特异性 IgY 缓释剂能够黏附在鸡盲肠内及其附近区域持续作用。 

综上所述，鸡E.tenella只在肠道生存，特异性IgY作为靶向药物只有在肠道保持有效浓度才能抑杀球虫。但IgY经过胃的强酸性环境时，其活性易被破坏。为此，利用特异性抗E.tenella卵黄抗体(IgY)，研究能够特异性地针对E.tenella发育不同阶段的虫体，在鸡体内抑杀柔嫩艾美耳球虫的靶向长效生物防治技术和药物显得十分迫切和重要。 

发明内容

本发明为了解决鸡球虫病预防及治疗的问题，提供了一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺。 

本发明的技术方案是，一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，然后制成微胶囊，所述微胶囊制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.05-0.8%（w/v）、CaCl₂浓度0.5-1.5%（w/v）、海藻酸钠浓度1.0-3.0%（w/v）、IgY与海藻酸钠质量比为1-4：8。 

具体方法是（1）高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，步骤为：通过给健康雏鸡攻毒E.tenella，利用鸡只传代扩增，获得抗原；然后给健康蛋鸡口服抗原，收集高免蛋；对高免蛋分离卵黄得到卵黄原液；卵黄原液用预冷灭菌蒸馏水按体积比1:6-12稀释，用0.1mol/L HCL调pH至5.1，充分搅拌后4℃静置8h，离心，收集上清液即为卵黄水溶性组分；采用辛酸-冷乙醇抽提法或硫酸铵二次沉淀法对IgY进行分离、提取得到IgY。 

（2）制备微胶囊：制备微胶囊：成囊液的制备：称取壳聚糖，加入冰乙酸搅拌溶解，加去离子水配制成壳聚糖（w/v）溶液，加入CaCl₂，溶解，真空脱气；IgY溶于的海藻酸钠溶液中，将上述溶液滴到成囊液中，反应所得微囊经去离子水洗涤，真空冷冻干燥，即得微胶囊。 

在本发明中，作为口服缓释制剂微胶囊的主要特点在于保护其内的活性物质，抵抗胃液和肠液的腐蚀。使卵黄抗体靶向作用位点时减少抗体滴度的损耗，并且可使IgY以足够的浓度在靶位点（鸡盲肠及其附近区域）长效作用，所以微胶囊的制备技术就是本发明的关键的重要特征之一。 

具体来说1. 本发明所述微胶囊保护和缓释效果的体内研究，无球虫感染的SPF鸡只口服含有等量活性IgY（ 40ug）的未胶囊化卵黄抗体和投药比为2:8的胶囊化卵黄抗体，1h后捕杀检测盲肠中的IgY含量，结果表明：二者在口服3h后均在盲肠中出现，此时未胶囊化的卵黄抗体每10g盲肠内容物中的含量仅为1.91 μg, 而胶囊化的卵黄抗体检出量为4.63ug/10g，5h时，未胶囊化的卵黄抗体浓度和胶囊化卵黄抗体浓度均达到最高水平，前者3.161.91 μg，后者为8.38 μg，然后逐渐下降。10h时，已检测不到未胶囊化卵黄抗体，而此时，胶囊化卵黄抗体的浓度仍为4.37ug/10g。由此可见制备的胶囊不仅对卵黄抗体起到了保护效果，并且还起到了药物的缓释效果，能在盲肠部位持续特异性作用。 

  2. 对E. Tenella感染鸡只的保护效果研究，从攻毒的同时和攻毒后96h开始口服卵黄抗体结果表明：随着口服胶囊化卵黄抗体量的增加, 感染E. tenella鸡的死亡率均下降, 增重率和ACI增高。每天口服1次胶囊化卵黄抗体, 与攻毒对照组相比死亡率降低了53. 34%, 增重率和ACI分别提高了49. 19%和72. 40。但未胶囊化卵黄抗体组在同等剂量下，死亡率只下降了14.8%，增重率和ACI分别只提高了18.6%和32.1%。说明IgY在盲肠中与球虫子孢子和裂殖子相遇, 能部分溶解子孢子和裂殖子, 减弱球虫子孢子和裂殖子的毒力,降低虫体的侵袭力, 从而降低了虫体的致病力。 

综上所述：本发明确定了以海藻酸钠和壳聚糖为壁材的适合肠道给药的微胶囊制备工艺。通过缓释技术可改善药物在体内的药物动力学特征，提高生物利用度，延长药物有效浓度的持续时间，减少给药次数，增强疗效、减轻禽群的应激。 

该缓释剂的研制成功对鸡球虫病的发生及治疗具有重要的临床意义和经济意义。该制剂为一种高效、安全的新剂型，既可以作为鸡球虫病的预防药物，也可以作为出现临床症状的鸡只的球虫病治疗药物。与其他抗球虫药物相比，可使鸡球虫病的发病率和死亡率明显降低，每羽鸡估计可增加收入0.3~0.6元。 

