树鼩IL-2构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法

摘要

一种以树鼩IL-2质粒为标准品的TAQMAN探针荧光定量PCR方法，包括以树鼩IL-2基因为目标，设计TAQMANPCR引物和探针，设计实验找到最优条件下引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯树鼩IL-2质粒计算IL-2基因片段拷贝数，以计算好的树鼩IL-2质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为105～109copies阳性质粒建立标准曲线，并检测其灵敏性。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种以克隆的树鼩IL-2质粒为标准品，在 此基础上建立的以TAQMAN为探针的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

白细胞介素‐2（Interleukin‐2,IL-2）主要由激活淋巴细胞产生的一类Th1型 细胞因子，它能促进T细胞、NK细胞、B细胞的分化成熟及激活其生物活性， 诱导淋巴因子激活杀伤细胞（LAK），并通过淋巴因子和天然杀伤细胞破坏肿瘤 细胞，还能促进许多淋巴因子如干扰素，肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体 生成，从而大大增强机体免疫功能，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病 的治疗中具有重要作用。IL-2还可作为免疫佐剂用于某些淋巴组织增生性疾病 及癌症的治疗，且IL-2拮抗剂可用来抑制器官移植排斥反应。在人类医学方面， 重组IL-2在提高免疫抗病机能、抗感染和治疗癌症等方面获得了广泛应用

树鼩（tree shrew，Tupaia belangeri）是一种生活在热带和亚热带地区的哺 乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体 型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优 点,常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类 目（包括人类）的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手 足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛应用。

丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要由血液/体液传播，占输 血后肝炎的70%。HCV感染是全世界范围内造成慢性肝病的主要原因。WHO估 计全球有1.7亿人感染丙型肝炎病毒。然而，到目前为止还没有相关的疫苗和有 效治愈的药物，究其原因在于没有理想的小动物模型。致使其慢性感染机制不清 楚，导致于HCV疫苗研制和临床治疗举步维艰。

有研究表明树鼩不仅可以被丙型肝炎病毒（HCV）在体内感染，而且树鼩 的原代肝细胞也可以在体外被感染，也有研究证实树鼩有效感染HCV后，可发 展为慢性肝炎、肝脂肪变性、肝纤维化、肝硬化结节及肿瘤,表明树鼩是可作为 模型动物用以研究丙型肝炎发病机制，预防治疗及新药研发的新型实验动物。也 有研究证实，中缅幼龄树鼩可感染EV71，以及可成功建立糖尿病模型，这为研 究HCV慢性感染机制、手足口病及糖尿病发病机制的研究提供了良好的研究平 台。

有专家证实，在慢性及重型丙型肝炎感染者血清中IL-2水平明显上升，且 上升幅度与病情的轻重和病程长短有密切关系。在手足口患儿血清中，IL-2水平 显著低于正常儿组，造成患儿IL-2水平降低的机理，可能是患儿细胞免疫水平 受到抑制之故。在1型糖尿病患儿血清中，IL-2水平明显高于正常组，且与反映 胰岛功能的C肽（CP）、胰岛素呈负相关。但目前对树鼩IL-2方面的研究鲜有 报道,致使缺乏对树鼩动物模型免疫细胞因子方面的评价指标。

发明内容

鉴于现有技术的空缺，本发明的目的在于建立树鼩特异性IL-2基因实时荧 光定量TAQMAN PCR检测方法，它是以确定的树鼩IL-2全长编码基因序列为 模板，设计特异性引物和探针，并制备标准品和标准曲线，在mRNA水平建立 实时荧光定量PCR检测树鼩IL-2的方法，为今后研究其在树鼩疾病模型中的免 疫调节机理奠定基础。建立一种稳定性好、重复性好、灵敏度高的树鼩IL-2检 测方法，从细胞因子方面，进一步证实树鼩是作为丙型肝炎、手足口病及糖尿病 研究合适的小动物模型。为HCV、EV71感染化机制、药物治疗以及疫苗研究提供 了依据，并为糖尿病的发病机理及药物治疗等的研究奠定了基础。

为了达到本发明的上述目的，本发明采取荧光定量TAQMAN PCR技术， 根据树鼩IL-2cDNA序列，设计特异性引物和探针，建立了用于检测树鼩IL-2 基因表达量的标准曲线，并检测其灵敏性。

