协同性生物分子-聚合物轭合物

摘要

协同性生物分子-聚合物轭合物是长效的、体内受控的、持续释放的和混合的生物分子协同作用体系，其增加生物活性并增强药理学性质，以实现更大的治疗效果。

说明书

发明领域

本发明涉及新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物，所述轭合物由永久 -可断裂-链接聚合物或全部-可断裂-链接聚合物与生物活性分子的连接而 产生，以协同性地增强被递送的生物分子的体内生物活性以及改善被递送 的生物分子的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）性质从而达到最佳的 治疗效果。协同性生物分子-聚合物轭合物整合了大的和小的生物分子-聚合 物轭合物在体内的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）性质的优点。本 发明还涉及新颖的协同性干扰素-α-聚合物（协同作用-干扰素-α-聚合物） 轭合物，其是体内酶控制的、连续释放的和混合的干扰素协同作用体系， 其增加生物活性并增强药理学性质，从而实现更大的干扰素-α相关的治疗。

发明背景

聚乙二醇（PEG）与生物活性分子的偶联，被称为“聚乙二醇化” （“Pegylation”），用于递送生物活性分子，通常是蛋白质和小分子。该过 程的至少一个优点是修改生物活性分子的药代动力学（PK）和药效动力学 （PD）性质，并改善生物活性分子的治疗效果。聚乙二醇化增加蛋白质和 小分子的大小和分子量，导致其在血浆中的半衰期的延迟。通常，聚乙二 醇化可改变蛋白质和治疗分子的理化性质，导致母体蛋白质和治疗分子的 生物活性下降。因此，期望优化PEG-蛋白质轭合物的PK和PD性质从而 实现其最大的治疗效果。

在现有技术中已实现了将PEG与生物活性分子共价连接，包括直链和 支链的PEG聚合物。在绝大多数情况下，利用生物活性分子的氨基作为连 接位点。Thompson等人的美国专利申请20030190304描述了聚乙二醇化试 剂。Harris等人的美国专利7,030,278哈里斯等人描述了具有邻近的反应性 基团的某些PEG衍生物。Martinez等人的美国专利5,643,575描述了某些 非-抗原性支链聚合物轭合物。Huang等人的美国专利申请20050033058描 述了某些多臂PEG聚合物。Zalipsky的美国专利5,122,614公开了某些用于 修饰多肽的活性碳酸酯。Gilbert等人的美国专利5,711,944描述了利用稳定 （永久）的直链聚乙二醇进行轭合的干扰素聚合物轭合物。Milton等人的 美国专利5,932,462描述了利用稳定的支链聚乙二醇进行轭合的干扰素聚 合物轭合物。

分子质量低于50,000道尔顿的蛋白质药物通常在体内是短寿命物种， 其具有约5-20分钟的循环半衰期。蛋白质的清除经由几种机制，包括肾脏 中的肾小球渗透、受体介导的内吞作用，和周边组织的降解，和在组织表 面或通过血清蛋白酶的蛋白水解。再考虑到蛋白质药物无法口服吸收，延 长治疗活性药物保持在循环中是临床上最重要的期望的特点。然而，在低 分子量肽和蛋白质药物的单一给药后很少能实现这种情况。实现本领域中 描述的这种目的的至少一个策略是将这样的生物分子聚乙二醇化。然而， 现有技术中聚乙二醇化方法的缺点是通过传统的永久支链或直链PEG化合 物进行聚乙二醇化的蛋白质失去生物活性。这种生物活性的损失是由于连 接至受关注的生物活性蛋白质的大的PEG聚合物所产生的空间位阻。例如， 聚乙二醇化的干扰素，如用于干扰素-α轭合的使用永久支链PEG的派罗欣 （Pegasys）或使用永久直链PEG的PEG-内含子（PEG-Intron）分别只保 留未修饰的干扰素α-2a和干扰素α-2b的抗病毒活性的7%和28％。对于许 多治疗性蛋白质，生物活性的显著损失能导致很差的PK-PD谱，这往往限 制了聚乙二醇化的治疗应用。PEG的数目和大小对蛋白质的生物活性、药 代动力学和药效动力学性质具有显著影响。

在本领域中另一个悬而未决的问题是，通过允许聚合链接的受控降解 循序延长短寿命蛋白质在体内的半衰期，是否会延长治疗性药物在体内的 利用度，从而改善临床结果。鉴于上述情况，期望有克服这些缺陷的生物 分子-聚合物轭合物。本发明克服了现有技术中的这些缺点。

发明概述

本发明的至少一个方面提供了新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物 （Ia型、Ib型、IIa型和IIb型），其是经由可断裂-链接与支链或直链聚合 物共价连接的生物分子。本申请中所用的协同性生物分子-聚合物轭合物是 长效的、受控持续释放的和/或混合的协同体系，当在体内给药时，与相应 的未轭合的生物分子相比，或者与经由不可断裂的链接与相同的聚合物轭 合的生物分子相比，其增强生物分子的生物活性并改善生物分子的药理学 性质。

本发明的至少一个方面涉及具有式I或II的协同性生物分子-聚合物轭 合物：

(P_n----L_n----R----C)_x---M或[(P----L)_n----R----C]_x---M

式I                        式II

其中M是生物活性分子；其中x是与生物分子偶联的可断裂-链接聚合 物的数目，且x≥1；其中n是n≥2；其中P是聚合物或聚合物脂质；其中 Pn是多个聚合的臂或片段，它们的类型和大小可以相同或不同；其中L是 含有至少一个可断裂链接和至少一个永久链接的功能性链接部分；或Ln 是可释放链接；且其中R是连接聚合物和生物分子的不可断裂的间隔基； C是能够与生物分子连接的偶联基团。

本发明的协同性生物分子-聚合物轭合物包括至少四种类型的轭合物， 即Ia型、Ib型、IIa型和IIb型生物分子-聚合物轭合物。Ia型协同性生物 分子-聚合物轭合物在支链的聚合物之间含有永久-可断裂-链接。Ib型协同 性生物分子-聚合物轭合物在支链的聚合物之中含有全部-可断裂-链接。IIa 型协同性生物分子-聚合物轭合物在直链聚合物之间含有永久-可断裂-链 接。IIb型协同性生物分子-聚合物轭合物在直链聚合物之间含有全部-可断 裂-链接。

因此，本文公开的用于本发明的协同性生物轭合物的新颖的永久-可断 裂-链接或全部-可断裂-链接能够在构造中含有支链或直链的聚合物。I型是 支链的可断裂-链接聚合物且II型是直链的可断裂-链接聚合物。本文使用 的可断裂链接包括体内可断裂的、血浆中可断裂的、酶促可断裂的或pH- 依赖性可水解的链接。

I型支链的可断裂-链接聚合物包括永久-可断裂-链接支链聚合物（Ia 型）和全部-可断裂-链接支链聚合物（Ib型）。II型直链的可断裂-链接聚合 物包括永久-可断裂-链接直链聚合物（IIa型）和全部-可断裂-链接直链聚 合物（IIb）。本文使用的永久-可断裂-链接支链聚合物含有可断裂链接和永 久链接两者，其中Ln链接是可断裂-永久-混合-链接。全部-可断裂-链接支 链聚合物仅包含可断裂-链接，其中Ln仅是可断裂的链接。