与未胶囊化的IgY相比，体内体外试验结果均表明该工艺制备的IgY胶囊不仅具有保护效果，更具有缓释功能，可使卵黄抗体以较高的浓度在鸡盲肠中长时间持续作用。 

在攻毒试验中，与攻毒对照组相比，胶囊饲喂组鸡只死亡率降低了53. 34%, 增重率和ACI分别提高了49. 19%和72. 40。因此该胶囊不仅降低了因鸡只死亡而带来的直接经济损失，同时也减少了抗球虫化学药物的使用，节约了成本；增重率和ACI的提高增加了养殖效率，带来直接经济效益。由于可减少抗球虫化学药物的使用，因此降低了鸡肉中兽药残留，提高了鸡肉品质，可增加出口。同时避免了化学药物使用特异性不强，对鸡只产生免疫抑制、降低产蛋率的缺陷，具有间接经济意义。 

总之这是一种高效安全的新型兽药生产技术，首次应用缓释技术研制抗E.tenella球虫卵黄抗体生物靶向缓释制剂。该制剂克服了抗球虫药的诸多缺陷，特别是克服了耐药性虫株的产生，具有抗球虫效力强、无公害、IgY肠道有效浓度持续时间长的优点。该药物能特异性地针对E.tenella发育不同阶段的虫体，具有抗球虫化学药物无法比拟的优点。本发明对胶囊制备过程中的包埋率、载药量、投药比以及成品胶囊的性能均做了深入的研究，按此工艺可制备其他抗原或肠道病原微生物的IgY胶囊或IgG胶囊。 

本发明所述技术的社会经济效益及推广应用前景，目前，我国已成为世界第一养鸡大国，饲养量在100亿只以上，我省鸡现有量在1.2亿只左右，并有不断发展的趋势。但由于诸多原因，家禽疫病的不断发生严重地影响了我国养禽业的发展，其中鸡球虫病是制约养禽业发展的瓶颈之一。目前平均每羽耗用抗球虫药费按0.2元～0.3元计算的话，则每年用于抗球虫药的费用就高达20～30亿元人民币。现有的抗球虫药物作为鸡球虫病的预防药物尚有一定的作用，但作为鸡球虫病的治疗药物其效果甚微，特别是到鸡球虫病的有性繁殖阶段，几乎无任何效果，死亡率高达80%以上。本发明所述的药物可代替现有的抗球虫病药物，该生物靶向缓释药物可作用于球虫病发生的早期或中期，对出现临床症状的鸡只也有一定的疗效，降低鸡体的死亡率，提高其生产性能，既可以作为鸡球虫病的预防药物，也可以作为出现临床症状的鸡球虫病的治疗药物。与其他抗球虫药物相比，能够将鸡球虫病的发病率和死亡率大幅降低，使鸡生产性能保持稳定，可提高养鸡业效益约10%，增加禽产品出口量，减少因药残对人体造成的危害。 

本发明技术方案制备的IgY微胶囊既是一种预防药物，更是一种治疗药物。本发明制备的微胶囊为抗生素替代疗法提供了很好的范例，并且所确定的工艺也可用来制备其他病原微生物的IgY或IgG微胶囊，具有推广价值，并有利于绿色和有机养鸡业的健康发展。 

附图说明

图1三种脱脂方法沉降效果的比较图 

图2 分离纯化IgY各阶段的SDS-PAGE图

注：1和2都为标准IgY；3.（NH4）2SO4二次沉淀组分；4.辛酸-冷乙醇组5.Marker

图3  IgY热稳定性

图4 IgY的酸稳定性

图5 间接ELISA测IgY含量的标准曲线

图6 不同环境中鸡IgY随随时间的变化曲线

图7 空白微球溶胀曲线

图8微胶囊在模拟消化环境的不同表现状态

图9壳聚糖浓度对BSA微囊的载药量及包封率的影响

图10 不同壳聚糖浓度所制备微囊的BSA释放曲线

图11 CaCl₂浓度对包封率和载药量的影响

图12 不同CaCl₂浓度的释放曲线

图 13 海藻酸钠浓度对包封率和载药量的影响

图 14 不同海藻酸钠浓度的释放曲线

图15 海藻酸钠浓度对BSA微囊的载药量及包封率的影响

图16不同投药比对微囊释放曲线。

具体实施方式

实施例1、一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：（1）高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，具体步骤为：通过给健康雏鸡攻毒E.tenella，利用鸡只传代扩增，获得抗原；然后给健康蛋鸡口服抗原，隔8d免疫一次，共免疫3次，末次免疫收集高免蛋；对高免蛋分离卵黄得到卵黄原液；卵黄原液用预冷灭菌蒸馏水按体积比1:6稀释，用0.1mol/L HCL调pH至4.8，充分搅拌后4℃静置6h，10 000r/min离心15min，收集上清液即为卵黄水溶性组分（WFS）；采用辛酸-冷乙醇抽提法或硫酸铵二次沉淀法对IgY进行分离、提取得到IgY； 

