测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法。该方法包括：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和B细胞；分别统计、测量它们的细胞数目和总面积；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将A细胞置于其中培养；后检测A细胞荧光淬灭前的平均荧光值；再加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测A细胞荧光淬灭后的平均荧光值；再用同样的方法检测B细胞荧光淬灭前的平均荧光值和淬灭后的平均荧光值；再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本，用同样的方法检测其荧光淬灭前的荧光值和淬灭后的荧光值；根据下列公式得到结果。本发明的方法可以在活细胞中进行，从而实现无损检测的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及测定胰岛中A细胞 与B细胞数目比例的方法。

背景技术

胰岛中包含A细胞、B细胞、D细胞及PP细胞等多种细胞。 其中，A细胞与B细胞的比例对人体糖代谢的调节起重要作用。

相关技术中，测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法通常 是：先将胰岛细胞团用多聚甲醛（PFA）进行固定，包埋和切片， 再加入胰岛素的第一抗体和胰高血糖素的第一抗体，最后加入分别 匹配以上两种抗体的不同第二抗体（分别被不同的荧光物质标记）， 最终通过测量有荧光部分的面积计算得到A细胞与B细胞的比例。

但是，这种方法的缺点是对细胞造成了损坏：在进行免疫反应 前要将胰岛细胞固定，改变了其细胞形态，使得细胞死亡而无法进 行其它活细胞功能检测试验，例如探测细胞的分泌功能等等。

发明内容

本发明的目的在于提供测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的 方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种测定胰岛中A细胞与B细胞数 目比例的方法，包括下列步骤：

步骤A：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A 细胞和多个B细胞；

步骤B：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的 细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B 细胞的总面积S₂；

步骤C：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m个 A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前 的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂， 静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤D：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n个 B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前 的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂， 静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

步骤E：再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检 测样本；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本 置于该培养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值 a；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所 述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤F：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞 的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\times \frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光 染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；

操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。

本发明上述实施例的方法的检测原理是：先后分别采用锌离子 荧光染料和非荧光素锌离子络合剂与活细胞中的锌离子络合，锌离 子荧光染料作为荧光激发剂，非荧光素锌离子络合剂作为荧光淬灭 剂，使得细胞发生荧光淬灭现象，再根据细胞荧光淬灭前后的荧光 值计算得到胰岛中A细胞与B细胞的比例；该荧光淬灭的原理是：

以A细胞为例，在用于培养胰岛细胞的胰岛培养基中加入一种 能发射荧光的络合剂—锌离子荧光染料，该锌离子荧光染料选择性 地与m个A细胞中的锌离子络合，从而使得m个A细胞发射荧光； 接着向所述胰岛培养基中加入另一种络合剂—非荧光素锌离子络合 剂，此时非荧光素锌离子络合剂与锌离子荧光染料竞争结合细胞中 的锌离子，使得锌离子荧光染料与锌离子的络合产物部分解离，进 而使得m个A细胞发射的荧光强度降低，产生荧光淬灭，同时在此 过程中检测m个A细胞发生荧光淬灭前、淬灭后的平均荧光值；

所述n个B细胞与所述检测样本的检测过程同上；更重要地， 由于锌离子荧光染料对A细胞和B细胞的荧光染色能力不同，因而 使得两种细胞的荧光淬灭程度也不同，从而可建立方程组以用于检 测胰岛中A细胞与B细胞数目的比例；

此外，通过统计和测量所述多个A细胞、所述多个B细胞的细 胞数目和总面积，可得到单个A细胞的淬灭系数和单个B细胞的淬 灭系数，即发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均 荧光值的比值；再通过如下的公式和计算方法即可得到A细胞与B 细胞的比例：

x为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中A细胞的总的荧光强度；

y为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中B细胞的总的荧光强度；

α为A细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的 平均荧光值的比值；

β为B细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的 平均荧光值的比值；

γ=A细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×A细胞的平均面积/(B细 胞荧光淬灭前的平均荧光强度×B细胞的平均面积)；

结合所述步骤A至E中的检测结果以及上述参数之间的关系， 得到：

x+y=a；

αx+βy=b；

x/y=(待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细 胞的数目)×γ;

α=b₁/a₁;

β=b₂/a₂;