在血浆中和/或在体内，永久-可断裂-链接聚合物的Ia型或IIa型协同 性生物轭合物经由酶反应而被断裂并转化成较小的部分，包括较小尺寸的 生物活性聚合物-间隔基-生物分子片段和聚合物。

在血浆中和/或在体内，全部-可断裂-链接聚合物的Ib型或IIb型协同 性生物轭合物经由酶反应而被降解成较小的部分，包括较小尺寸的生物分 子-间隔基片段和聚合物。

本发明的至少一个优点是，本发明的生物轭合物被降解成多个不仅具 有适当的立体特性以发挥其生物活性的生物活性片段，而且被断裂成很容 易从体内排出或清除的部分。与之相反，现有技术中的传统蛋白质轭合物 是经由链接聚合臂的永久链接而链接的支链聚合物，因此，这种聚合物在 血浆中保持稳定，结果是加剧系统毒性和非降解性聚合物部分的不期望的 组织积累。

本发明的另一个实施方式体现在以下式III中，其中在式II的框架内， n=2。据此，协同性生物分子-支链聚合物轭合物由具有以下结构的式III表 示：

式III

因此，对于Ia型永久-可断裂-链接（混合-永久-可断裂链接）支链聚合 物，L₁是永久链接且L₂是可断裂链接。

对于Ib型全部-可断裂-链接支链聚合物，L₁和L₂均为可断裂链接。

当n=2时，式I的至少另一个实施方式是由具有式IV的结构表示的协 同性生物分子-直链聚合物轭合物：

(P₂…L₂-P₁-L₁-R-C)_x-M    式IV

因此，对于IIa型永久-可断裂-链接直链聚合物，其中L₁是永久链接， 且其中L₂是可断裂链接。

对于IIb型全部-可断裂-链接直链聚合物，L₁和L₂均为可断裂链接。

新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物（协同作用-生物聚合物），是体 内受控的、连续释放的和混合的生物分子-聚合物轭合物协同作用体系。协 同性生物分子-聚合物轭合物通过体内酶促反应而被缓慢降解成尺寸更小 但活性更高的生物分子-聚合物片段（或生物分子-间隔基）轭合物。由协同 性生物分子-聚合物轭合物和释放的生物分子-聚合物片段（或生物分子-间 隔基）轭合物所产生的增强的组合生物活性为生物分子相关的治疗提供药 物协同作用。本发明的协同性生物分子-聚合物轭合物是独特的生物分子递 送体系，其进一步增强生物分子的药代动力学（PK）和药效动力学（PD） 性质，以达到最佳的治疗效果。

本发明的主要优点之一是协同性生物分子-聚合物轭合物经由大生物 分子-聚合物轭合物和释放的较小的生物分子-聚合物轭合物组合的生物活 性而在体内产生混合的协同作用的生物活性的能力。不同于传统的支链聚 合物-生物分子轭合物，其仅含有永久的聚合链接，从而轭合物在血浆中不 释放其聚合臂，因此，其具有固定的生物活性。

本发明的至少另一个优点是独特的协同性生物分子-聚合物轭合物，其 整合了大的生物分子-聚合物轭合物的PK性质的优点和小的生物分子-聚合 物（或生物分子-间隔基）轭合物的PD性质的优点，以便使得生物分子- 聚合物轭合物的整体PK-PD谱最大化，以达到有益的治疗效果。

额外的优点是协同性生物分子-聚合物轭合物提供链接断裂机理，以通 过在体内释放大的聚合物并从而降低毒性而减小生物分子-聚合物的大小。 在用于预防性疗法方面，例如在用于血友病的VII、VIII、IX因子等方面， 协同性生物分子-聚合物轭合物提供优于传统的蛋白质-聚合物的优点。

新颖的协同性生物分子-聚合物轭合物提供体内混合协同作用的生物 活性和药理学性质，以在血浆中达到增加的、恒定的和持续的生物分子药 物活性。因此，协同性生物分子-聚合物轭合物提供优于传统的聚合物轭合 物的巨大益处。

本发明的另一方面提供了制备协同性生物分子-聚合物轭合物的方法。 在本发明的这一方面，描述了用于制备协同性生物分子轭合物的上述永久- 可断裂-链接聚合物和全部-可断裂-链接聚合物的合成方法。

本发明的另一方面涉及永久-可断裂-链接支链聚合物与干扰素-α连接 以产生协同性干扰素-α-聚合物轭合物（协同作用-IFN-α聚合物轭合物）。 新颖的协同作用-IFN-α聚合物轭合物在体内经由酶促反应释放部分聚合臂 并转化成更小的但活性更高的干扰素-α聚合物轭合物，导致组合增加的干 扰素生物活性和组合增强的药代动力学和药效动力学性质。

不同于传统的干扰素-α-聚合物轭合物，本发明的新颖的协同性干扰素 -α-聚合物（协同作用-IFN-α-聚合物）轭合物是体内受控的、连续释放的和 混合的干扰素-α协同作用体系，其在体内提供由大和小的干扰素-α-聚合物 轭合物组合的最优的药理学性质。协同作用-IFN-α-聚合物轭合物整合了具 有较长T_1/2的大的干扰素-α-聚合物和具有较高生物活性的小的干扰素-α-聚 合物的优点，以血浆中达到增加的、恒定的和持续的抗病毒活性。在临床 上，协同作用-IFN-α-聚合物可导致实现更大的持续病毒学应答，伴随着随 后的与干扰素-α相关的疗法的剂量、给药频率或甚至疾病治疗期的降低。 因此，协同作用-IFN-α-聚合物轭合物可以提供优于传统的聚乙二醇化的干 扰素-α轭合物的显著的临床优势。

发明的详细说明

在美国专利申请第12/302,238号提及了前生物分子-PEG （Probiomolecule-PEG）轭合物的发明，其全部内容通过引用方式并入本文。 永久-可断裂-链接（在本文中也称为混合-永久-可断裂链接）支链或直链聚 合物或全部-可断裂-链接支链或直链聚合物包括同一件专利申请中描述的 那些链接。本发明的至少一方面是通过增强所公开的PK和PD性质而实现 的、由请求保护的连接基团提供的体内疗效的意外增加。生物分子的递送 领域中的一个缺点是，肽和蛋白质化合物具有很短的血浆半衰期。这样短 的血浆半衰期通常是由于快速肾清除率以及系统循环期间发生的酶促降 解。

意想不到地提供了在体内延长治疗性蛋白质的血浆半衰期并同时改善 治疗性蛋白质的有效性的策略。这种意料不到的观察是由于达到了所请求 保护的化合物和构造的PK和PD之间关键的平衡。