（2）制备微胶囊：制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.1%（w/v）、CaCl₂浓度0.5%（w/v）、海藻酸钠浓度2.0%（w/v）、IgY与海藻酸钠质量比为1︰8；成囊液的制备：称取壳聚糖，加入50mL的10%的冰乙酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1000 mL，配制成0.1%的壳聚糖（w/v），加入CaCl₂，终浓度为0.5%，溶解，真空脱气；IgY溶于2%（w/v）的海藻酸钠溶液中，将上述溶液滴到成囊液中，反应30min后，所得微囊经去离子水洗涤，真空冷冻干燥，即得微胶囊。

实施例2 

一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：（1）高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，具体步骤为：通过给健康雏鸡攻毒E.tenella，利用鸡只传代扩增，获得抗原；然后给健康蛋鸡口服抗原，隔10d免疫一次，共免疫3次，末次免疫收集高免疫蛋；对高免蛋分离卵黄得到卵黄原液；卵黄原液用预冷灭菌蒸馏水按体积比1:9稀释，用0.1mol/L HCL调pH至5.1，充分搅拌后4℃静置8h，10 000r/min离心20min，收集上清液即为卵黄水溶性组分（WFS）；采用辛酸-冷乙醇抽提法或硫酸铵二次沉淀法对IgY进行分离、提取得到IgY；

（2）制备微胶囊：制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.05%（w/v）、CaCl₂浓度1.5%（w/v）、海藻酸钠浓度3.0%（w/v）、IgY与海藻酸钠质量比为4︰8；成囊液的制备：称取壳聚糖，加入50mL的10%的冰乙酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1000 mL，配制成0.05%的壳聚糖（w/v），加入CaCl₂，终浓度为1.0%，溶解，真空脱气；IgY溶于3%（w/v）的海藻酸钠溶液中，将上述溶液滴到成囊液中，反应30min后，所得微囊经去离子水洗涤，真空冷冻干燥，即得微胶囊。

实施例3 

一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：（1）高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，具体步骤为：通过给健康雏鸡攻毒E.tenella，利用鸡只传代扩增，获得抗原；然后给健康蛋鸡口服抗原，隔12d免疫一次，共免疫3次，末次免疫收集高免蛋；对高免蛋分离卵黄得到卵黄原液；卵黄原液用预冷灭菌蒸馏水按体积比1:10稀释，用0.1mol/L HCL调pH至5.5，充分搅拌后4℃静置10h，10 000r/min离心25min，收集上清液即为卵黄水溶性组分（WFS）；采用辛酸-冷乙醇抽提法或硫酸铵二次沉淀法对IgY进行分离、提取得到IgY；（2）制备微胶囊：制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.8%（w/v）、CaCl₂浓度0.5%（w/v）、海藻酸钠浓度1.5%（w/v）、IgY与海藻酸钠质量比为3︰8；成囊液的制备：称取壳聚糖，加入50mL的10%的冰乙酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1000 mL，配制成0.4%的壳聚糖（w/v），加入CaCl₂，终浓度为1.5%，溶解，真空脱气；IgY溶于1.5%（w/v）的海藻酸钠溶液中，将上述溶液滴到成囊液中，反应30min后，所得微囊经去离子水洗涤，真空冷冻干燥，即得微胶囊。

实施例4 

一种鸡柔嫩艾美耳球虫卵黄抗体靶向缓释制剂的制备工艺，步骤为：（1）高免卵黄抗体（IgY）的制备、分离和提纯，具体步骤为：通过给健康雏鸡攻毒E.tenella，利用鸡只传代扩增，获得抗原；然后给健康蛋鸡口服抗原，隔10d免疫一次，共免疫3次，末次免疫收集高免蛋；对高免蛋分离卵黄得到卵黄原液；卵黄原液用预冷灭菌蒸馏水按体积比1:12稀释，用0.1mol/L HCL调pH至5.1，充分搅拌后4℃静置8h，10 000r/min离心30min，收集上清液即为卵黄水溶性组分（WFS）；采用辛酸-冷乙醇抽提法或硫酸铵二次沉淀法对IgY进行分离、提取得到IgY；

（2）制备微胶囊：制备微胶囊的反应条件为：壳聚糖浓度0.3%（w/v）、CaCl₂浓度0.8%（w/v）、海藻酸钠浓度2.0%（w/v）、IgY与海藻酸钠质量比为1︰8；成囊液的制备：称取2g壳聚糖，加入50mL的10%的冰乙酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1000 mL，配制成0.3%的壳聚糖（w/v），加入CaCl₂，终浓度为0.8%，溶解，真空脱气；IgY溶于2%（w/v）的海藻酸钠溶液中，将上述溶液滴到成囊液中，反应30min后，所得微囊经去离子水洗涤，真空冷冻干燥，即得微胶囊。

