一种丹参注射液的基于组分结构的质量控制检测方法

摘要

本发明提供了一种丹参注射液的基于组分结构的质量控制检测新方法。本发明通过丹参注射液内表征整体性质的酚酸组分和糖类组分来判定质量的优劣，最佳的标准为：酚酸组分：糖类组分含量为(1%-95%):(90%-1%)；并且丹参酚酸内丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去丹参素丹酚酸E2、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、迷迭香酸各成分的构成比分别为(1%-95%):(5%-95%):(1%-20%):(1%-20%):(5%-20%):(1%-50%):(5%-20%):(1%-10%):(1%-20%):(1%-20%)；酚酸组分和糖类组分的含量总和大于总固形物的35-90%；酚酸组分的含量不低于总固形物的40-80%。

说明书

技术领域

本发明涉及中药复方制剂的质量控制标准，尤其是一种用于丹参注射液的基于组分结构 的质量控制检测方法领域。

背景技术

中药制剂的药效物质基础是由多个组分按照一定的构成比组成的具有整体特征的成分 群。现代药理学和植物化学研究结果表明，中药制剂发挥药效的物质基础非某单一成分起作 用，而是通过多靶点、多成分实现协同作用。目前，研究人员逐渐意识到中药制剂物质基础 研究及质量控制不能走传统的寻求单体的植化途径，以某活性成分或毒性成分的含量制定质 量标准，而是要基于中药的整体观，以“组分”为切入点，阐明中药的物质基础并最终达到 符合整体特点的中药质量控制的目的。中药物质基础“组分结构理论”认为中药制剂物质基 础是一个有序的整体，具有“三个层次多维结构”，是由多种组分组成，而每一组分内也由多 个的成分一定配比构成，组分间与组分内都存在一定的结构特征，这与目前以某指标含量高 低来控制中药制剂质量的方法相比，既实现了可控性，又体现了中药的整体性。

丹参注射液为临床常用的中药制剂，具有活血化瘀、理气开窍、扩张血管和增进冠状动 脉血流量的作用，用于心绞痛、心肌梗死等疾病的预防和治疗。丹参注射液主要含有水溶性 丹参酚酸类化合物和糖类，如丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去丹参素丹 酚酸E2、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、迷迭香酸等。研究显示，这些化合物 都具有一定的心脑血管保护作用。

发明内容

发明目的：

本发明是要依据中医药整体性和系统性的特点，解决丹参注射液的质量控制的现有不足， 提供一种代表组分特征的多维结构质量控制方法。

技术方案：

一种丹参注射液的基于组分的质量控制检测方法，该方法的特征为对丹参注射液中酚酸 和糖类组分的组分间组成结构和组分内结构进行控制，采用HPLC指纹图谱、柱前衍生化 HPLC及NMR技术测定代表整体性的有限成分，从而整体并系统性地控制丹参注射液组分及 成分内成分之间的含量比例。衡量丹参注射液质量的最佳标准为：

酚酸组分：糖类组分的含量控制范围为(1%-95%):(90%-1%)；并且丹参酚酸内丹参素、 原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去丹参素丹酚酸E2、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸 C、丹酚酸D、迷迭香酸各成分的构成比分别为(1%-95%):(5%-95%):(1%-20%):(1%-20%): (5%-20%):(1%-50%):(5%-20%):(1%-10%):(1%-20%):(1%-20%)；酚酸组分和糖类组分的含量 总和大于总固形物的35-90%；酚酸组分的含量不低于总固形物的40-80%。