本发明提供的技术方案如下：

一种树鼩IL-2构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法， 步骤如下：

（1）以树鼩IL-2全长编码基因片段为目标，设计TAQMAN PCR引物和探针；

（2）设计实验得到引物的退火温度、引物浓度、探针浓度并提纯质粒计算IL-2 基因片段拷贝数；

（3）以计算好的树鼩IL-2质粒，以10倍梯度稀释，配制拷贝数为10⁵～10⁹copies阳性质粒建立标准曲线；

（4）验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。

所述的树鼩IL-2寡聚核苷酸引物和探针为：

IL-2FP:5'–TGCTCTCCAGGATGCTCAC–3'，

IL-2RP:5'–AGCACTTTCTCCAGAGGTTTG–3'，

IL-2Probe:5'(FAM)–ATTTTATACACCCAGAAAGGCCACAG–(TAMRA)3'。

步骤（2）所述实验为：

A.退火温度的确定

根据本引物和探针特点分别设计退火温度55℃、56℃、57℃、58℃确定其 最佳退火温度，以PMD-19T IL-2质粒为模板应用PCR仪进行梯度扩增：dream Mix Taq酶25ul、dH₂O20ul、Tupaia-IL-2FP/RP各自2ul、模板1ul,混合均匀； 95℃3min;95℃30s,55～58℃30s,72℃45s,35个循环；72℃10min；扩增产 物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测；通过电泳结果可知：不同退火温度下都能得到 106bp的扩增片段，以57℃条件下电泳条件最清晰，条带位置正确无非特异扩增， 因此本检测体系确定Tm=57℃；

B.引物浓度的确定：

以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、清晰为引物 选择标准；以100nm、200nm及300nm3个不同浓度的IL-2TAQMAN PCR上 下游引物浓度，分别用同一浓度IL-2重组质粒为模板，共分为3个反应体系列， 同时进行RT-PCR扩增；反应体系为25uL:Realtime PCR Master Mix12.5ul、 Tupaia-IL-2FP/RP各自1ul、DEPC处理水8.5ul、模板2ul混合均匀；循环参数 为：95℃3min；95℃30s，57℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min扩增；4℃ 备用；扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测；不同引物浓度下的电泳显示：引 物200nm为最低浓度，该浓度能很好地扩增目的片段；

C.探针浓度的确定：

以相同模板浓度下循环阈值（Ct）最小、荧光信号比(Rn)活度最大为探针 选择标准；采用2um、5um、10um3个探针浓度，分别用同一浓度IL-2重组质 粒为模板，进行TAQMAN PCR检测；反应体系为25ul:2×One Step RT-PCR BufferⅡ12.5ul、Takara Ex Taq HS0.5ul、Primer Script RT Enzyme MixⅡ 0.5ul、Tupaia-IL-2FP/RP各自0.5ul、Probe溶液1ul、模板2ul、Easy dilusion7.5ul, 混合均匀；循环参数为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，40个循环；72℃5min； 4℃保存备用；观察扩增曲线和检测报告，通过不同探针浓度扩增曲线和Ct值显 示，该检测体系在2um条件下Ct值最小，Rn最大扩增曲线良好。

步骤（2）测其质粒A260/A280（1.8～2.0）根据以下公式计算拷贝数：

拷贝数（copies/m）=质量浓度（ug/ul）×阿氏常数/质粒分子量，其中，阿氏 常数为6.02×10²³；质粒分子量=一个碱基对的分子量（649）×重组质粒总长度 （bp）。

步骤（3）标准曲线的建立为将已知拷贝数的质粒按照1×10⁵～1×10⁹拷贝数浓 度进行10倍梯度稀释，得到5个不同分子量的PMD-19T IL-2阳性质粒浓度样 品，分别进行TAQMAN PCR分析，根据反应结果中样品的分子数的对数值及 其Ct值的对应关系绘制出定量标准曲线，其斜率=-3.149，截距=46.568， R2=0.998，得本检测体系线性方程为Ct=-3.149log（copynumber）+46.568。

一种以树鼩IL-2质粒为标准品的TAQMAN探针荧光定量PCR方法，包括 以树鼩IL-2基因为目标，设计TAQMAN PCR引物和探针，设计实验找到最优 条件下引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯树鼩IL-2质粒计算IL-2基 因片段拷贝数，以计算好的树鼩IL-2质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为10⁵～ 10⁹copies阳性质粒建立标准曲线，并检测其灵敏性。

其中，树鼩IL-2寡聚核苷酸引物和探针为：

IL-2FP:5'–TGCTCTCCAGGATGCTCAC–3'

IL-2RP:5'–AGCACTTTCTCCAGAGGTTTG–3'

IL-2Probe:5'(FAM)–ATTTTATACACCCAGAAAGGCCACAG–(TAMRA)3'

该方法包括：

(1)检测体系退火温度的确定

（2）检测体系探针浓度和引物浓度的确定

（3）配置10⁵～10⁹拷贝数的IL-2质粒，以此为模板建立了该检测体系的标准 曲线

（4）利用确定浓度的IL-2质粒分别10倍梯度稀释10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、 10³、10²、10¹、10⁰copies,得到动力学曲线，检测该检测体系的灵敏性