实验例1：以下为获取IgY条件的确定过程： 

水稀释法最适条件的确定

1卵黄水溶液的最适pH确定

在4.6、4.8、5.0、5.1、5.2、5.5、6.0、7.0等不同pH值下稀释卵黄原液，通过肉眼观看，对不同pH值下上清液混浊度的比较，并测定不同pH下上清液中蛋白质含量和脂肪含量，实验结果见表1、表2，结果显示，卵黄原液通过pH5.1处理后，上清液较为清澈，说明大部分脂质已从卵黄原液中转为沉淀；上清液中脂含量最低，其值为1.42 mg/mL；蛋白质含量最高，其值为4.02 mg/mL，因此pH5.1为提取卵黄水溶液的最适pH值。                  

表1 稀释卵黄液pH对IgY提取效果的影响

  注：+为较少沉淀；++为少量沉淀；+++较多沉淀；

        +为澄清；++较澄清；+++较为浑浊；++++浑浊。

表2 不同pH条件下上清液中蛋白质含量和脂肪含量测定结果 

pH值蛋白质含量（mg/mL）脂肪含量（mg/mL）4.63.25.34.83.314.265.03.62.015.14.02 1.425.23.891.635.53.391.896.03.123.187.03.093.75

2卵黄液的最佳稀释倍数

    在1:4、1:6、1:8、1:9、1:10、1:12不同稀释倍数下稀释卵黄原液，通过Bradford法和氯仿-甲醇法测定上清液中蛋白质含量及脂肪含量，测定结果见表3。结果显示：当稀释倍数达1:12时，上清液中脂肪含量最低，但相比较其总蛋白含量也比较低，而稀释倍数达1:9时，上清液中总蛋白含量最高，并且脂肪含量与最低值相差不大，放置过夜后上清液较清澈，所以确定最佳稀释倍数为1:9；但考虑到后续试验中离心操作，稀释倍数大体积也增大，给分离纯化带来较大的工作量，所以后续试验中采用1:6为稀释倍数。

表3不同稀释倍数下上清液中的蛋白质含量和脂肪含量 

3 卵黄水溶性组分的最佳静置时间

    用8倍体积的预冷双蒸水稀释卵黄水溶液，并调pH至5.1，4 ℃条件下分别放置2 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、15 h和20 h，用肉眼观测到放置8 h以后，上清液的澄清度较好，随着放置时间的延长，上清液的澄清度没有明显变化。

4三种脱脂方法的沉降效果 

从图1可以看出，在前5h柠檬酸钠缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液的脱脂效果明显高于冷酸蒸水，但随着时间的延长三种方法的效果基本持平。考虑到盐对IgY含量的影响，本实验采用冷酸蒸水过夜（>6 h）的方法脱脂。

5 IgY不同浓缩方法的比较 

    取两枚高免蛋，收集卵黄原液约40 mL；然后加5倍于卵黄体积的蒸馏水于卵黄原液中搅拌混匀，等体积分成两份，每份为120 mL；分别用辛酸-冷乙醇和硫酸铵二次沉淀法对IgY分离提取。卵黄抗体分离、提取结果见表4。

表4卵黄抗体分离、提取结果 

待测样品蛋白质含量（mg）IgY含量（mg）IgY提取率（纯度）WFS546.89511921.83 %硫酸铵盐析所得沉淀434.96110.825.47 %硫酸钠二次沉淀、170.77689.852.58 %辛酸抽提上清液417.94100.824.12 %辛酸-冷乙醇沉淀165.40275.245.46 %辛酸-冷乙醇冷冻干燥159.3159.837.54 %

从表中可以看出两种方法对IgY的提取率效果差不多，硫酸铵二次沉淀法提取率较高，但硫酸铵二次沉淀法需在低温超速下离心，提取方法只适用于实验，不适合工厂大规模生产。辛酸-冷乙醇沉淀法，提取率虽低，但提取条件简便，因此，为以后进一步开发利用本实验采用辛酸-冷乙醇沉淀法。

6 IgY的分离及纯化  

由图2可知，辛酸-冷乙醇法和（NH4）2SO4二次沉淀后含有α活性蛋白、β活性蛋白等杂蛋白，电泳条带中含有与标准IgY重链和轻链一致的条带，要想进一步出去杂蛋白，必须通过凝胶过滤，但考虑到本实验为以后微胶囊的制备提供原料，杂蛋白有可能保护IgY通过胃酸进入盲肠，所以不需要对IgY提纯。

  