有益效果：

中药制剂产品是由众多化学成分通过协同作用发挥效应。中药制剂产品的药效物质基础 是由多组分或多成分构成的某一组分组成，各组分之间的生物活性存在显著差异，作用靶点 及机制也不尽相同；组分内各化合物结构也存在着差异，生物活性也存在着差异，因此，这 些组分及成分发挥最佳药效的物质基础构成存在着一定的独特性，即组分之间或组分内化合 物之间存在着独特的组成结构特征。丹参注射液主要包括酚酸和糖类组分，这些组分具有一 定的保护心血管作用，研究显示丹参酚酸具有神经和脑缺血保护、保护心肌损伤、抗血栓和 抑制血小板活化、改善糖尿病血管并发症、抑制血管细胞的增殖等作用。糖类也是其功效的 物质基础构成组分之一，丹参糖类具有抗氧化活性和提高小鼠耐缺氧能力，还可通过上调 prohibitin蛋白表达发挥保护H₂O₂致心肌细胞损伤的作用。因此，对丹参注射液的质量控制， 不能仅以丹参素或原儿茶醛来代替整体活性成分。重要的是，构成药效物质基础的组成结构 特征被忽略。因此，基于组分结构理论，阐明丹参注射液的酚酸和糖类组分间及组分内的结 构特征，将实现对丹参注射液质量的真正控制，保证其疗效和安全性。本发明克服了现有的 对丹参注射液产品质量控制检测方法的不足，可能成为一种丹参注射液的质量控制检测新方 法。

附图说明

图1丹参注射液多维结构质量控制示意图

图2丹参注射液中酚酸类成分指纹图谱，(其中1.5-羟甲基糠醛；2.丹参素钠;3.原儿茶醛; 4.咖啡酸;5.去丹参素丹酚酸E1;6.去丹参素丹酚酸E2;7.丹酚酸D;8.迷迭香酸;9.丹酚 酸B;10.丹酚酸A；11,丹酚酸C)

图3250ml:16g规格丹参注射液酚酸成分HPLC指纹图谱

图4250ml:12g规格丹参注射液酚酸成分HPLC指纹图谱

图5丹参注射液糖类水解HPLC图（1.甘露糖2.葡萄糖3.半乳糖)

图6丹参糖类组分核磁脉冲序列图

图7丹参糖类组分化学位移图

图8丹参糖类组分面积积分图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的用于丹参注射液的基于组分结构的质量控制检测方法进行详 细说明：

实施例

质量控制检测方法步骤一：

测定丹参注射液中的丹参总酚酸含量，对各酚酸成分进行定性定量表征

1.仪器：

高效液相色谱系统：Agilent1100美国安捷伦科技公司(配置真空脱气机，自动进样器， 四元泵，VWD G1314A，DAD G1315B；Agilent ChemStation A10.02色谱工作站)；

2.色谱条件

色谱柱：Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱及Shiseido MG C18保护 柱(4.6×12.5mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.075%磷酸水，洗脱程序为：乙腈(A)0-17min， 5%A-12%A；17-42min，12%A-18%A；42-46min，18%A-18%A；46-58min，18%A-27%A； 58-65min，27%A-27%A；65-75min，27%A-50%A；75-85min，50%A-80%A。流速为1.0 mL/min；检测波长为270nm；柱温为30oC；进样体积为10μL。

3.对照品溶液的配制:

精密称取丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去丹参素丹酚酸E2、丹酚 酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、迷迭香酸共10个酚酸类成分对照品：

分别置于10ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至10ml，各对照品浓度依次为100.53 μg/ml、95.60μg/ml、85.49μg/ml、74.26μg/ml、58.62μg/ml、120.36μg/ml、57.18μg/ml、 66.21μg/ml、59.78μg/ml、117.64μg/ml。各取1ml混合得混合对照品溶液。

4.实验方法与结果：

取对照品和丹参注射液(250ml:16g和250ml:12g规格)样品溶液，按色谱条件进行分析， 测定丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去丹参素丹酚酸E2、丹酚酸A、丹 酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、迷迭香酸的峰面积，计算丹参注射液中总酚酸含量；总酚酸 和糖类组分、其他组分构成比；总酚酸内各成分构成比。具体结果见图2、图3和图4、表1、 表2、表3。

表1丹参注射液中总酚酸含量（250ml：16g）

表2丹参注射液中总酚酸含量（250ml：12g）

表3丹参注射液总酚酸和糖类组分、其他组分构成比；总酚酸内各成分构成比

质量控制检测方法步骤二：

对丹参注射液中的糖类成分进行定性定量表征。HPLC色谱图见图5。

1.仪器：

高效液相色谱系统：Agilent1100美国安捷伦科技公司(配置真空脱气机，自动进样器， 四元泵，VWD G1314A，DAD G1315B；Agilent ChemStation A10.02色谱工作站)；

