中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒

摘要

本发明公开中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒。该引物组为SEQNo.1/SEQNo.4、SEQNo.2/SEQNo.5和SEQNo.3/SEQNo.6。该试剂盒包括2×TaqPCR预混液、5U/μl酶BglI及10×酶切缓冲液A、5U/μl酶HpaII及10×酶切缓冲液B、5U/μl酶ClaI及10×酶切缓冲液C、10mg/mlBSA、对照DNA模板、10pM扩增引物。该方法用引物组对提取到的DNA进行PCR扩增，然后酶切得到酶切产物，最后进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果与标准电泳图谱比对得出结果。该检测方法简单、反应稳定性、重复性好，且节约成本。

说明书

技术领域

本发明属水产种质检测领域，涉及中华鳖四种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒，具体涉及一种中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系新品种种质鉴定的快速检测方法及其引物组及试剂盒。

背景技术

中华鳖（Pelodiscus sinensis）,俗称团鱼、甲鱼等，隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，广泛分布于我国各地，现已发展成为我国重要的名特水产养殖品种。据统计，2012年全国中华鳖养殖产量达33余万吨，产值逾200亿元，苗种放养量约10亿只，其中一半以上的苗种依赖境外输入。目前我国中华鳖养殖的种类主要包括中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系等，不同种群的中华鳖生长速度差异较大，鳖苗市场价格也变化较大。如2012年中华鳖太湖种群和黄河种群的鳖苗价格2~3元/只，台湾种群的鳖苗售价1~2元/只，中华鳖日本品系苗价4~6元/只。为满足养殖生产需要，各地加大了中华鳖的引种与扩繁，伴随而来的是中华鳖种质的混杂，严重影响中华鳖种质资源保护工作。同时，因优质鳖苗市场价格高，利润大，市场上出现了一些不法商贩以劣质鳖苗冒充中华鳖日本品系等优质鳖苗来谋取非法暴利的现象，给养鳖者造成重大的经济损失。因此，准确鉴别中华鳖的种质来源，已成为我国中华鳖种质资源保护与育种研究的首要工作之一。

根据现行中华鳖种质标准GB21044-2007要求，主要采用外部形态、内部构造、生化同工酶、染色体核型等方法进行种质鉴定，但该标准无法对不同种群的中华鳖进行区别鉴定。常规检测中华鳖不同种群的鉴别方法有形态标记鉴别、同工酶标记鉴别和mtDNA线粒体序列鉴别法等，但外部形态标记鉴别法受中华鳖养殖环境影响较大，容易出现误判；同工酶标记具有组织特异性和个体差异，并且受到个体发育阶段的影响，因而无法达到较高的准确度要求；RAPD方法重复性差、且对模板要求高，因而鉴定结果的可靠性也受到限制；mtDNA线粒体序列鉴别法尽管准确，但需要借助大型测序仪来完成，大多实验室往往因仪器价格昂贵而没能采购，从而只能将扩增好的样品外送测序后再进行种质鉴别，时效性不能保证。经国内外文献查询，尚未见有稳定、可靠、简便的中华鳖四种不同种群种质鉴别的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测引物，它们是3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6：

SEQ No.1：5’-GAACCCCTATCACGAAAACG-3’，浓度为10pM；

SEQ No.2：5’-TACAATATTACTCACAGACCGAAAC-3’，浓度为10pM；

SEQ No.3：5’-ATAGGACAACCACGATTTCAGC-3’，浓度为10pM；

SEQ No.4：5’-GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG-3’，浓度为10pM；

SEQ No.5：5’-TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT-3’，浓度为10pM；

SEQ No.6：5’-TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC-3’，浓度为10pM。

本发明的另一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测试剂盒。

所述的试剂盒组成包括pH值为 8.3的2×Taq PCR 预混液、浓度为5U/μl的限制性内切酶Bgl I及对应的10×酶切缓冲液A、浓度为5U/μl的限制性内切酶Hpa II及对应的10×酶切缓冲液B、浓度为5U/μl的限制性内切酶Cla I及对应的10×酶切缓冲液C、浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白BSA、4种已知来源中华鳖的对照DNA模板和浓度为10pM的3对扩增引物。

