提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2及制备以及利用其编码的蛋白

摘要

本发明涉及一种本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2及制备以及利用其编码的蛋白。以5'-ATAGG TACCGAGCTCTCAGATCCAAATAAATCATG-3'为上游引物S1，以5'-CTGGGATCCCTC GAGCCTCAGCTATATATCCATTG3'为下游引物A1，以经过盐胁迫处理的大豆植株根、茎、叶组织中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。本发明解决了现有技术存在的植物抗性基因缺乏，大多数基因的抗谱、适应生态区、抗性机理等不清楚的问题。具有转基因愈伤组织与野生型比较耐盐性、抗旱性显著增强的优点。

说明书

技术领域

本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2及制备以及利用其编码的蛋白。 

背景技术

逆境是限制植物生长、影响产量形成的重要因素之一，抗性基因的分离、克隆、转化一直受到科学家们的高度重视。从基因资源的发掘和利用上来看,目前已有近40个抗性基因被发现,有的已经实现定位和克隆,但大多数基因的抗谱、适应生态区、抗性机理等均不清楚,有的甚至没有可供追踪的分子标记。因此还需对现有抗性资源进行系统研究和评价^[1]。研究抗性基因，并将其在植物中表达，有助于提高植物的抗旱抗寒抗病虫害等抗性能力，增强了作物的适应性，进而提高农业生产率，在生产育种方面具有重要的意义。类阳离子转运调控因子2主要负责阳离子跨膜运载，其主要功能是提高植株的抗性，在植物不同组织或器官中调节离子的动态平衡、pH等。对于提高植物的重金属抗性，减少毒性重金属在植物某些部位的积累有重要作用；同时协调使植物对Zn，Ni，Se等必需矿质微量元素的富集，对植物的发育也起到很重要的作用。目前还没有关于大豆中类阳离子转运调控因子2功能的研究。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2。 

本发明的目的之二在于提供提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2的制备方法。 

本发明的目的之三在于提供利用提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2编码的蛋白。 

本发明的整体技术构思是： 

提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2，其DNA序列为： 

GGGGAAGCCAGAGAAAGAGAAGGAACCAACAACAAAGAGCAGAGAGAAAGAGAGGACCATTCCAAC 

CCTAATTTCTCTGCTAAACCCTAGTTGTTTGGCATTTCCTCTCTTCTCCCTCGTAAATCTTCTCCC 

ATTCCCTCCGGTAGCTTTCCAGATCCAAATAAATCATGGTTTTCTGGGTTTTTGGCTACGGTTCAC 

TGGTGTGGAACCCTGGATTCGATTACAATGAGAAGATTATAGGTTTCATTAAGGACTACAGACGCG 

TGTTTGATTTAGCGTGCATTGATCACCGGGGAACACCTGAAAACCCAGCAAGAACTTGCACGTTGG 

AGGAGAAGGAAGGGGCTATTTGCTGGGGAGCTGCTTATTGTGTTCGAGGAGGCCCTGAAAAGGAAA 

AACTGGCTATGCAGTATTTGGAGCGACGGGAATGTGAATATGACAGAAAGACTCTTGTAAACTTCT 

TCAAGGAAGGAGATTCACTGCACCCTACTTTAACTGATGTAATAGTATTCACATCTACTCCAGACA 

AAGTGAACAACAAATACTACCTGGGACCTGCTCCACTTGAAGACATGGCTAGGCAAATAGCAACTG 

CATATGGCCCTTGCGGAAACAACAGGGATTACATTTTCCTTCTAGAAAAGGCCATGTATGATATTG 

GCCATGAGGATGACTTAGTGATAGAGCATGCCAATGAAGTGAGGAAAGTACTTGGAATGGGAAATG 

TAGTACCAAAGGAGAAGAAACTGGTTGGAGCAGCACAACTTCCACACCCTCCTCATGTAACAATCC 

CTACCCTTCAACTGCACCCACTGCCAGAACCTATTGCAATGGATATATAGCTGAGGGGGGAGATGA 

CCAAAAACTGACGCTGAGTTCGGCTACTAAACTGATTTCCTGCTAACCCTCATTCAAATTTAAATA 

ACATCACATATCTATTCCTCTTCGCCTACTTTTAGCGGCTTTTCAGCCATTCCCTTGAGATATTGC 

TTAAATTCAGTGAGGCGCAATATTTTGAATTGGAATGTTCGCGGATATTTTACTTCTGCAGACTGC 

AGTGTTATTATTGAAAAAGTTTCATTTTTTTTATTTAATTTCGTTTACGGGCGATCTTACACAAGT 

TT。 

提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2的制备方法，以5'-ATAGGT ACCGAGCTCTCAGATCCAAATAAATCATG-3'为上游引物S1，以5'-CTGGGATCCCTCG AGCCTCAGCTATATATCCATTG3'为下游引物A1，以大豆植株根、茎、叶组织中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。 