2.色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱及SB-C18（4.6×10mm,5μm） 保护柱；流动相为乙腈(A)-0.05M磷酸二氢钾水溶液进行梯度洗脱:1-25min，16.5%-16.5%A； 25-55min，16.5%-24%A；55-60min，24%-24%A；流速：1.0ml/min；检测波长：245nm；柱 温：45℃；进样量：10μl。

3.标准品溶液的配制

取新配制的单糖对照品(甘露糖4.97mg/ml，葡萄糖5.04mg/ml，半乳糖5.16mg/ml）各100μl 混合制得混合单糖对照品，加入0.15M的NaOH溶液300μl，混合，取100μl加入0.1M的1- 苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液100μl，70℃水浴中反应30min后冷却至室温，加 入0.075M的盐酸100μl中和，加入0.7ml的水及1ml的三氯甲烷溶解，涡旋2min后静置， 分层后用注射器仔细抽出下层三氯甲烷层，剩余水层再加入1ml三氯甲烷涡旋振荡混合，重 复以上过程3次。最终将水层用0.45μm滤膜过滤后，备用。

4.样品溶液的制备

取0.5ml丹参注射液，加入0.5ml水，混匀，加入0.15M的NaOH溶液1ml，混匀，取100μl 加入0.2M的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液100μl，70℃水浴中反应30min后 冷却至室温，加入0.075M的盐酸100μl中和，加入0.7ml的水及1ml的三氯甲烷溶解，涡旋 2min后静置，分层后用注射器仔细抽出下层三氯甲烷层，剩余水层再加入1ml三氯甲烷涡旋 振荡混合，重复以上过程3次。最终将水层用0.45μm滤膜过滤后，备用。

5.实验方法与结果：

取对照品和丹参注射液样品溶液，按色谱条件进行分析，测定样品溶液中各单糖的峰面 积，与甘露糖，葡萄糖，半乳糖对照品进行比较，计算丹参注射液中糖类组分的含量。结果 见表4。

表4糖类成分含量测定结果

质量控制检测方法步骤三：

采用磁共振NMR技术对丹参注射液固体物中糖类组分的测定

1.样品的配制

缓冲液：1.5M PBS，0.05%TSP（g/100ml）；

供试品溶液：丹参提取固体0.7948g加2ml双蒸水，涡旋，离心（无沉淀），取上清液 500ml加50ml缓冲液，混匀即得。

2.仪器参数设置

核磁脉冲-gFlipsy（图6）

参数设置如下：

3.计算公式

$C_{\mathrm{TSP}}(\mathrm{mol}/\mathrm{ml})=\frac{0.05g*50\mathrm{ul}}{100\mathrm{ml}*550\mathrm{ul}*M_{\mathrm{TSP}}}$

M_TSP:TSP分子量  C_TSP核磁管中TSP的摩尔浓度

4.化合物归属及含量

见表5、图7、图8。

表5 糖类成分磁共振NMR测定结果

发明人经过多次实验发现，当丹参注射液中的酚酸组分：糖类组分的含量控制范围为 (1%-95%):(90%-1%)；并且丹参酚酸内丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、去丹参素丹酚酸E1、去 丹参素丹酚酸E2、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸D、迷迭香酸各成分的构成比分 别为(1%-95%):(5%-95%):(1%-20%):(1%-20%):(5%-20%):(1%-50%):(5%-20%):(1%-10%): (1%-20%):(1%-20%)；酚酸组分和糖类组分的含量总和大于总固形物的35-90%；酚酸组分的 含量不低于总固形物的40-80%时，该丹参注射液的质量为最佳。

以上实施例为本发明的丹参注射液的质量控制检测方法的全部步骤，而目前对丹参注射 液的质量控制仅以成分丹参素和原儿茶醛为指标，很明显这与丹参注射液中所含有的多活性 成分发挥药效的整体作用特点相违背，也是不科学的质控检测方法。因此，本发明的采用丹 参注射液的多组分及组分内组成结构为丹参注射液的质量控制检测方法得出的最佳检测标准 更为有效、科学合理。在现有公开文献报导中，皆为对丹参注射液的相关专利多是针对提取 工艺或制剂工艺，还未见本发明的针对组分结构特征的质量控制整体检测方法。