本发明的至少一个方面是，本文所公开的构造提供最优化的PK-PD谱 的能力。本发明公开了蛋白质-PEG链接的连续的和延迟的断裂以及由永久 的蛋白质-PEG链接所提供的延长的血浆半衰期特性改变蛋白质药物的体 内疗效，从而由结合亲和力的降低引起的效力减少能够由延长血浆循环时 间所引起的整体系统暴露的增加来补偿。因此，本发明公开了通过协调所 公开的轭合物的PK-PD谱而整体增强所关注的生物分子的治疗效益。这一 结果提供了以前从未以这样不可预测的方式实现的意想不到的治疗效益。

不同于本领域中描述的利用支链永久-链接的PEG连接基团（PEG2、 UPEG、Y形）或直链永久-链接的PEG连接基团（SC-PEG等）进行蛋白 质轭合的传统的聚乙二醇化方法，本发明提供了四种类型的协同性生物分 子-聚合物轭合物，其包含经由永久-可断裂-链接或全部-可断裂-链接与生物 活性分子连接的支链或直链聚合物连接基团。这些轭合物包括与以下聚合 物连接的生物分子：永久-可断裂-链接支链聚合物（Ia型）和全部-可断裂- 链接支链聚合物（Ib型）和永久-可断裂-链接直链聚合物（IIa型）和全部- 可断裂-链接直链聚合物（IIb）。

本发明提供了协同性生物分子-聚合物轭合物，其是与可断裂-链接聚合 物共价连接的生物分子（Ia型、Ib型、IIa型和IIb型）。协同性生物分子- 聚合物轭合物是长效的、连续释放的和混合的协同作用体系，其在体内增 强被递送的治疗剂的生物活性并改善被递送的治疗剂的药理学性质。

有机化学和前药科学领域的普通技术人员会理解，永久（或稳定）的 链接是共价的且在体内不可降解的共价键。换句话说，这些是在血浆中不 容易断裂的不可水解的链接。另一方面，可释放（或可断裂）的链接被视 为在血浆中可水解或可降解的链接。

本文中所用的永久-可断裂-链接或全部-可断裂-链接中的可断裂-链接 是指在体内被断裂的键链接。这种链接包括血浆可断裂的、可酶降解的、 pH-诱导的可水解的、pH-诱导的可自我断裂的、体内物质诱导的可断裂的、 生化反应诱导的可断裂的或化学可断裂的那些。

由可断裂-链接聚合物连接基团的连接而产生的新颖的协同性生物分 子-聚合物轭合物含有本发明的至少一种对应于上述的以下式I和II的可断 裂链接：

(P_n----L_n----R----C)_x---M或[(P----L)_n----R----C]_x---M

其中M是生物活性分子；其中x是数字且x≥1；其中n是数字且定义 为n≥2；其中P是聚合物或聚合物-脂质；其中Pn是多个聚合的臂或片段， 它们的类型和大小可以相同或不同；其中L是在聚合物和间隔基团之间的 功能性链接或是聚合物之间的链接，且其中L是包含至少一个可断裂链接 和至少一个永久链接的功能性链接部分；或Ln是全部可断裂的链接；其中 R是将聚合物和生物分子直接连接的不可断裂的化合物或间隔基部分；且 对于I型支链聚合物，R含有至少两个用于链接至P的功能性基团；其中C 是能够连接至生物分子的偶联基团。本发明中的至少另一个实施方式需要 上文的式I和II所含的链接部分具有至少一个永久的链接和至少一个可断 裂的链接。

用于协同性生物分子-聚合物轭合物的聚合物优选为水溶性的。这种聚 合物的一个非限制清单包括诸如聚乙二醇（PEG）或聚丙二醇的聚亚烷基 氧化物均聚物、聚(乙烯醇)、聚(氧乙基化甘油)、聚(氧乙基化山梨糖醇)、 聚(氧乙基化葡萄糖)、聚(噁唑啉)、聚(丙烯酰基吗啉)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、 聚氧乙烯化的多元醇、其共聚物、嵌段共聚物、三元共聚物及混合物。还 包括含烷基末端的聚亚烷基氧化物，如单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。

除了聚亚烷基氧化物聚合物之外，也可以使用聚乙烯亚胺、葡聚糖、 PEG-脂质、聚合物脂质、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、糖类聚合物和类似的聚 合物。

聚乙二醇（PEG）和单甲氧基聚乙二醇（mPEG）是特别优选的聚合物。 PEG的分子量为约50至约40,000。分子量为5,000至40,000的PEG对于 蛋白质轭合是特别有用的。

与聚合物连接的脂质基团包括但不限于脂肪族酰基、甘油脂、甘油磷 脂、鞘脂、醣脂（saccharolipids）和聚酮和固醇脂和戊烯醇脂、磷脂和神 经酰胺。尤其优选的聚合物-脂质是PEG-磷脂和PEG-神经酰胺。永久-可断 裂-链接聚合物-脂质或全部-可断裂-链接聚合物-脂质可用于形成具有生物 活性分子的脂质体或纳米颗粒。协同性生物分子-聚合物轭合物可以是脂质 体或纳米颗粒。

间隔基R包括，但不限于化学品、药物、肽、氨基酸、非蛋白氨基酸、 非蛋白氨基酸衍生物、氨基酸衍生物、DNA片段或RNA片段、或其混合 物。此外，I型支链聚合物的氨基酸选自由赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸或天门冬氨酸组成的组。此外，I 型支链聚合物的非蛋白氨基酸选自由高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸组成 的组。间隔基R可以是进一步与其它化学物质连接的氨基酸或非蛋白氨基 酸。

本文所用的可断裂链接是在体内可断裂的、血浆可断裂的、可酶降解 的、pH-依赖性可水解的、pH-诱导的可自我断裂的、生理可断裂的、体内 物质诱导的可断裂的、生化反应诱导的可断裂的或化学可断裂的。可断裂 链接包括但不限于羧酸酯、碳酸酯、磺酸酯、磷酸酯、酰基咪唑并、氨基 甲酸酯咪唑并和二硫化物基团。

在体内和/或血浆中断裂链接所涉及的酶包括水解酶、还原酶和氧化 酶。酶包括但不限于酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶（sulfatases）、蛋白酶、二硫 化物还原酶、酮还原酶、脱氢酶、过氧化物酶和胺氧化酶。酯酶、磷酸酶 和硫酸酯酶是特别优选的酶。羧酸酯和碳酸酯链接被酯酶断裂。因此，本 文的术语“可酶降解的”包括被所述酶全部降解或断裂的链接。永久链接 在血浆中不可断裂。永久链接包括但不限于酰胺、氨基甲酸酯、碳酰胺、 酰亚胺、胺、尿素、醚、氨基甲酸乙酯、硫化物、硫脲、硫代氨基甲酸酯、 硫代碳酰胺、二硫代氨基甲酸酯基团。