利用提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2编码的蛋白，其序列如下： 

Met Val Phe Trp Val Phe Gly Tyr Gly Ser Leu Val Trp Asn Pro Gly Phe 

Asp Tyr Asn Glu Lys Ile Ile Gly Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Arg Val Phe 

Asp Leu Ala Cys Ile Asp His Arg Gly Thr Pro Glu Asn Pro Ala Arg Thr 

Cys Thr Leu Glu Glu Lys Glu Gly Ala Ile Cys Trp Gly Ala Ala Tyr Cys 

Val Arg Gly Gly Pro Glu Lys Glu Lys Leu Ala Met Gln Tyr Leu Glu Arg 

Arg Glu Cys Glu Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Val Asn Phe Phe Lys Glu Gly 

Asp Ser Leu His Pro Thr Leu Thr Asp Val Ile Val Phe Thr Ser Thr Pro 

Asp Lys Val Asn Asn Lys Tyr Tyr Leu Gly Pro Ala Pro Leu Glu Asp Met 

Ala Arg Gln Ile Ala Thr Ala Tyr Gly Pro Cys Gly Asn Asn Arg Asp Tyr 

Ile Phe Leu Leu Glu Lys Ala Met Tyr Asp Ile Gly His Glu Asp Asp Leu 

Val Ile Glu His Ala Asn Glu Val Arg Lys Val Leu Gly Met Gly Asn Val 

Val Pro Lys Glu Lys Lys Leu Val Gly Ala Ala Gln Leu Pro His Pro Pro 

His Val Thr Ile Pro Thr Leu Gln Leu His Pro Leu Pro Glu Pro Ile Ala 

Met Asp Ile。 

本发明的具体技术内容还有： 

提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2的制备方法，工艺步骤如下： 

A、PCR反应模板的制备； 

B、引物的制备； 

C、基因GmCTRL2全序列的扩增和克隆。 

所述的步骤A是将大豆种植于温室中，种子萌发的幼苗经1/4Hoagland营养液水培至1～2片真叶，分别提取根、茎、叶组织中的RNA，选取部分茁壮植株进行盐胁迫（NaCl终浓度为0.15mol/L）处理72小时，分别提取根、茎、叶组织中的RNA并按照RNAplant植物RNA提取试剂盒内的说明书进行操作，提取的RNA的纯度和质量分别经琼脂糖凝胶（1.6%,w/v）电泳检测和分光光度计（260/280nm）检测，利用M-MLV试剂盒或TaKaRa试剂盒反转录合成cDNA，用于PCR反应的模板； 

步骤B是根据国际基因库（GenBank）同源序列Medicago truncatula（XP_003603572）;Vitis vinifera（XP_002283203）Populus trichocarpa（XP_002332121）比对，利用DNAMAN软件对检索获得的EST序列进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的拼接序列，采用软件Primer premier5.0设计引物对获得开放阅读框序列进行扩增，上、下游扩增引物中分别引入Kpn I和BamH I识别序列，上游引物为S1：5'-ATAGGTACCGAGCTCTCAGATCCAAATAAATCATG-3'；下游引物为A1：5'-CTGGGATCCCTCGAGCCTCAGCTATATATCCATTG3'； 

步骤C是利用步骤1中获得的cDNA作模板，使用大连宝生物公司的Ex-Taq DNA聚合酶和步骤B中获得的上、下游引物进行PCR扩增； 

PCR20μL反应体系如下： 

PCR反应程序为：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，46℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳和Bio-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统检测后，切胶回收目的条带，回收产物与pGEM-T载体（TIANGEN）连接，将连接产物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析。 