IgY稳定性检测

1. IgY热稳定性测定

采用不同温度对IgY进行处理后，用间接ELISA法检测残余特异性IgY与抗原结合活性。从图3中可以看出在70 ℃以下时，IgY具有良好的热稳定性。

7.2 IgY的酸稳定性测定 

    用间接ELISA测定了IgY在不同pH条件下免疫活性的变化。由图4可知在pH4-7范围内，IgY的活力基本不受影响；但当pH值下降至4时，活性开始急剧下降，因此IgY在胃酸低酸环境中不稳定，口服应用时，需要对其进行技术保护。    

8. IgY对胃酸及胃蛋白酶的稳定性的测定

由图5、6可见，胃部的低酸和蛋白酶环境对IgY的活性影响很大，半小时内使其基本丧失活性。有必要采取技术手段对其加以保护，微胶囊技术便是一种可以探讨的工艺。 

本发明以BSA作为被包覆的材料之一进行研究，以获得最佳的微胶囊制备条件。在此条件下制备的微胶囊，包封率为70%以上，载药量为20%以上，在胃酸环境2h中累计释放小于10%，在肠道环境中4h累计释放率大于80%。 

BSA微胶囊性能的测定及各因素对其影响 

试剂与材料

海藻酸钠（纯度>98%）、壳聚糖(粘度50—800mpa)、BSA、考马斯亮蓝G-250、CaCl₂冰乙酸磷酸、胃蛋白酶（1︰3000）               

微胶囊溶液的配制

1成囊液

称取2 g壳聚糖，加入50 mL的10%的冰乙酸搅拌溶解，加去离子水稀释至1000 mL，配制成0.2%的壳聚糖（w/v），加入CaCl₂，溶解，真空脱气。

2破囊液（0.2M NaHCO₃，0.06M Na₃C₄H₅O₇·2H₂O） 

称取16.802 g NaHCO₃和17.647 g Na₃C₄H₅O₇·2H₂O定溶于1000mL的超纯水中，调pH至9.6，121℃ 灭菌20 min，室温保存。

3模拟胃液 

称取NaCl 1.755 g，胃蛋白酶3.2 g，浓盐酸7mL，调节pH至1.2，定容至l L。

4模拟肠液 

称取KH₂PO₄ 6.8 g，胰蛋白酶10 g，加入950 ml去离子水使之溶解，用4 M NaOH调节pH至6.8，定容至1 L。

5胃酸液 

浓盐酸7mL定溶于1L的生理盐水中，调节pH至1.2。

空白微球的制作 

   （1）称取一定的海藻酸钠，加入蒸馏水搅拌溶解，配制成浓度为2%(w/v)的溶液。

（2）将2%（w/v）的海藻酸钠溶液，4℃ 500r/min 脱气1min。利用恒流泵将上述溶液以3 mL/min的速度从8＃针头距液面10 cm滴到成囊液中，反应30 min后，所得微囊经去离子水洗涤，真空度为30～50pa，加热温度为15℃真空冷冻干燥。 

空白微球溶胀率的测定 

称取一定量上述做好的冻干微胶囊，在人工模拟胃酸液中2h后，去掉胃酸液，加入模拟肠液，每隔1h，取出微囊，用滤纸吸去表面的液体，称其重量。

              ……………………………....式1 

式1中Ws为微囊的含水量（溶胀后微囊的质量-干微囊的质量），Wd为干微囊的质量。

BSA微胶囊的制备 

     称取一定量的BSA溶于2%（w/v）的海藻酸钠溶液中，自然溶解，4℃ 500r/min  脱气1min。其余过程同上述空白微球制备步骤。记录BSA的投药量与最后冻干微球的总质量，并计算单位质量冻干BSA微球制备时的投药量，记做a。

BSA微胶囊性能的测定及各因素对其影响 

1载药量和包封率的测定

称取BSA微囊冻干粉0.010 g于三角瓶中，加破囊液5mL，置37℃，150r/min摇床振荡2h，碎裂至糊状，4℃ 4500r/min离心15min，用Bradford法测蛋白含量，以标准BSA为标准蛋白，由标准曲线求得样品BSA浓度，根据式2和式3计算BSA微囊的载药量和包封率。

  

  .........................式2

..............................式3  

2 BSA微胶囊体外释放性能的测定

药物在人胃中的滞留时间约为0.5~4.5 h，在小肠的滞留时间约为2～6 h，据此，由于本试验制备的微球将应用于鸡只，故选取微囊在胃酸环境中的释放时间为2 h，在肠道环境中为4 h。取BSA微囊冻干粉10 mg，于25mL具塞锥形瓶中，加入胃酸液10 mL，37℃ 150 r/min摇床上振摇2 h。然后将微囊过滤，转移至10mL模拟肠道环境中，定时取样（同时补充等量同温介质），测定上清液中BSA浓度。