所述的2×Taq PCR 预混液为0.1U/μl Taq酶、500uM dNTP、2×PCR缓冲液的混合液；

所述10×酶切缓冲液A为1M 、500mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.9；

所述10×酶切缓冲液B为100mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.0；

所述10×酶切缓冲液C为500mM 、200mM 、100mM 、10mM 的混合液。

本发明的又一个目的是提供了中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测方法。

步骤(1).总DNA的提取：

按照常规方法提取待测样品的DNA，然后将提取到的DNA稀释至50～150ng/μl，保存于-20℃；

该DNA提取方法可参考Takara 总DNA提取试剂盒体取总DNA。

步骤(2).PCR扩增：

以步骤(1)提取到的DNA为模板，分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6进行PCR扩增，同时也对已知的中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系新品种对照DNA模板进行PCR扩增。

所述的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物、1μl对应的下游引物、1μl模板和余量的ddH₂O组成。

其中，扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4的上游引物为SEQ No.1，对应的下游引物为SEQ No.4；扩增引物SEQ No.2/ SEQ No.5的上游引物为SEQ No.2，对应的下游引物为SEQ No.5；扩增引物SEQ No.3/ SEQ No.6的上游引物为SEQ No.3，对应的下游引物为SEQ No.6。

所述的2×Taq PCR 预混液为0.1U/μl Taq酶、500uM dNTP、2×PCR缓冲液的混合液。

所述的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min。

步骤(3).酶切反应：

对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物进行Bgl I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液A；对扩增引物SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物进行Hpa II酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液B；对扩增引物SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物进行Cla I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液C。

所述的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2)某一扩增引物或对照DNA模板扩增得到的扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液、0.25μl BSA、5U限制性内切酶和余量的ddH₂O组成。

所述的酶切反应条件为酶切反应体系在37℃下孵育4小时以上。

步骤(4).标准电泳图谱的建立：

将对照DNA模板扩增得到的扩增产物的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，构建每种中华鳖的标准PCR-RFLP图谱。

步骤(5).待测样品的种质来源鉴定：

将待测样品的三种扩增引物扩增得到的扩增产物的酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，引物对SEQ No.1/SEQ No.4的扩增产物经Bgl I酶切后，在黄河种群中出现长度为1450bp的一条带，而其他种群中出现618bp和832bp的两条带；引物对SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物经Hpa II酶切后，在黄河种群和台湾种群中出现长度为715bp的一条带，在日本品系新品种和太湖种群中出现330bp和385bp的两条带；SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I酶切后，在日本品系新品种中出现长度为980的一条带，在其他种群中出现长度为481bp和499bp的两条带。将电泳结果与标准电泳图谱进行比对，得出结果。

所述的对照DNA模板为已知的太湖种群、台湾种群、黄河种群和日本品系这4种已知的中华鳖DNA。

与现有中华鳖的种质鉴定方法相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明是基于PCR-RFLP基础上对中华鳖的种质进行鉴定，对PCR反应的模板要求不高，反应稳定性和重复性好；

（2）本发明操作步骤主要包括PCR扩增、酶切和电泳检测，操作简便，结果直观、准确、灵敏、可靠；

（3）本发明对中华鳖进行种质鉴定只需将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并与标准种质图谱进行对比，无需测序，大大节省了检测时间和检测成本。

附图说明

图1为已知种质来源的四种中华鳖种群的标准PCR-RFLP图谱，其中泳道1～3为太湖种群，泳道4～6为台湾种群，泳道7～9为日本品系新品种，泳道10～12为黄河种群，泳道13～15为未经酶切处理的三种扩增产物谱带，其中每个群体的三条泳道自左至右依次为SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物的酶切电泳结果；

图2为SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物经Bgl I酶切后的电泳结果，其中M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群的5个个体；泳道6～10：台湾种群的5个个体；泳道11～15：日本品系新品种的5个个体；泳道16～20：黄河种群的5个个体；

图3为SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I酶切后的电泳结果，其中M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群的5个个体；泳道6～10：台湾种群的5个个体；泳道11～15：日本品系新品种的5个个体；泳道16～20：黄河种群的5个个体；

图4为SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物经Hpa II酶切后的电泳结果，其中M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群的5个个体；泳道6～10：台湾种群的5个个体；泳道11～15：日本品系新品种的5个个体；泳道16～20：黄河种群的5个个体。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的分析。