申请人对本发明获得的基因进行了如下试验。 

1、利用GmCTRL2基因的开放阅读框（ORF）序列应用Computer pI/MW Tool软件（http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam）对GmCTRL2蛋白相对分子量、理论等电点及平均可塑性、疏水性等参数进行在线分析；应用TMAP（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/tmap.html）和TMpred(http:/www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)对GmCTRL2蛋白跨膜区域进行预测分析；应用SignalP服务器（http://www.cbs.dtu.dk/Serv ices/SignalP）进行信号肽分析；应用NCBI中的Blast（http://blast.nc bi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）程序，搜索相似序列，再使用生物信息学DNAMAN软件进行氨基酸序列对比；在BioEdit Sequence Alignment Editor软件中进行ClustalW多序列排列并利用MEGA4.1.2软件构建GmCTRL2蛋白系统进化树。 

2、对基因GmCTRL2序列进行GmCTRL2蛋白表达亚细胞定位的研究 

分别以含限制性内切酶NcoI识别序列（以“-”标出）的上游引物序列：SP1(5'-GCCATGGTTTTCTGGGTT-3')；含有限制性内切酶BglⅡ识别序列（以“-”标出）及特殊连接序列（以“=”标出）的下游引物序列：AP1（5'-AGATCTACCAT ATATCCATTGCAATAGG-3'）为特异引物，以质粒pGEM-T-GmCTRL2为模 板扩增得到GmCTRL2的ORF序列，并将该序列插入荧光表达定位载体p1302的Nco I和Bgl Ⅱ识别序列之间，与绿色荧光蛋白（GFP）基因构建成GmCTRL2-gfp融合基因，形成双元表达载体p1302-GmCTRL2-GFP。含有重组载体的农杆菌EHA105浸染洋葱鳞茎表皮细胞参照刘肖飞，梁卫红等^[2-3]的方法，以仅携带gfp基因的p1302空载体作对照。取已培养好的洋葱表皮细胞放在荧光显微镜479nm的蓝光下进行观察，每次观察3-7个装片，每个装片选取4-6个视野，以上试验均重复3次，选取图片较好的进行拍照保留。 

3、用步骤A中获得的cDNA序列为模板，对基因GmCTRL2的组织内源性表达进行半定量RT-PCR分析。 

以获得的72h盐胁迫前后的根、茎、叶三组织的cDNA为模板，进行GmCTRL2进行半定量RT-PCR,反应条件为94℃预变性10分钟，94℃变性30s，46℃退火30秒，72℃延伸1分钟，25个循环；72℃充分延伸10分钟。RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳和Bio-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统检测。选用泛素为内参，设计引物序列分别为UBF（5’-GATTTTTGTGAAGACTCTTACGGG-3’）和UBR（5’-GAGACGGAGGACAAGGTGAAG-3’）。 

4、用基因GmCTRL2序列获得转基因苜蓿愈伤组织进行逆境胁迫处理及分析 

将紫花苜蓿（Medicago sativa）种子经75%乙醇5分钟，0.1%升汞浸泡8分钟消毒处理后，接种于MS培养基于组培室中培养一周（光照强度4000lux，每天照明10-16小时），待其萌发切取下胚轴。构建35S启动子驱动的植物表达载体pGN-GmCTRL2，并利用根癌农杆菌介导的转基因技术^[4]将含有pGN-GmCTRL2重组载体的根癌农杆菌活化后，室温4000转/分钟，离心5分钟，弃上清，沉淀菌体用含1×MS大量，1×铁盐，1×微量，1×UM有机，3％蔗糖，0.3%水解酪蛋白，pH值5.8的转化介质悬浮，将下胚轴置于含有转化菌的悬浮液中，浸染15分钟，取出下胚轴于UM液体培养基清洗三次后，置于UM固体培养基，共培养2-3天。之后转入含有0.1%活性炭，25mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的继代培养基，每18-23天继代一次，共继代三次。 

取长势良好的继代获得的转基因愈伤组织，分别接种于加入NaCl0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L和150mmol/L的UM固体培养基中进行盐胁迫处理。每个 处理选取10块转基因愈伤组织，同时以野生型苜蓿愈伤组织作对照，每个处理浓度重复3次。 

再选取长势良好的转基因愈伤组织接种于含甘露醇0%、5%、10%、15%的UM固体培养基中进行模拟干旱胁迫处理。每个处理选取10块转基因愈伤组织，同时以野生型苜蓿愈伤组织作对照，每个处理浓度重复3次。静置培养一周左右，观察并统计愈伤组织的生长状况。 

上述试验的结果如如附图说明。 

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于： 

1、对不同浓度NaCl处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织的褐化百分率进行统计，结果表明，转基因愈伤组织与野生型比较耐盐性明显增强。 