C偶联基团包含亲电或亲核基团。亲电基团包括但不仅限于N-羟基琥 珀酰亚胺（NHS）酯、对硝基苯基酯、琥珀酰亚氨基碳酸酯、对硝基苯基 碳酸酯、琥珀酰亚氨基氨基甲酸乙酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、 磺酰氯、醛、碳酸酯、酰亚氨基酯（imidioester）、酸酐、混合酸酐、马来 酰亚胺、卤代乙酰基、烷基卤化物衍生物、氮杂环丙烷、丙烯酰基衍生物 芳基化剂和硫代-二硫化物交换试剂。亲核官能团包括但不限于氨基、羟基、 酰肼、肼基甲酸酯、酰基酰肼、semicarbamate和肼。

当x是x≥1时，经由C偶联基团与生物活性分子连接的可断裂链接聚 合物的数目可以从一个至多个可断裂链接聚合物变化。本发明的协同性生 物分子-聚合物轭合物可以是含有不同数目的可断裂链接聚合物的生物分 子的混合物。混合物可以是含有不同x数目的轭合物的组合。例如，混合 物由一定百分比的生物分子-单聚合物（x=1）和生物分子-二聚合物（x=2） 组成。此外，可以通过诸如离子色谱法、凝胶过滤层析、亲和层析、反相 色谱法、超滤、渗滤、渗析、离心等的方法对协同性生物分子-聚合物轭合 物进行进一步纯化以获得期望数目的可断裂链接聚合物。

与永久-可断裂-链接聚合物或全部-可断裂-链接聚合物连接的M生物 活性分子（生物分子）包括但不限于蛋白质、糖蛋白、寡肽、多肽、酶、 细胞因子、激素、抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、单克隆抗体、 核酸、DNA、RNA、RNAi、siRNA、寡核苷酸、低聚糖、多糖、激素、神 经递质、碳水化合物、糖、二糖、脂质、磷脂、糖脂、固醇、氨基酸、核 苷酸、细胞穿膜肽、小分子药物等。

应用于协同性生物分子-PEG的永久-可断裂-链接和全部-可断裂-链接 的潜在的生物分子包括但不限于细胞因子、阿尔法促红细胞生成素（epoetin  alfa）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、依那西普、干扰素、干扰素α-2a、 干扰素α-2b、干扰素alfacon-1、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ-1b、 白细胞介素、TNF-α、胰岛素、尿激酶、链激酶、尿酸酶、超氧化物歧化 酶、天门冬酰胺酶、精氨酸脱氨酶、葡糖脑苷脂酶、半乳糖苷酶、瑞替普 酶（retelapse）、拉布立酶、艾杜糖醛酸酶（laronidase）、奥普瑞白介素、 链道酶α、胶原酶、阿尼普酶、阿加糖酶（agalsidase）、生长因子、血红蛋 白、凝血因子、凝血因子VII、VIIa、VIII和IX等。

如上文所述，本发明包括四种类型的与支链和直链可断裂-链接聚合物 连接的协同性生物分子-聚合物轭合物（Ia型、Ib型、IIa型和IIb型）。Ia 型协同性生物分子-聚合物轭合物包含永久-可断裂-链接支链聚合物。Ib型 协同性生物分子-聚合物轭合物包含全部-可断裂-链接支链聚合物。IIa型协 同性生物分子-聚合物轭合物包含永久-可断裂-链接直链聚合物。IIb型协同 性生物分子-聚合物轭合物包含全部-可断裂-链接直链聚合物。

例如，如果n=2，则与可断裂-链接支链聚合物连接的协同性轭合物（I 型）由式III表示：

式III

对于与永久-可断裂-链接支链聚合物连接的Ia型协同性轭合物，其中 L₁是永久链接；其中L₂是可断裂链接。

如果x=1，则Ia型协同性轭合物在体内和/或血浆中经由酶控制的降 解反应而逐步转化成P₁-L₁-R-C-M和P₂。这种独特的协同性生物分子-聚合 物在体内提供了组合的双重活性生物分子-聚合物轭合物，包括大尺寸协同 性生物分子-聚合物和通过酶促降解而形成的小片段生物分子-聚合物轭合 物。

对于与全部-可断裂-链接支链聚合物连接的Ib型协同性轭合物，L₁和 L₂均为可断裂的链接。

当x=1时，Ib型协同性轭合物在体内和/或血浆中经由酶控制的反应而 逐步转化为R-C-M、P₁和P₂。这种协同性生物分子-聚合物在体内提供了组 合的生物分子-聚合物轭合物，包括大尺寸的协同性生物分子-聚合物和小生 物分子-间隔基轭合物。

通常，大分子尺寸的生物分子-聚合物轭合物具有较长的血浆循环时 间，但生物活性下降。小分子尺寸的生物分子-聚合物轭合物具有较短的血 浆循环时间，但生物活性增加。

不同于传统的支链或直链聚合物轭合物，独特的Ia型（n=2）或Ib 型（n=2）协同性生物分子-聚合物轭合物整合了由大的和小片段的生物分 子-聚合物轭合物提供的双重生物活性，从而在体内提供组合增加的生物活 性。此外，由于由大尺寸协同性轭合物所释放的小尺寸生物分子-聚合物轭 合物的生物活性逐步增加，血浆中的生物活性会被保持。

大分子尺寸的协同性生物分子-聚合物轭合物提供较佳的PK性质，包 括药物吸收、分布、分布容量（Vd）和血浆半衰期。来自协同性生物分子- 聚合物的小分子尺寸的降解的生物分子-聚合物或生物分子-间隔基轭合物 具有较高的生物活性，以实现更好的药效动力学性质。因此，协同性生物 分子-聚合物在体内整合了大尺寸的生物分子-聚合物和小尺寸的生物分子- 聚合物轭合物的多（n>2）或双（n=2）轭合物性能的优势，以提供组合 增强的生物活性和协同改善的生物轭合物的药代动力学和药效动力学性 质。

对于n>2或x>2，协同性生物分子-聚合物轭合物在体内整合了大尺寸 的生物分子-聚合物和小尺寸的生物分子-聚合物轭合物的多轭合物效应的 优势，以提供组合增加的生物活性和组合增强的药代动力学和药效动力学 性质。根据本发明，由本发明的轭合物衍生的较小PEG聚合物与其未修饰 的形式相比具有较长的血浆半衰期且在其靶点更有效，因为它们在结合位 点处有较少的空间位阻。此外，由大尺寸的生物分子-PEG轭合物和较小尺 寸的生物分子-PEG轭合物的血浆浓度提供的协调的PK-PD关系增强了总 体的体内生物活性。这种灵活性明显优于不适于在血流中循环的现有技术 中的聚合物。

如果n=2，则与可断裂-链接直链聚合物连接的协同性轭合物（II型） 由式IV表示：

(P₂–L₂–P₁–L₁–R–C)_x-M

其中P₁和P₂可以是相同或不同的聚合物的类型和尺寸；其中L₁链接 可以是永久链接或可断裂链接；其中L₂链接是可断裂链接。P₁和P₂之间可 以植入可断裂的间隔基。可断裂的间隔基化合物包含如式I和II中所述的 可释放的链接L。