根据下式计算BSA的累积释放率，绘制释放曲线^[29]

×100%

                                        ......................式4

式中：

Cn：第n个时间点所取样品浓度；

V：释放介质总体积；

Vi：第i个时间点的取样体积；

Ci：第i个时间点所取样品浓度。(Vo和Co均为零)；

W：BSA微囊重量； 

BSA loading％：微囊载药量。

3壳聚糖浓度对微胶囊性能的影响 

 为研究壳聚糖浓度对微囊性能的影响，保持各溶液体积不变，CaCl₂浓度为1.0%（w/v），海藻酸钠浓度为2%（w/v），BSA与海藻酸钠的比为2︰8，采用不同的壳聚糖浓度：0%；0.05%；0.10%；0.20%；0.40%；0.80%，制备微胶囊，并测定其包封率和载药量。最初0.8%以上的壳聚糖浓度也被采用，但由于高浓度的壳聚糖粘度太高，所制备的微胶囊大部分粘连，所以摸索的壳聚糖浓度范围为0～0.8%。

4 CaCl₂浓度对微胶囊性能的影响 

为研究CaCl₂浓度对微囊性能的影响，保持各溶液体积不变，壳聚糖浓度为0.1%（w/v），海藻酸钠浓度为2%（w/v），BSA与海藻酸钠的比为2︰8，采用不同的CaCl₂浓度：0.05%；0.10%；0.50%；1.0%；1.5%，制备微胶囊，并测定其性能。

5海藻酸钠浓度对微囊性能影响 

 为研究海藻酸钠不同浓度对BSA微胶囊性能的影响，保持各溶液体积不变，壳聚糖浓度为0.1%（w/v），CaCl₂浓度为0.5%（w/v），BSA与海藻酸钠的比为2︰8，采用不同海藻酸钠浓度(w/v)：1.0%；1.5%；2.0%；2.5%和3.0%。

6 BSA投药量比对微囊性能的影响 

 为研究BSA投药比（BSA与海藻酸钠的质量比）对微囊性能的影响，保持各溶液体积不变，壳聚糖浓度0.1%(w/v)，CaCl₂浓度0.5％(w/v)，海藻酸钠浓度2.0％(w/v)，本试验采用的BSA投药比分别为1︰8、2︰8、 4︰8、6︰8和8︰8。

结果：空白微球溶胀曲线 

  本试验称取的冻干微胶囊质量为0.1012g（Wd），湿微囊质量与干微囊质量之差为含水量，含水量与干微囊的比值为溶胀率SR，见式1。

表5 不同时间的微球质量及含水量 

以时间为横坐标，溶胀率为纵坐标所做的溶胀曲线如图7所示。空白微球在0～2h时间段内，即在胃酸环境中微胶囊的溶胀率为1.79，而在1h时溶胀率即达到1.69，可以理解为1h 时干微球吸水已经饱和，此后1h内吸水率基本变。当将其转移到模拟肠道环境中时，微胶囊的溶胀率逐步缓慢上升，4h溶胀率达到21.18倍，8h时溶胀率达到33.58，但微胶囊的机械强度变弱，有一捅即破的感觉。说明制备的微球具有pH敏感性，即在酸性环境中基本不溶胀，在中性偏碱性环境中缓慢溶胀，符合肠道给药微胶囊的要求。

微胶囊体外释放形貌观察 

    从图8可以看出，壳聚糖-海藻酸钠微胶囊在体外释放时形貌的变化，微胶囊冻干粉为白色的稍有褶皱的小颗粒，将其在胃酸液中温浴2h后，微胶囊几乎没有变化，当微胶囊在胃酸环境中温浴2h后，将其转入肠道环境中1h后，微胶囊明显膨胀，保持完整的球形，没有破裂的现象，在肠道环境中温浴4h后，微胶囊机械强度明显降低，出现破损，可见微胶囊的残骸。

微胶囊在模拟肠液的释放，是一个从膨胀、侵蚀到破裂的渐变过程。壳聚糖-海藻酸钠微胶囊的破裂由所处的环境pH决定。酸性环境，由于微胶囊中离子键的存在，微胶囊不释放并未有明显的膨胀。但微胶囊一旦离开酸性环境暴露于中性偏碱性环境中，壳聚糖-海藻酸钠复合膜上的海藻酸钠分子链上的COOC-会被OH-逐渐取代，更为重要的是壳聚糖会丢失正电荷，复合膜会逐渐解聚，使囊内的海藻酸钠钙凝胶珠暴露出来，造成囊心的释放。 

壳聚糖浓度对微囊性能的影响 

1 壳聚糖浓度对微胶囊包封率和载药量的影响

以壳聚糖浓度为横坐标，包封率和载药量为纵坐标，制图如图9。

结果表明：未加壳聚糖的海藻酸钠的微囊的包封率为23.01%，而加入最低量的壳聚糖（0.05%；w/v）包封率明显提高达到43.19%。随着壳聚糖溶度的提高，包封率不断提高。壳聚糖溶度为0.1%（w/v）时，已接近0.8%时的最大值，相差仅仅4%左右，二者经统计分析，差异不显著。 

