树鼩IL-2和IL-6基因克隆、分子特征分析及实时荧光定量PCR方法的建立

摘要

树鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，与人类有较近的亲缘关系。由于其具有体型小、易驯化、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点，自上世纪80年代开始，就被相继用于多种人类疾病模型的建立，如丙型肝炎动物模型、乙型肝炎模型、手足口病模型及糖尿病模型等，但是，目前尚缺乏评价这些模型的细胞免疫方面的检测指标，究其原因是对树鼩免疫细胞因子方面的研究及检测方法鲜有报道，这严重阻碍了树鼩作为一种理想的人类疾病动物模型的进一步应用。
　　白介素是一类重要的细胞因子，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用，是20世纪80年代后才发现的一类细胞因子，参与机体的免疫应答和某些疾病的病理过程。CD4+辅助性T细胞分为两种不同的效应群，Th1主要增强细胞介导作用，白介素-2(IL-2)是Th1的重要细胞因子，Th2主要增强体液免疫作用，代表因子是白介素-6(IL-6)。IL-2主要由T淋巴细胞分泌，能激活多种免疫细胞，诱导T淋巴细胞、自然杀伤细胞等的增殖、分化和抗体分泌，同时可诱生分泌多种细胞因子等免疫活性物质，增强机体免疫功能，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗等中具有重要作用。IL-6又称B细胞刺激因子，几乎能影响免疫系统的所有细胞，主要诱导活化后期的B细胞大量合成分泌型Ig的mRNA从而增加Ig(IgM、IgG和IgA)的分泌。在急性炎症反应中IL-2和IL-6对多种细胞有促炎作用并诱导肝组织产生急性反应蛋白，在一定程度上反映机体病理过程。所以，IL-2和IL-6的检测为某些疾病的早期诊断和判断疾病发展、预后提供了可靠的依据。
　　本实验以获得树鼩IL-2和IL-6全长编码序列为目的，以树鼩外周血总RNA为材料，通过RT-PCR扩增，首次得到了长度分别为465bp、654bp的树鼩IL-2和IL-6全长编码序列，通过Clustal W等软件对其序列和分子特征进行分析，发现树鼩IL-2、IL-6氨基酸序列都存在自身的一些保守性序列且都表现出与人、猴较近的亲缘关系。同时，通过Discovery Studio对人和树嗣的IL-2、IL-6进行了蛋白三维空间建模，结果显示树鼩IL-2、IL-6有着与人相应分子相似的蛋白结构，但在部分表面电荷分布、糖基化位点和二硫键数目上存在差异。随后，我们以确定的树鼩IL-2、IL-6全长编码基因序列为模板，设计特异性引物和探针，并制备标准品和标准曲线，在分子水平建立实时荧光定量PCR检测树鼩血清中IL-2、IL-6的方法，为今后树鼩IL-2、IL-6单克隆抗体的制备及功能研究提供了必要条件，同时，也为今后研究IL-2、IL-6在树鼩疾病模型中的免疫调节机理奠定基础。

目录

摘要

前言

第一部分 树鼩IL-2、IL-6全长编码基因克隆及分子特征分析

一、实验材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、实验结果与分析

三．讨论

第二部分 树鼩IL-2、IL-6 TAQMAN探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

一、实验材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、实验结果与分析

三、讨论

总结与展望

参考文献

论文综述 白细胞介素-2和白细胞介素-6研究进展

附录

致谢

研究生简历

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