对于与永久-可断裂-链接支链聚合物连接的IIa型协同性轭合物，其中 L₁是永久链接，其中L₂是可断裂链接。

如果x=1，则IIa型协同性轭合物在体内经由酶控制的机理而逐步转 化成P₁-L₁-R-C-M和P₂。这种独特的协同性生物分子-聚合物在体内提供双 重活性的生物分子-聚合物轭合物，包括大尺寸的协同性生物分子-聚合物和 小片段的生物分子-聚合物轭合物。

对于与全部-可断裂-链接直链聚合物连接的IIb型协同性轭合物，L₁和 L₂均为可断裂的链接。

如果x=1，则IIb型协同性轭合物在体内经由酶控制的反应而逐步转 化成R-C-M+P₁+P₂。这种协同的生物分子-聚合物在体内提供组合的生物 分子-聚合物，包括大尺寸的协同性生物分子-聚合物和小的生物分子-间隔 基轭合物。

当x=1和n=2时，具有永久-可断裂-链接支链或直链聚合物的协同性 生物分子-聚合物轭合物（Ia型或IIa型）在体内和/或血浆中被降解成式I 和II中的P₂和P₁-L₁-R-C-M片断。协同性轭合物在体内是混合的生物活性 轭合物，包括大尺寸的协同性轭合物和释放的较小尺寸生物分子-聚合物轭 合物，从而提供了混合的协同作用活性和协同增强的PK和PD性质。

以同样的方式，当x=1和n=2时，具有全部-可断裂-链接支链或直链 聚合物的协同性生物分子-聚合物轭合物（Ib型或IIb型）在体内和/或血浆 中被降解成式I和式II中的P₂和P₁和R-C-M片段。协同性轭合物在体内 是混合的生物活性轭合物，包括大尺寸的协同性轭合物和释放的较小尺寸 的生物分子-间隔基轭合物，从而提供了混合的协同作用活性和协同增强的 药代动力学和药效动力学性质。

与传统的具有永久聚合物链接的支链聚合物轭合物相反，本发明独特 的协同性生物分子-聚合物轭合物（Ia型、Ib型、IIa型、IIb型）是长效的、 同步连续释放的和混合的协同作用体系，其在体内递送混合的活性生物分 子，以体内和/或血浆中酶控制的方式提供药物协同作用。Ia型和IIa型协 同性生物分子-聚合物轭合在血浆中经由酶反应而被转化成较小的生物分 子-聚合物片段。Ib型和IIb型协同性生物分子-聚合物轭合物在血浆中经由 酶反应而被转化成含有间隔分子的生物活性分子。新颖的协同性生物分子- 聚合物轭合物综合了从体内混合的生物分子-聚合物轭合物产生的多重效 应，并因此提供增强的组合生物活性和协同作用PK和PD性质。

在至少一个实施方式中，本发明的协同性生物分子-聚合物轭合物提供 可断裂的链接，以通过在体内释放大体积的聚合物而减少生物分子-聚合物 的尺寸，从而降低毒性。在潜在的预防性治疗方面，例如在用于血友病的 VII、VIIa、VIII和IX因子，用于多发性硬化症干扰素-β、用于高雪氏病的 葡糖脑苷脂酶以及其它遗传性疾病方面，协同性生物分子-聚合物轭合物提 供了相对于传统的蛋白质-聚合物的治疗优势。

在本发明的另一方面，协同性生物分子-聚合物轭合物可以通过多种途 径给药，如肠胃外、经鼻、经直肠、口服或外用。肠胃外给药是指皮下、 静脉、肌肉、腹膜内、皮内注射或任何其它合适的输注技术。

在本发明的更优选的实施方式中，与协同性生物分子-聚合物轭合物连 接的可断裂-链接聚合物具有以下独特的性质：

1.聚合物包含至少一个可断裂的和一个永久的链接或全部-可断裂的 链接。

2.所连接的聚合基团的大小相同或不同。

3.所连接的聚合基团的类型相同或不同。例如，含有PEG和PEI（聚 乙烯亚胺）部分的可断裂-链接聚合物可以被用于RNAi、siRNA或DNA的 递送。

对于协同性生物分子-聚合物轭合物的形成，本发明提供使用相同或不 同类型和大小的聚合物用于可断裂-链接聚合物的选项，从而在选择适当的 链接、聚合物类型和聚合物大小来优化蛋白质轭合物方面提供了显著的优 势。

对于聚乙二醇化，聚乙二醇是用于轭合的聚合物。具有支链双臂PEG 聚合物的永久-可断裂-链接的I型协同性生物分子-PEG轭合物描述为下式 V：

式V

其中，PEG(A)和PEG(B)聚合物可具有相同或不同的分子量。

对于Ia型协同性生物分子-PEG轭合物，α键是永久链接且β键是可断 裂链接。Ia型协同性生物分子-PEG在体内和/或血浆中经由酶反应而逐步 转化为更小的生物分子-间隔基-PEG(A)轭合物。

对于Ib型协同性生物分子-PEG，α键和β键在血浆中均是可断裂链接。 链接可以是不同类型的可释放的官能团。

不同于传统的具有对称臂的支链PEG连接基团，本发明提供了合成对 称的或不对称的可断裂-支链的PEG连接基团和可断裂-永久-支链的PEG 连接基团的方法。本发明的合成方法在选择各种链接和不同大小的PEG聚 合物来合成用于蛋白质轭合的期望的永久-可断裂-PEG聚合物和全部-可断 裂-PEG聚合物方面提供了显著的优势。此外，同样的方法可应用于合成期 望的聚合物、链接片段和聚合物大小的传统的支链聚合物。

包含混合-永久-可断裂链接的可断裂-支链PEG聚合物连接基团可表示 为PEG(A,α;B,β)，其中A和B表示PEG聚合物的大小且α和β表示链接 的类型。例如，Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯;20K mPEG,酯)琥珀酰亚氨 基辛二酸酯（化合物5）是含有分别与10KDa和20KDa的PEG聚合物连 接的氨基甲酸酯和酯链接的永久-可释放-链接支链30KDa聚合物。PEG化 合物10的天门冬氨酸(氨基甲酸酯;酯)和化合物11，谷氨酸(氨基甲酸酯; 酯)也是混合-永久-可断裂链接支链PEG聚合物。

II型协同性生物分子-PEG是与直链的但可断裂的PEG链接连接的生 物分子。与生物分子连接的PEG聚合物的数目可以从单一聚合物链到多个 聚合物链变化。与含有两段PEG聚合物的直链PEG链连接的II型协同性 生物分子-PEG的通式如下所示：

其中，PEG(A)和PEG(B)可以具有相同或不同的分子量。在生物分子和 PEG(A)之间植入间隔基或基座分子（base molecule）。

对于IIa型协同性生物分子-PEG，α键是永久链接且β键是可断裂链接。 可以在PEG(A)和PEG(B)之间植入可断裂的间隔基。可断裂的间隔基化合 物包含如式I和II中所述的可断裂链接L。IIa型协同性生物分子-PEG在血 浆中经由酶反应而逐步转化为较小的生物分子-间隔基-PEG(A)。