（5）并检测其重复性、稳定性和灵敏性

本发明以树鼩特异性IL-2质粒为标准品的TAQMAN探针荧光定量PCR方 法的建立，它包括的步骤概括为：

A以树鼩IL-2全长编码基因片段为目标，通过Primer Premier5.0软件在该片 段上设计合适的引物和探针。

B设计实验得到最优条件下的引物的退火温度、引物浓度、探针浓度并提纯质 粒计算IL-2基因片段拷贝数。

C以计算好的树鼩IL-2质粒，以10倍梯度稀释，配制拷贝数为10⁵～10⁹copies 阳性质粒建立标准曲线。

D验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。

附图说明

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实 施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

图1为不同退火温度下IL-2基因片段扩增电泳检测结果。

图2为不同引物浓度下IL-2基因片段扩增电泳检测结果。

图3为不同探针浓度扩增曲线和Ct值。

图4为以10⁵～10⁹copies为模板建立的扩增曲线。

图5为以10⁵～10⁹copies为模板建立的标准曲线和线性关系。

图6为检测其方法灵敏性的扩增曲线。

【具体实施方式】：

实施例1：以树鼩IL-2质粒为标准品的TAQMAN探针荧光定量PCR方法 的建立：

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）或彭秀 玲等人，基因工程实验技术，（科学技术出版社）中所述的条件，或按照制造厂 商建议的条件。

1PCR扩增及退火温度的确定

根据本引物和探针特点分别设计退火温度55℃、56℃、57℃、58℃确定其 最佳退火温度。采用下列反应体系和条件，以PMD-19T IL-2质粒为模板应用PCR 仪进行梯度扩增：dream Mix Taq酶25ul、dH₂O20ul、Tupaia-IL-2FP/RP各自 2ul、模板1ul,混合均匀。95℃3min;95℃30s,55～58℃30s,72℃45s,35个 循环；72℃10min。扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。通过电泳结果可知： 不同退火温度下都能得到106bp的扩增片段，以57℃条件下电泳条件最清晰， 条带位置正确无非特异扩增，因此本检测体系确定Tm=57℃（图1）。

2引物和探针浓度的确定：

2.1引物浓度：以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、 清晰为引物选择标准。以100nm、200nm及300nm3个不同浓度的IL-2TAQMAN PCR上下游引物浓度，分别用同一浓度IL-2重组质粒为模板，共分为3个反应 体系列，同时进行RT-PCR扩增。反应体系为25uL:Realtime PCR Master Mix 12.5ul、Tupaia-IL-2FP/RP各自1ul、DEPC处理水8.5ul、模板2ul混合均匀。 循环参数为：95℃3min；95℃30s，57℃30s,72℃1min,35个循环；72℃10min 扩增；4℃备用。扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。不同引物浓度下的电泳 显示：引物200nm为最低浓度，该浓度能很好地扩增目的片段(图2)。

2.2探针浓度：以相同模板浓度下循环阈值（Ct）最小、荧光信号比(Rn)活度 最大为探针选择标准。采用2um、5um、10um3个探针浓度，分别用同一浓度 IL-2重组质粒为模板，进行TAQMAN PCR检测。反应体系为25ul:2×One Step RT-PCR BufferⅡ12.5ul、Takara Ex Taq HS0.5ul、Primer Script RT Enzyme Mix Ⅱ0.5ul、Tupaia-IL-2FP/RP各自0.5ul、Probe溶液1ul、模板2ul、Easy dilusion 7.5ul,混合均匀。循环参数为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，40个循环； 72℃5min；4℃保存备用。观察扩增曲线和检测报告。通过不同探针浓度扩增曲 线和Ct值显示，该检测体系在2um条件下Ct值最小，Rn最大扩增曲线良好（图 3）。

3质粒拷贝数测定：

测其质粒A260/A280（1.8～2.0）根据以下公式计算拷贝数：

拷贝数（copies/m）=质量浓度（ug/ul）×阿氏常数/质粒分子量。阿氏常数为 6.02×10²³；质粒分子量=一个碱基对的分子量（649）×重组质粒总长度（bp）。 4TAQMAN PCR标准曲线的建立

将已知拷贝数的质粒按照1×10⁵～1×10⁹拷贝数浓度进行10倍梯度稀释，得 到5个不同分子量的PMD-19T IL-2阳性质粒浓度样品，分别进行TAQMAN PCR 分析，根据反应结果中样品的分子数的对数值及其Ct值的对应关系得到扩增曲 线（图4），并绘制出定量标准曲线。从上图可知本检测体系标准曲线扩增曲线 标准，线性关系良好，其斜率=-3.149，截距=46.568，R2=0.998。可得本检测 体系线性方程为Ct=-3.149log（copynumber）+46.568（图5）

5检测体系灵敏性的评价

将计算得到的标准重组质粒做10倍梯度稀释，拷贝数分别为10⁹、10⁸、10⁷、 10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies,得到动力学曲线，以Ct值>35个循环 为下限检测该体系的灵敏性。通过扩增曲线可知本检测体系可检测到10²拷贝数 级别（图6）。