2、对不同浓度甘露醇处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织的褐化百分率进行统计，结果表明，转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织较野生型抗旱性增强。 

附图说明

本发明的附图有： 

图1是本发明的基因GmCTRL2及所编码的氨基酸序列表。 

图2是TMpred对GmCTRL2跨膜区域可能性的预测结果。 

GmCTRL2基因编码224个氨基酸，蛋白理论等电点为5.61，分子量为25.4KDa。图2中跨膜区域为1，氨基酸序列的1-17是跨膜序列，且不含信号肽序列。 

图3是基因GmCTRL2氨基酸序列的多序列比对示意图。 

NCBI数据库BLAST同源性比对发现大豆GmCTRL2氨基酸序列与其他已报道的高等植物的Glycine max（XP_003522674）;Medicago truncatula（XP_003603572）;Medicago truncatula(XP_003588617);Vitis vinifera（XP_002283203）；Populus trichocarpa（XP_002332121）；Ricinus communis（XP_002527996）；Elaeis guineensis（AEQ94172），基因所编码的氨基酸序列同源性分别为96%、86%、79%、76%、75%、82%和74%，说明GmCTRL2蛋白氨基酸序列在系统进化上有高度保守性 

图4是基因GmCTRL2的系统进化分析示意图。 

图4中大豆（Glycine max）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）同属于豆科，在进化树中基因的物种亲缘关系相似性达到77%，两者汇聚于同一分支，这与植物分类结果是一致的。 

图5是基因GmCTRL2-GFP在洋葱表皮细胞的荧光定位（标尺：10μm）示意图。 

图5中A是GFP在细胞质中表达；B是GmCTRL2-GFP融合蛋白在细胞质膜上表达； 

图5A中分别随机选取5块处理组和对照组洋葱表皮进行共聚焦荧光显微镜细胞的绿色荧光，根据绿色荧光在细胞中的分布确定目的蛋白在细胞中的分布。转有空载质粒p1302的对照组，由于GFP在细胞质中合成而使得绿色荧光分布在整个细胞中。 

图5B中转有p1302-GmCTRL2-GFP的洋葱表皮细胞，而利用1.7mol·L^-1NaCl溶液处理15分钟后，细胞发生了质壁分离，其绿色荧光主要分布于细胞质膜，细胞壁部位有微弱荧光，而其它部位没有荧光。由此可见，大豆GmCTRL2蛋白主要分布于植物细胞的细胞质膜。 

图6是盐胁迫前后半定量RT-PCR检测基因GmCTRL2在大豆根、茎、叶三个组织中的表达结果。 

图6中1:盐胁迫后大豆叶中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物.2:盐胁迫后大豆茎中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物.3:盐胁迫后大豆根中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物;4:盐胁迫前叶中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物.5:盐胁迫前茎中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物.6:盐胁迫前根中GmCTRL2基因RT-PCR表达产物.均以大豆泛素做内参。 

图6中用半定量RT-PCR以大豆泛素做内参，检测GmCTRL2基因在根、茎、叶三个组织中的表达，发现胁迫前、后的各组织中均表达，但表达量有所不同。根据图中扩增基因条带的亮度差别判断：胁迫前表达量由高到低为：根、叶、茎；胁迫后表达量由高到低为：茎、叶、根。并且胁迫后茎中、叶中的表达量都高于胁迫前，根中的表达量低于胁迫前。 

图7是不同浓度NaCl处理下转GmCTRL2基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤 组织生长状况对比示意图。 

图7中盐胁迫处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织在无NaCl的固体培养基中，野生型苜蓿愈伤组织与转基因苜蓿愈伤组织都能良好的生长，没有褐化和死亡的情况。在加入50mmol/LNaCl的培养基中，野生型苜蓿愈伤组织的大部分愈伤组织表面有轻微的褐化，而转基因苜蓿愈伤组织的生长良好，无褐化和死亡的情况。在加入100mmol/LNaCl培养基中野生型苜蓿愈伤组织全部褐化，转基因苜蓿愈伤组织的大部分表面褐化。而加入150mmol/LNaCl培养基中愈伤组织均褐化死亡，可见150mmol/LNaCl是转基因苜蓿愈伤组织盐胁迫的临界值。 