对于IIb型协同性生物分子-PEG，α键和β键都是可断裂链接。链接可 以是不同类型的可断裂链接。

PEG化合物上的混合功能性链接被以下符号标记：α、β、γ、δ等。

对于Ib型和IIb型协同性生物分子-PEG二者，生物分子-间隔基轭合 物的形成，α和β键在血浆中均可断裂。生物分子和PEG(A)之间的间隔基 可被设计用于特定的用途。它可以是药物、氨基酸、肽或用于渗透血脑屏 障的增强剂，或提高生物分子的功效的增强剂。

PEG(A)或PEG(B)的分子量为约50至约40,000。与生物轭合物连接的 PEG聚合物的分子量为约100至约200,000。在协同性生物分子-聚合物轭 合物（其中P是PEG）的优选实施方式中，PEG（或mPEG）的分子量为 5,000、10,000、12,000、20,000、30,000、40,000或其混合。

本发明的一个方面是，间隔基R是具有由式VI和VII表示的结构的与 永久-可断裂-链接双臂甲氧基聚乙二醇连接的赖氨酸：

式VI

或

式VII

其中a键表示永久链接，其选自由酰胺、氨基甲酸酯、碳酰胺、酰亚 胺、胺、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酰胺、氨基甲酸乙酯和二硫代氨基甲酸 酯组成的组；其中a键与α或ε-氨基连接；其中b键是可断裂链接，其选 自由羧酸酯、碳酸酯和羧基咪唑并组成的组；其中混合的链接a和b是其 混合物；其中mPEG(A)或mPEG(B)的分子量为约50至40,000；其中赖氨 酸混合链接二取代mPEG的分子量为约100至80,000。

对于蛋白质轭合物，赖氨酸-mPEG(A)-mPEG(B)聚合物的游离氨基进一 步与间隔基连接，该间隔基包含选自由N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基 酯、N-琥珀酰亚氨基碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、酰基咪唑并、醛、马来 酰亚胺、卤代乙酰基、羧酸、羟基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、羰基、巯基、 二硫化物、氨基、羟基、酰肼和肼组成的组的被活化的部分。

在另一实施方式中，a键是胺键且α-或ε-伯氨基能够与含有亲电体的 第二聚合物进行反应而形成叉状聚合物，即α或ε-胺与两个聚合物链连接。

化合物5和7都是30kDa的支链酯-氨基甲酸酯-混合-链接的PEG衍生 物，且它们之间的区别是10k PEG永久氨基甲酸酯链接位置。化合物5和 7的10k PEG氨基甲酸链接位置分别在赖氨酸-α和赖氨酸-ε上。

化合物6和8都是30kDa的支链酯-酰胺-混合-链接的PEG衍生物，且 它们之间的区别是10k PEG永久酰胺链接位置。化合物6和8的10k PEG 酰胺链接位置分别在赖氨酸-α和赖氨酸-ε上。

化合物9是30kDa的支链酯-氨基甲酸酯-混合-链接的PEG，其含有用 于蛋白质硫（硫代）部分轭合的马来酰亚氨基偶联基团。

化合物10和11是使用天门冬氨酸和谷氨酸作为基座化学品用于链接 PEG聚合物的支链酯-酰胺-混合-链接类型。

可以按照实施例中所述的方法合成、活化或插入用于蛋白质轭合的各 种亲电和亲核官能团（式中的C偶联基团）。

本发明提供用于生物分子轭合的永久-可断裂-链接聚合物衍生物和全 部-可断裂-链接聚合物衍生物和不对称支链臂聚合物的合成方法。合成方法 包括但不限于保护、脱保护、活化和插入方法以及用于合成永久-可断裂- 链接聚合物或全部-可断裂-链接聚合物的操作。

本发明还提供了完整工具箱，用于选择、优化和合成定制的永久的PEG 大小、定制的可释放的PEG大小、定制的永久链接、定制的可释放的链接、 定制的混合PEG和聚合物连接基团和定制的不同混合的聚合物。

本发明还提供了制备协同性生物分子-聚合物轭合物的方法。对于轭 合，可断裂-链接聚合物通常与具有活性位点的生物分子连接，该活性位点 选自由氨基、硫代、醛、羧基和N-末端组成的组。

在优选的实施方案中，所选的生物分子是干扰素。本文所用的术语“干 扰素”是指干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素γ-1b和干扰素-λ（干扰 素拉姆达）。干扰素-α包括干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-α-1、干扰素 alfacon-1和重组复合干扰素。干扰素属于一大类被已知作为细胞因子的糖 蛋白，且对大范围的感染性和增生性疾病具有治疗潜力。干扰素包括α-干 扰素（IFN-α），其是具有诸如抗病毒、免疫调节和抗肿瘤活性的生物效应 的蛋白质。重组IFN-α已被用作包括慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、毛细 胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、恶性黑色素瘤和慢性骨髓性白血病在内的许 多疾病的治疗剂。

本发明的至少一方面提供用于与干扰素偶联以产生协同性干扰素-PEG （协同作用-IFN-PEG）的永久-可断裂-链接支链PEG聚合物。本发明的新 颖的协同作用-IFN-PEG轭合物是独特的体内酶控制的、连续释放的和混合 的干扰素协同作用体系。此协同作用-IFN-PEG整合了较大分子IFN-PEG 轭合物和释放的较小分子IFN-PEG轭合物的优点从而提供组合增加的干扰 素抗病毒活性和增强的药代动力学和药效动力学性质。

对于干扰素-α，本发明的独特的协同性干扰素-α-PEG（协同作用-IFN-α- 聚合物）轭合物是先进的干扰素-α药物递送技术，其通过体内酶反应机理 而提供用于递送干扰素-α的受控的、同步的、连续释放的和混合的协同作 用体系。此协同作用IFN-α-聚合物提供了增强的干扰素-α生物活性和混合 的协同作用的药理学性质，以实现持续的吸收、增强的抗病毒活性、持续 的抗病毒活性、延长的循环半衰期、降低的免疫原性和毒性以及增强的药 效。此外，协同作用IFN-α-聚合物的持续的抗病毒活性和增强的PK和PD 性质会具有提高的药效，且在临床上可导致实现更大的持续的病毒学应答， 和随后减少对丙型肝炎患者的剂量、给药频率或疾病治疗期。

协同性干扰素-α-30kPEG(α-10k mPEG氨基甲酸酯,20k mPEG酯)轭 合物[协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)]（实施例6）包含可断裂的20k mPEG 酯链接和永久的10k mPEG氨基甲酸酯链接。轭合物的酯链接被体内的血 浆酶酯酶缓慢水解，产生较小的但活性更高的α-干扰素-ε-酰胺-赖氨酸-α- 氨基甲酸酯-10kmPEG轭合物。