若无特殊说明，下面实施例所用的PCR相关试剂均来自天根（TianGen）公司；所用限制性内切酶相关试剂均来自New England Biolab （NEB）；琼脂糖、SYBR Green核酸染料均来自上海生工。

如图1所示，泳道1～3为太湖种群，泳道4～6为台湾种群，泳道7～9为日本品系新品种，泳道10～12为黄河种群，泳道13～15为未经酶切处理的三种扩增产物谱带，其中每个群体的三条泳道自左至右依次为SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物的酶切电泳结果，正确的标准图谱应与图1中的条带大小一致。

实施例1：四种不同种群中华鳖标准PCR-RFLP图谱的构建：

（1）总DNA的提取：取待测样中华鳖组织样品，参考天根总DNA提取试剂盒体取总DNA（也可用其他试剂盒提取），将提取的DNA稀释至50～150ng/ul，保存于-20℃；

（2）PCR扩增：以提取的总DNA为模板，分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6进行PCR扩增，同时也对对照模板DNA进行PCR扩增，

所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物、1μl对应的下游引物、1μl模板和余量的ddH₂O组成。

所用的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min；

（3）酶切反应：对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物进行Bgl I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液A，对扩增引物SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物进行Hpa II酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液B，对扩增引物SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物进行Cla I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液C；

所用的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2)对照DNA模板扩增得到的扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液、0.25μl BSA、5U限制性内切酶和余量的ddH₂O组成。酶切反应体系在37℃孵育4小时以上；

（4）标准电泳图谱的建立：将对照DNA模板的PCR扩增产物的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，泳道排列顺序如图1所示，其中泳道1～3为太湖品系，泳道4～6为台湾品系，泳道7～9为日本品系，泳道10～12为黄河品系，泳道13～15为三种扩增产物未经酶切处理的条带，其中每个群体的三条泳道自左至右依次为SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物的酶切电泳结果，正确的标准图谱应与图1中的条带大小一致。

实施例2：中华鳖黄河种群的种质鉴定：

（1）总DNA的提取：取待测中华鳖组织，按照实施实例1中的方法提取总DNA；

PCR扩增：以提取的总DNA为模板，用引物对SEQ No.1 / SEQ No.4进行PCR扩增；

所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物SEQ No.1、1μl对应的下游引物SEQ No.4、1μl模板和余量的ddH₂O组成，PCR扩增反应条件与实施实例1中相同；

（2）酶切反应：用限制性内切酶BglI对步骤（2）得到扩增产物进行酶切；

所用的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2) 得到扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液A、0.25μl BSA、5U限制性内切酶BglI和余量的ddH₂O组成。酶切反应体系在37℃孵育4小时以上；

（3）待测样品的种质来源鉴定：如图2所示，M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群；泳道6～10：台湾种群；泳道11～15：日本品系新品种；泳道16～20：黄河种群。将步骤（3）得到的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带为1400bp左右的一条带，则为黄河种群，若出现600bp和800bp左右的两条带，则不是黄河种群；

（4）反应的稳定性与重复性：如图2所示，每个群体的5个个体均表现出一致的结果，说明此反应重复性和稳定性良好。

实施例3：日本品系新品种的种质鉴定：

（1）总DNA的提取：总DNA的提取方法与实施实例1中相同；

（2）PCR扩增：以提取的总DNA为模板，用引物对SEQ No.3 / SEQ No.6进行PCR扩增；

所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物SEQ No.3、1μl对应的下游引物SEQ No.6、1μl模板和余量的ddH₂O组成，PCR扩增反应条件与实施实例1中相同；

（3）酶切反应：用限制性内切酶ClaI对步骤（2）得到扩增产物进行酶切，

所用的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2) 得到扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液C、0.25μl BSA、5U限制性内切酶ClaI和余量的ddH₂O组成。酶切反应体系在37℃孵育4小时以上；

（4）待测样品的种质来源鉴定：如图3所示，M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群；泳道6～10：台湾种群；泳道11～15：日本品系新品种；泳道16～20：黄河种群。将步骤（3）得到的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带为1000bp左右的一条带，则为日本品系新品种，若出现500bp左右的一条带，则不是日本品系新品种。