γ={(a₁)*(S₁/m)}/{(a₂)*(S₂/n)}；

最终得到，待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中 B细胞的数目其中，α，β，γ三个参数通过所述步骤 B至D即可计算得到，a和b通过所述步骤E即可得到，进而最终 得到R，即胰岛中A细胞与B细胞的比例

由上文可知，本发明的测定方法是先分别检测A细胞与B细胞 的单独荧光淬灭参数，再检测混合有A细胞和B细胞的检测样本的 荧光淬灭参数，最终建立方程，得到A细胞与B细胞的比例，由于 锌离子荧光染料具有膜渗透性，可进入活细胞，对锌离子进行检测， 无需破坏细胞的组织结构，因而本发明的测定方法可以在活细胞中 进行，从而实现无损检测的目的。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

本发明的实施例一提供了一种测定胰岛中A细胞与B细胞数目 比例的方法，包括下列步骤：

步骤101：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个 A细胞和多个B细胞；

步骤102：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的 细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B 细胞的总面积S₂；

步骤103：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m 个A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬 灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络 合剂，静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤104：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n 个B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭 前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合 剂，静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

步骤105：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本； 向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本置于该培 养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所 述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述检测 样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤106：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细 胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\times \frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光 染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；

操作所述步骤101至所述步骤105时的环境温度为16-37℃。

上述方法的检测原理是：先后分别采用锌离子荧光染料和非荧 光素络合剂与活细胞中的锌离子络合，使得细胞发生荧光淬灭现象， 再根据细胞荧光淬灭前后的荧光值计算得到胰岛中A细胞与B细胞 的比例；该荧光淬灭的原理是：

以A细胞为例，在用于培养胰岛细胞的胰岛培养基中加入一种 能发射荧光的络合剂—锌离子荧光染料，该锌离子荧光染料选择性 地与m个A细胞中的锌离子络合，从而使得m个A细胞发射荧光； 接着向所述胰岛培养基中加入另一种络合剂—非荧光素锌离子络合 剂，此时非荧光素锌离子络合剂与锌离子荧光染料竞争结合细胞中 的锌离子，使得锌离子荧光染料与锌离子的络合产物部分解离，进 而使得m个A细胞发射的荧光强度降低，产生荧光淬灭，同时在此 过程中检测m个A细胞发生荧光淬灭前、淬灭后的平均荧光值（平 均面积的荧光值）；

所述n个B细胞与所述检测样本的检测过程同上；更重要地， 由于锌离子荧光染料对A细胞和B细胞的荧光染色能力不同，因而 使得两种细胞的荧光淬灭程度也不同，从而可建立方程组以用于检 测胰岛中A细胞与B细胞数目的比例；

此外，通过统计和测量所述多个A细胞、所述多个B细胞的细 胞数目和总面积，可得到单个A细胞的淬灭系数和单个B细胞的淬 灭系数，即发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均 荧光值的比值；再通过如下的公式和计算方法即可得到A细胞与B 细胞的比例：

x为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中A细胞的总的荧光强度；

y为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中B细胞的总的荧光强度；

α为A细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的 平均荧光值的比值；

β为B细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的 平均荧光值的比值；

γ=A细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×A细胞的平均面积/(B细 胞荧光淬灭前的平均荧光强度×B细胞的平均面积)；

结合所述步骤101至105中的检测结果以及上述参数之间的关 系，得到：

x+y=a；

αx+βy=b；

x/y=(待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细 胞的数目)×γ;

α=b₁/a₁;

β=b₂/a₂;

γ={(a₁)*(S₁/m)}/{(a₂)*(S₂/n)}；

最终得到，待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中 B细胞的数目其中，α，β，γ三个参数通过所述步骤 102至104即可计算得到，a和b通过所述步骤105即可得到，进而 最终得到R，即胰岛中A细胞与B细胞的比例，即

由上文可知，本发明的测定方法是先分别检测A细胞与B细胞 的单独荧光淬灭参数，再检测混合有A细胞和B细胞的检测样本的 荧光淬灭参数，最终建立方程，得到A细胞与B细胞的比例，由于 锌离子荧光染料具有膜渗透性，可进入活细胞，对锌离子进行检测， 无需破坏细胞的组织结构，因而本发明的测定方法可以在活细胞中 进行，从而实现无损检测的目的。