本发明的这种独特的酶控制的、连续释放的协同作用 -IFN-α-30kPEG(α,β)轭合物从协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)轭合物和释放的 IFNα-10k PEG的片段的增强的组合活性提供在体内增加的抗病毒效果。在 皮下给药的情况下，具有较大分子大小的协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)轭合 物具有的优点是可以以较小的分布容积分布和早期在肝脏上递送，因此它 具有较长的血浆半衰期。然而，通过酶促水解而从协同作用 -IFN-α-30kPEG(α,β)缓慢产生的IFNα-10k PEG片段具有较高的抗病毒活 性。协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)的混合协同作用体系提供了协同效应，从 而实现增加的和持续的血清抗病毒活性。

与干扰素连接的永久-可断裂PEG聚合物的数目可以从一个单一的（x =1）到多个支链聚合物（x>1）变化。在本发明中包括协同作用 -IFN-α-30kPEG(α,β)在内的协同作用干扰素-PEG轭合物可以是含有一个单 一的可断裂-链接聚合物的干扰素或含有各种数目的可断裂-链接聚合物的 干扰素的混合物，优选x=1至2或x=1至3。

本发明的协同性干扰素-PEG轭合物，用于连接的永久-可断裂-链接或 全部-可断裂-链接支链PEG聚合物的PEG（或mPEG）的优选的分子量为 5,000、10,000、12,000、20,000、30,000、40,000Da或其混合。对于协同 性干扰素-PEG轭合物，所连接的PEG聚合物的优选大小是从约10,000至 约60,000Da。

协同性生物分子-聚合物轭合物方法对包括干扰素和白细胞介素在内 的细胞因子尤其有用。

Ia型和IIa型协同性生物分子-聚合物轭合物在体内可以逐步释放部分 聚合部分，以提供尺寸更小但活性更高的生物分子-聚合物轭合物片段。Ib 型和IIb型协同性生物分子-聚合物轭合物在体内可以逐步释放所有聚合部 分，以产生小得多但活性更高的生物分子-间隔基轭合物。因此，协同性生 物分子-聚合物轭合物（Ia型、IIa型、Ib型或IIb型）的量在体内逐步减少， 并经由体内酶控制的机理而提供更小尺寸的生物分子-聚合物轭合物或生 物分子-间隔基轭合物的同步的、连续的释放。混合的生物分子-聚合物轭合 物在体内整合轭合物的多重效果，并因此提供增强的组合生物活性和协同 性PK和PD性质。

实施例

以下的非限制性实施例说明了发明的某些方面。

实施例1Fmoc-Lys(BOC)-20K mPEG酯1

向在冰水浴中冷却的20kDa mPEG（1g，0.05mmol）和 Fmoc-Lys(BOC)-OH（117mg，0.25mmol）在无水二氯甲烷的溶液添加二 环己基碳二亚胺（166mg，0.8mmol），并将混合物在氮气下搅拌，并使其 升温至室温过夜。通过过滤而从反应混合物中除去N,N-二环己基脲。将滤 液真空干燥。将残留物溶解在无水二氯甲烷中，并通过加入叔丁基甲基醚 而沉淀出白色固体。收集白色固体产品1并用叔丁基甲基醚洗涤。

实施例2Fmoc-Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯3

向Fmoc-Lys(BOC)-20K mPEG酯1（0.8g，0.04mmol）在无水二氯甲 烷（4mL）的溶液添加4mL三氟乙酸。反应在室温下搅拌一小时，且通 过叔丁基甲基醚（70mL）沉淀出白色固体。收集固体产品Fmoc-Lys-20K mPEG酯2并用叔丁基甲基醚洗涤。

将Fmoc-Lys-20K mPEG酯2（0.35g，0.018mmol）、10K mPEG琥珀 酰亚氨基碳酸酯（SC-mPEG）（225mg，0.022mmol）和三乙胺（110mg， 1.08mmol）在无水二氯甲烷（9mL）的溶液在室温氮气保护下搅拌过夜。 通过在真空下部分除去溶剂而浓缩反应混合物。通过添加叔丁基甲基醚而 使产品Fmoc-Lys(α-10K mPE G，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯3沉淀，将其过 滤并收集。产品3可以通过层析而进一步纯化。

实施例330k Da Lys(α-10kPEG氨基甲酸酯,20kPEG酯)琥珀酰亚氨基 辛二酸酯5

将Fmoc-Lys(α-10K mPE G，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯3（0.5g，0.016 mmol）溶解在11mL的二氯甲烷/二乙胺（5:6）的混合物中，并将反应混 合物在室温下搅拌3.5小时。通过添加叔丁基甲基醚（70mL）而使固体产 品4沉淀，将其过滤并收集。

将Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯4（0.4g，0.013 mmol）、辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)（26mg，0.07mmol）和三乙胺（3 mg，0.03mmol）在无水二氯甲烷（7mL）和二甲基甲酰胺（3mL）的混 合物中的溶液在室温氮气保护下搅拌9小时。通过在真空下部分除去溶剂 而将反应混合物浓缩，并通过加入叔丁基甲基醚而使白色固体沉淀。收集 固体产品5并用叔丁基甲基醚洗涤。

实施例4Lys(α-10K mPEG,酰胺)-20K mPEG酯琥珀酰亚氨基辛二酸酯 6

在该实施例中，以实施例1、2和3中所述的方式合成酯-α-酰胺-混合- 链接支链PEG衍生物6，不同之处是用10k道尔顿mPEG-SCM（mPEG琥 珀酰亚氨基羧甲基）替换10k道尔顿SC-PEG。

mPEG-SCM：CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂-CO₂-N-羟基琥珀酰亚氨基酯。

实施例5Lys(ε-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20KmPEG酯α-琥珀酰亚氨基 辛二酸酯7

在该实施例中，以实施例1、2和3中所述的方式合成酯-ε-氨基甲酸酯 -混合-链接支链PEG衍生物7，不同之处是在t-Boc解封步骤之前进行Fmoc 解封步骤。

实施例6Lys(ε-10K mPEG,酰胺)-20K mPEG酯α-琥珀酰亚氨基辛二酸 酯8

在该实施例中，以实施例5中所述的方式合成酯-ε-酰胺-混合-链接支 链PEG衍生物8，不同之处是用10k道尔顿mPEG-SCM（mPEG琥珀酰亚 氨基羧甲基）替换10k道尔顿SC-PEG。

mPEG-SCM：CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂-CO₂-N-羟基琥珀酰亚氨基酯

实施例73-马来酰亚氨基丙酰基Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯9

将Lys(α-10K mPE G，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯4（0.3g，0.01mmol）、 3-马来酰亚氨基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（18.6mg，0.07mmol）和三乙 胺（7.1mg，0.07mmol）在无水二氯甲烷/二甲基甲酰胺（5:2）的7mL混 合溶剂中的溶液在室温氮气保护下搅拌过夜。通过在真空下部分除去溶剂 而将反应混合物浓缩，且通过加入叔丁基甲基醚（80mL）而沉淀出白色固 体。收集固体产品9并用叔丁基甲基醚洗涤。

30kDa3-马来酰亚氨基丙酰基Lys(α-10K mPEG，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯可用于与含有巯基（硫代）的生物分子偶联以产生协同性生物分 子-PEG轭合物。