（5）反应的稳定性重复性：如图3所示，每个群体的5个个体均表现出一致的结果，说明此反应重复性和稳定性良好。

实施例4：台湾种群的种质鉴定：

（1）总DNA的提取：总DNA的提取方法与实施实例1中相同；

（2）PCR扩增：以提取的总DNA为模板，分别对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4和SEQ No.2 / SEQ No.5进行PCR扩增，

对SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增：所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物SEQ No.1、1μl对应的下游引物SEQ No.4、1μl模板和余量的ddH₂O组成，PCR扩增反应条件与实施实例1中相同；

对SEQ No.2 / SEQ No.5的扩增：所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物SEQ No.2、1μl对应的下游引物SEQ No.5、1μl模板和余量的ddH₂O组成，PCR扩增反应条件与实施实例1中相同；

（3）酶切反应：用限制性内切酶Bgl I对SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物进行酶切，酶切反应体系和条件与实施例2中的步骤（3）相同。用限制性内切酶Hpa II对SEQ No.2 / SEQ No.5的扩增产物进行酶切，所用的酶切反应体系为25μl由15μl SEQ No.2 / SEQ No.5扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液B、0.25μl BSA、5U限制性内切酶Hpa II和余量的ddH₂O组成。酶切反应体系在37℃孵育4小时以上；

（4）待测样品的种质来源鉴定：将步骤（3）得到的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，若SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物经Bgl I酶切后出现600bp和800bp左右的两条带（如图2所示），且SEQ No.2 / SEQ No.5的扩增产物经Hpa II酶切后仍为700bp左右的一条带（如图4所示，M：DNA Maker；泳道1～5：太湖种群；泳道6-10：台湾种群；泳道11-15：日本品系新品种；泳道16～20：黄河种群），则为台湾种群，否则为其他种群。

（5）反应的稳定性重复性：如图2、图4所示，每个群体的5个个体均表现出一致的结果，说明此反应重复性和稳定性良好。

实施例5：任意一种中华鳖种群的种质鉴定：

（1）总DNA的提取：取待测中华鳖组织，按照实施例1中的方法提取总DNA；

（2）PCR扩增：以提取的总DNA为模板，分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6进行PCR扩增，同时也对对照DNA模板进行PCR扩增；

所用的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游、1μl对应的下游引物、1μl模板和余量的ddH₂O组成。

所用的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min；

（3）酶切反应：对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物进行Bgl I酶切（对应的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液A），对扩增引物SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物进行Hpa II酶切（对应的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液B），对扩增引物SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物进行Cla I酶切（对应的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液C；

所用的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2)某一扩增引物扩增得到的扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液、0.25μl BSA、5U限制性内切酶和余量的ddH₂O组成。酶切反应体系在37℃孵育4小时以上；

（4）种质来源的鉴定：将三种酶切产物分别进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果与实施例1中标准PCR-RFLP图谱（图1）中比对，若吻合则可认定为同一种质来源。

上述实施例所用的对照DNA模板为已知的太湖种群、台湾种群、黄河种群和日本品系这4种已知的中华鳖DNA。

上述实施例所用的2×Taq PCR 预混液为0.1U/μl Taq酶、500uM dNTP、2×PCR缓冲液的混合液；10×酶切缓冲液A为1M 、500mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.9；10×酶切缓冲液B为100mM 、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.0；10×酶切缓冲液C为500mM 、200mM 、100mM 、10mM 的混合液。

上述实施例所提及的3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6即为6条引物，具体如表1：

表1  6条引物序列

引物名称引物序列（5’-3’）浓度SEQ No.1  GAACCCCTATCACGAAAACG10pMSEQ No.2  TACAATATTACTCACAGACCGAAAC10pMSEQ No.3  ATAGGACAACCACGATTTCAGC10pMSEQ No.4  GCTATTTTTACGGCGGTTTTTG10pMSEQ No.5  TGGGTAGTCAGAATAGCGTCGT10pMSEQ No.6  TATTAGTGTAGCTTCTGGTCCCTC10pM

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江省水产技术推广总站

 

<120>  中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒

 

<130>  1

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

gaacccctat cacgaaaacg                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

tacaatatta ctcacagacc gaaac                                           25

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

ataggacaac cacgatttca gc                                              22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

gctattttta cggcggtttt tg                                              22

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

tgggtagtca gaatagcgtc gt                                              22

 

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

tattagtgta gcttctggtc cctc                                            24