对不同浓度NaCl处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织的褐化百分率进行统计（3次重复实验平均值），结果如图7E所示，当NaCl浓度在50mmol/L时WT苜蓿愈伤组织的褐化率达到73.3%，而转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织的褐化率为13.3%；当NaCl浓度在100mmol/L时WT苜蓿愈伤组织的褐化率达到100%，而转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织的褐化率为56%，可见转基因愈伤组织与野生型比较耐盐性明显增强。但当NaCl浓度过大时，细胞代谢紊乱，有害物质积累转基因的愈伤组织全部褐化死亡。 

A：0mmol/LNaCl处理下转基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤组织对比；B：50mmol/LNaCl处理下转基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤组织对比；C：100mmol/LNaCl处理下转基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤组织对比；D：150mmol/LNaCl转基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤组织对比；E：不同浓度NaCl处理下转基因苜蓿愈伤组织与野生型愈伤组织褐化百分率。 

图8是对不同浓度甘露醇处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织的褐化百分率统计结果。 

在无甘露醇的培养基中转基因苜蓿愈伤组织与野生型苜蓿愈伤组织都能良好的生长，没有褐化和死亡的情况；在含5％甘露醇的培养基中野生型苜蓿愈伤组织的大部分愈伤组织表面有轻微的褐化，而转基因苜蓿愈伤组织的生长良好，无褐化和死亡的情况。而含10％甘露醇的培养基中野生型苜蓿愈伤组织全部褐化，转基因苜蓿愈伤组织的部分表面褐化；在含15％甘露醇的培养基中野生型苜蓿愈伤组织和转基因苜蓿愈伤组织均褐化死亡。 

对不同浓度甘露醇处理下的转基因苜蓿愈伤组织和野生型苜蓿愈伤组织的褐化百分率进行统计（三次重复实验平均值）。如图8E所示，在含5%和10%的甘露醇的培养基中野生型苜蓿的褐化率分别达到76.6%和100%，而转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织的褐化率为20%和63.3%；这表明转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织较野生型抗旱性增强。当甘露醇浓度达到15%时，离子渗透胁迫增强，细胞失水，严重转GmCTRL2基因的苜蓿愈伤组织全部褐化死亡。 

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。 

本实施例的基因和利用其编码的氨基酸序列如前述，其基因的制备方法如下： 

提高紫花苜蓿抗渗透胁迫能力的基因GmCTRL2的制备方法，以5'-ATAGGT ACCGAGCTCTCAGATCCAAATAAATCATG-3'为上游引物S1，以5'-CTGGGATCCCTCG AGCCTCAGCTATATATCCATTG3'为下游引物A1，以大豆植株根、茎、叶组织中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。 

制备方法的工艺步骤如下： 

A、PCR反应模板的制备； 

B、引物的制备； 

C、基因GmCTRL2全序列的扩增和克隆。 

所述的步骤A是将大豆种植于温室中，种子萌发的幼苗经1/4Hoagland营养液水培至1～2片真叶，分别提取根、茎、叶组织中的RNA，选取部分茁壮植株进行盐胁迫（NaCl终浓度为0.15mol/L）处理72小时，分别提取根、茎、叶组织中的RNA并按照RNAplant植物RNA提取试剂盒内的说明书进行操作，提取的RNA的纯度和质量分别经琼脂糖凝胶（1.6%,w/v）电泳检测和分光光度计（260/280nm）检测，利用M-MLV试剂盒或TaKaRa试剂盒反转录合成cDNA，用于PCR反应的模板； 

步骤B是根据国际基因库（GenBank）同源序列Medicago truncatula（XP_003603572）;Vitis vinifera（XP_002283203）Populus trichocarpa （XP_002332121）比对，利用DNAMAN软件对检索获得的EST序列进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的拼接序列，采用软件Primer premier5.0设计引物对获得开放阅读框序列进行扩增，上、下游扩增引物中分别引入Kpn I和BamH I识别序列，上游引物为S1：5'-ATAGGTACCGAGCTCTCAGATCCAAATAAATCATG-3'；下游引物为A1：5'-CTGGGATCCCTCGAGCCTCAGCTATATATCCATTG3'； 

步骤C是利用步骤1中获得的cDNA作模板，使用大连宝生物公司的Ex-Taq DNA聚合酶和步骤B中获得的上、下游引物进行PCR扩增； 

PCR20μL反应体系如下： 

PCR反应程序为：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，46℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳和Bio-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统检测后，切胶回收目的条带，回收产物与pGEM-T载体（TIANGEN）连接，将连接产物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，经上海生工生物工程技术服务公司进行测序分析。