由图9可知，载药量随着壳聚糖浓度的提高而增加，但与包封率的变化趋势极为相似，在浓度为0.1%（w/v）时，已经接近于最大值，随后增加趋于平缓，经统计分析差异不显著。 

2壳聚糖浓度对微囊药物释放的影响 

用不同浓度的壳聚糖制备的BSA微胶囊，其释放速率曲线如图10所示， 0～2h，即胃酸环境中，所有样品中BSA的释放率均小于10%，但转入肠道环境后前1h，微胶囊有一个突然释放过程。0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.8%壳聚糖制备的微囊，在第3h时，已经分别释放了75.46%、72.12%、59.79%、57.88%、52.78%、52.45%的BSA，说明壳聚糖浓度的提高，可控制药物的缓释效果。在未添加壳聚糖或较低浓度的壳聚糖（<0.1%）的条件下，在肠道环境中2h内，BSA几乎全部释放。浓度0.10%的壳聚糖能延缓BSA的释放，且与浓度为0.00%和0.05%的释放有明显的差异，在肠道环境4h内，累计释放约83%。当壳聚糖浓度超过0.1%，微胶囊的释放无明显区别。

随壳聚糖浓度的升高，微胶囊的释放可控性逐渐增强；超出此范围（>0.10%；w/v）时，微胶囊的释放控制性基本恒定。 

    综上所述，壳聚糖浓度为0.01%（w/v）时，包封率和载药量都达到最大值；在体外释放方面，符合释放要求。因此，最终确定壳聚糖的浓度为0.1%（w/v）。 

CaCl₂浓度对微囊性能的影响 

1 CaCl₂不同浓度对BSA微囊的载药量及包封率的影响

    图11给出了CaCl₂浓度对包封率及载药量的影响，二者具有相同的变化趋势，随着CaCl₂浓度的升高，微胶囊包封率及载药量均逐渐下降，当CaCl₂浓度为0.05%（w/v）时，微囊的载药量和包封率最高，分别为80.44%和22.41%；随着CaCl₂浓度的升高，包封率和载药量表现出下降趋势，但下降幅度很小，当CaCl₂浓度为1.5%（w/v）时，包封率及载药量仅分别66.61%和15.09%，与0.05%时的差值仅为13.83% 和7.32%。为微胶囊机械性能进行考察时，发现CaCl₂浓度为0.05%和0.1%时，目测便可看出胶囊体积和含水量均很大，在操作过程中易碎。CaCl₂浓度1.0%以上的三个浓度，胶囊的体积和机械强度基本相同，目测无明显差异。操作过程中均具有良好的机械强度，但CaCl₂浓度为0.5% 时，载药量和包封率高于1.0%和1.5%时的相应数据，经统计分析差异显著。因此包封率和载药量本实验结果表明制备微胶囊的最佳CaCl₂浓度为0.5%。

2 CaCl₂浓度对微囊释放度的影响 

图12 给出不同CaCl₂浓度制备的壳聚糖-海藻酸钠微胶囊对BSA的释放速率的影响曲线。从图中可以得出，各浓度变化趋势基本相同，并且在前3h，所有曲线基本重叠，3h后的缓释过程也基本相同，无明显变化。所有曲线在前2h（即胃酸环境中）BSA的释放速率均小于10%。在转入肠道环境后，微胶囊在前1h突释，释放百分比分别为69.04%、69.11%、70.12%、70.36%和71.89%。在突释后释放速率非常缓慢，6h实验结束时，总释放百分比才分别为89.23%、89.87%、89.55%、88.32%、90.32% ，各浓度在2h内（即胃酸环境中）累计释放率小于10%，在肠道环境4h中累计释放率约为80%左右，符合释放要求。

包封率和载药量分析结果表明，0.5%的CaCl₂浓度为最优浓度，而体外释药效果研究，表明CaCl₂ 浓度对BSA的体外释放无明显影响，综合考虑，确定最优的CaCl₂浓度为0.5%（w/v）。 