其中，所述步骤101中分离出A细胞和多个B细胞的方法可以 采用多种，例如采用细胞分离机进行分离。所述培养的过程中发生 荧光络合反应，所述静置的过程中发生荧光淬灭反应。

此外，所述锌离子荧光染料需采用现有的对所述A细胞和所述 B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料； 例如研究发现的红色内酰胺锌离子染料（ZinRhodaLactam-1， ZRL-1）等。所述非荧光素锌离子络合剂是指可与锌离子发生络合 反应，但不能发射荧光的络合剂，例如N,N-二(2-吡啶甲基)胺 （DPA），N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺（TPEN）等。

实施例二

本发明的实施例二提供了一种优选的测定胰岛中A细胞与B细 胞数目比例的方法，包括下列步骤：

第一步：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A 细胞和多个B细胞；

第二步：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的 细胞数目n；分别测量所述多个A细胞的总面积S₁和所述多个B细 胞的总面积S₂；

第三步：向胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述m 个A细胞置于该培养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述m个A细胞 荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入TPEN 0.8-1.2mmol/L，静置12-25min；后检测所述m个A细胞荧光淬灭 后的平均荧光值b₁;

第四步：向胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述n 个B细胞置于该培养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述n个B细胞 荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入TPEN 0.8-1.2mmol/L，静置12-25min；后检测所述n个B细胞荧光淬灭 后的平均荧光值b₂;

第五步：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本；向 胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述检测样本置于该培 养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a； 向所述胰岛培养基中加入TPEN0.8-1.2mmol/L，静置12-25min，后 检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

第六步：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞 的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\times \frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。

由上文可知，本实施例提供了一种更为优选的锌离子荧光染料 ZRL-1，其具有较好的膜渗透性和对锌离子高选择性的络合能力， 用于荧光检测，灵敏度高，因而使得本发明的检测方法灵敏度高， 其具体的性质参见参考文献《A Highly Selective Turn-On  Colorimetric,Red Fluorescent Sensor for Detecting Mobile Zinc in  Living Cells》（Inorg.Chem.2010,49,10753-10755），该化合物的结 构式为：

并且非荧光素锌离子络合剂选用TPEN，同样其也是一种高选 择性的络合剂，因而用作荧光淬灭剂，使荧光淬灭前后的荧光值差 别较大，因而得到的检测结果准确度更高。

实施例三

本发明的实施例三提供了另一种优选的测定胰岛中A细胞与B 细胞数目比例的方法，包括下列步骤：

步骤201：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个 A细胞和多个B细胞；

步骤202：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的 细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B 细胞的总面积S₂；

步骤203：向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述m 个A细胞置于该培养基中，培养1h；后检测所述m个A细胞荧光 淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L， 静置20min；后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤204：向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述n 个B细胞置于该培养基中，培养1h；后检测所述n个B细胞荧光 淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L， 静置20min；后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂

步骤205：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本； 向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述检测样本置于该培 养基中，培养1h；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的荧光值a； 向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L，静置20min；后检测所 述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤206：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细 胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\times \frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，操作所述步骤201至所述步骤205时的环境温度为 25-37℃。

上述方法中的所述胰岛培养基为洛斯维·帕克纪念研究所RPMI 培养基，且所述培养基添加了0.1g/mL血清，即RPMI1640培养基， 这种培养基稳定性和营养物质更适于胰岛细胞生长。

此外，上述三个实施例中，所述m≥6，所述n≥6，用于计算细 胞的平均荧光值更具有统计学意义，其中优选采用6，适当减轻了 统计工作量。更优选地，操作所有步骤时的环境温度为25-37℃， 例如25℃或37℃。检测荧光值的方法可以采用多种，例如采用目前 技术已经较成熟的宽场显微镜检测或共聚焦显微镜检测。

为了进一步说明本发明改进点，以下还提供了具体的试验例。

试验例

试验对象：C57BL/6J小鼠胰岛1个。

试验方法：

采用实施例三的方法进行检测，其中，所述m和n均为6；操 作所有步骤时的环境温度为25℃。并且采用宽场显微镜检测检测荧 光值。

试验结果：

α=0.7875，β=0.1630，γ=1.1226

a=41750，b=9886

C57BL/6J小鼠胰岛中A细胞与B细胞的比例R=13.4%。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。