海藻酸钠浓度对微囊性能的影响 

1海藻酸钠不同浓度对BSA微囊的载药量及包封率的影响

    图13显示，海藻酸钠浓度对包封率及载药量的影响，随着海藻酸钠浓度的升高，包封率逐渐升高。海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）时，包封率达到最大值74.07%，但海藻酸钠浓度低于2.0%（w/v）时，包封率为65.03%和55.6%，与最大值相差分别为11.04%和17.47%，通过统计分析为差异显著。这是由于海藻酸钠浓度低，海藻酸钠-壳聚糖聚电解质膜过薄，还有海藻酸钠外源化凝胶过程所产生的非均相性程度减少，导致非均相凝胶网格中凝胶质膜的松垮，微囊的渗透性增加，促使囊心从微胶囊扩散到水相，减少包封率。当海藻酸钠浓度超过2.0%（w/v）时，包封率很快下降，分别下降24.55%和28.74%，经统计分析与浓度为2.0%（w/v）时，差异显著，这是由于海藻酸钠浓度太高，体系粘度大，形成的微胶囊易粘结大团，导致包封率不好。载药量与包封率趋势相同，在海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）时，载药量最高为16.44%，与浓度为1.0%、1.5%、2.5%和3.0%分别相差3.10%、2.45%、2.84%和4.77%，经统计分析差异显著，因此本实验结果的包封率和载药量表明，制备微胶囊的最佳海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）。

2海藻酸钠浓度对微囊释放度的影响 

从图14可知，在海藻酸钠浓度不同的水平下，微胶囊的BSA释放趋势相同。在2h内（胃酸环境中），所用微胶囊中的BSA释放率均小于10%，在转入肠道环境中，前1h，BSA微胶囊开始突释，突释分别为70.36%、67.34%、63.42%、55.02%和53.66%，在突释后有持续缓慢释放。6h时实验结束时，总释放比为90.13%、87.24%、80.59%、75.78%和70.98%，各浓度在2h内（即胃酸环境中）累计释放率小于10%，在肠道环境4h中，BSA的释放与海藻酸钠浓度有明显的关系，BSA释放速率随海藻酸钠的浓度升高而降低。当海藻酸钠浓度为1.0%（w/v）时，BSA在肠道环境4h内累计释放约82%，海藻酸钠浓度为3.0%（w/v）时，BSA在肠道环境中4h内累计释放约64%，释放最小，相差为18%，差异相差较大，且海藻酸钠浓度为3.0%（w/v）时，不符合释放要求，综合考虑，本实验选择最佳海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）。

综上所述，海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）时，包封率和载药量都达到了最大值；在模拟体外释放实验中，当海藻酸钠浓度为2.0%（w/v）时，BSA在胃酸环境2h中累计释放率为7.75%，在肠道环境4h中，累计释放为72.84%，符合肠道给药的释放要求。因此，确定海藻酸钠最优浓度为2.0%（w/v）。 

投药量比对微囊性能的影响 

1 投药量比对BSA微囊的载药量及包封率的影响

 图15显示，微囊的包封率随投药比（BSA与海藻酸钠质量比）的增加而减少，投药比为1︰8时，包封率为92.25%；进一步增大投药比到2︰8、4︰8、6︰8和8︰8时，包封率反而下降至74.60%、70.4%、66.22%和62.25%，相差为17.65%、21.85%、26.03%和30.00%，经统计分析相互差异显著；微胶囊的载药量随投药比的增加而增加，投药比为1︰8时，载药量为13.96%，当投药比增加为8︰8时，载药量达到最大值55.27%，相差为41.31%，并且各投药比之间，经统计分析相互差异显著。

2 BSA投药比不同对微囊释放度的影响 

由图16可知，投药比不同对制备的壳聚糖-海藻酸钠微胶囊的BSA释放影响很大。在胃酸环境2h中，投药比为1︰8和2︰8的累计均小于10%，但投药比为4︰8、6︰8和8︰8的累计释放均为60%以上，导致在肠道环境中释放百分比少，不符合肠道给药的要求。

综上所述，投药比在低的水平（≤2:8），可获得较高的包封率；在体外释放方面，在胃酸环境2h中，释放率小于10%，在肠道环境4h中累计释放百分比分别为81.01%和77.96%，符合释放要求，此外，投药比为1︰8，虽可获得较高的包封率但增加包封成本，综合考虑，确定最优的投药比为2︰8。 

结论，上述实验探讨了反应条件（壳聚糖浓度、CaCl₂浓度、海藻酸钠浓度和BSA与海藻酸钠质量比）对BSA壳聚糖-海藻酸钠微胶囊性能的影响，确定了制备微胶囊的最佳反应条件为：壳聚糖浓度0.1%（w/v）、CaCl₂浓度0.5%（w/v）、海藻酸钠浓度2.0%（w/v）、BSA与海藻酸钠质量比为2︰8，在此条件下制备的BSA微胶囊，包封率为70%以上，载药量为20%以上，在胃酸环境2h中累计释放小于10%，在肠道环境中4h累计释放率大于80%。 

该结论是基于BSA得出的，由于不同内容物的微胶囊所面对的肠胃环境是一致的，所以内容物使用IgY，IgG等其他材料，制备过程一致，其效果都是完全一致的。所以根据上述工艺条件制备到抗E.tenella IgY微胶囊表现出了同样的性质。