实施例8协同性干扰素α-30kPEG(10k mPEG氨基甲酸酯,20k mPEG 酯)轭合物的制备

将5mL的2mM乙酸中的重组干扰素-α（2.8mg/mL）与2mL pH8 的350mM磷酸盐缓冲液混合。平衡后，向IFN-α溶液中分批添加82mg Lys(α-10kPEG氨基甲酸酯,20kPEG酯)琥珀酰亚氨基辛二酸酯5，其为活 化的30,000道尔顿混合-永久-可断裂链接支链PEG，并在室温下搅拌3小 时。将含有单、二和三PEG支链聚合物（组成为x=1至3）的干扰素-α 反应混合物用30k道尔顿分子量截止膜（Sartorius Stedium Vivaspin20）浓 缩，并通过分子排阻色谱或离子色谱进一步纯化以收集期望的协同性干扰 素α-2b-30kPEG轭合物。将收集的协同性干扰素α-单30kPEG轭合物用30k 道尔顿分子量截止膜（Sartorius Stedium Vivaspin20）浓缩并用分子排阻色 谱和SDS-PAGE电泳验证。

在37°C人的血浆中进行干扰素-α-2b-30kPEG(10k mPEG氨基甲酸酯, 20k mPEG酯)轭合物的降解和10k PEG-干扰素的释放实验。将含有永久氨 基甲酸酯链接和可释放酯链接的协同性干扰素α-30kPEG(10k mPEG氨基 甲酸酯,20K mPEG酯)轭合物在37°C人血浆中孵育不同的时间段，范围从 0.5小时至36小时。提取一份血浆样品，并用乙腈或乙腈/甲醇有机溶剂处 理、振荡（vortexed）、离心并浓缩。然后将溶液残余物用分子排阻色谱或 在带有银或碘色斑的Bis-Tris 4-12%SDS-PAGE上分析，以证实10k PEG- 干扰素-α-2b的释放。

实施例9生物学数据

在该实施例中，利用被EMCA病毒感染的New Wish细胞，在CPE检 定法中测定了IFNα-2b、IFN-12kPEG*和来自实施例8的协同性30kIFN α-2b-PEG(10k mPEG氨基甲酸酯,20k mPEG酯)轭合物的体外抗病毒活 性。该细胞病变效应检定法测量干扰素对病毒诱导的细胞裂解的抑制作用。 检定法的终点是干扰素的稀释对病毒感染的靶细胞提供50%的保护。相对 于干扰素的参考标准测定存在的干扰素的量。协同性30K IFNα-2b-PEG的 抗病毒活性约为干扰素α-2b的抗病毒活性的12%。结果列于表1。

表1

实施例10药代动力学参数

在该实施例中，在皮下注射入BALB/C小鼠后，产生了不同的药代动 力学数据。使用从接受相同量的干扰素的4只小鼠的血液中获得的平均值， 采用3天的时间点，测定了药代动力学参数。对于IFN-α-2b-12kPEG*和协 同作用-30kIFN α-2b-PEG，在注射后1、6、24、48和72小时提取血液样 本。对于IFN α-2b，在注射后1、3、6和24小时提取血液样本。随后评估 PK参数，其源自抗病毒活性对时间的图。比较的药代动力学参数列于表2。

病毒检定法：CPE检定法，使用EMCV病毒和基于New Wish细胞的检定法

AUC：曲线下面积

表2

*IFNα-2b-12kPEG是根据Advanced Drug Delivery Reviews54(2002)547-570中发表的 文献制备的。

在皮下注射的情况下，药代动力学数据表明，利用30k道尔顿分子量 混合-永久-可断裂链接支链PEG聚合物制备的协同作用-30kIFN-α-2b-PEG 在哺乳动物中远远优于与常规PEG连接基团连接的原生干扰素α-2b和IFN α-2b-12kPEG。协同作用-30kIFNα-2b-PEG的血清半衰期出乎意料地比未修 饰的干扰素α-2b和IFNα-2b-12kPEG分别长71和3.3倍。协同作用-30kIFN α-2b-PEG的混合协同效应导致血浆AUC与未修饰的干扰素α-2b相比出乎 意料地显著增加50倍以上。甚至更意想不到的是，协同作用-30kIFN α-2b-PEG甚至出乎意料地有比IFNα-2b-12kPEG大2.6倍的AUC。

本发明的协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)轭合物的药代动力学整合了大 的IFN-30kPEG和小的10k IFN-α-PEG轭合物的双重PK性质，并提供非常 平的血清抗病毒活性对时间的谱。PK数据表明在体内增加的、持续的和恒 定的干扰素活性水平，其会提供持续的抗病毒保护。持续的抗病毒活性、 更长的血清半衰期和更大的AUC还表明，协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)轭 合物更有效且在临床上可导致实现更大的持续病毒学应答。

显然，在哺乳动物中，协同性30kIFNα-2b-PEG(10k mPEG氨基甲酸 酯,20k mPEG酯)轭合物相对于未修饰的IFNα-2b和IFNα-2b-12kPEG具 有明显的优势。协同作用-IFN-α-30kPEG(α,β)轭合物出乎意料地提高了整体 药代动力和药效动力学性质，这可导致降低用于丙型肝炎的剂量、给药频 率或疾病治疗期。

BOC：叔丁氧基羰基

Fmoc：9-芴基甲氧基羰基

mPEG₂₀K：分子量为20K道尔顿的mPEG

mPEG₁₀K：分子量为10K道尔顿的mPEG

化合物1：Fmoc-Lys(Boc)-20KmPEG酯

化合物2：Fmoc-Lys-20KmPEG酯

化合物3：Fmoc-Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯

化合物4：Lys(α-10K mPEG，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯

化合物5：Lys(α-10K mPEG，氨基甲酸酯)-20K mPEG酯ε-琥珀酰亚氨 基辛二酸酯

化合物6：Lys(α-10K mPEG,酰胺)-20K mPEG酯ε-琥珀酰亚氨基辛二 酸酯

化合物7：Lys(ε-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯α-琥珀酰亚氨 基辛二酸酯

化合物8：Lys(ε-10K mPEG,酰胺)-20K mPEG酯α-琥珀酰亚氨基辛二 酸酯

化合物9：3-马来酰亚氨基丙酰基Lys(α-10K mPEG,氨基甲酸酯)-20K mPEG酯

化合物10：天门冬氨酸(PEGa,酯;PEGb,氨基甲酸酯),-C(O)X：活化 的酯，例如x=N-羟基琥珀酰亚胺

化合物11：谷氨酸(PEGA,酯;PEGb,氨基甲酸酯),-C(O)X：活化的酯， 例如x=N-羟基琥珀酰亚胺

应当强调的是，有上千种生物分子，包括蛋白质、大分子和小分子治 疗剂，可以通过与本发明的可断裂-链接-聚合物连接基团连接而被有效地改 性。本发明的协同性生物分子-聚合物轭合物是独特的酶控制的、持续释放 的和混合的生物分子协同作用体系，其可以导致相对于常规的聚乙二醇化 的生物分子轭合物的多种潜在的临床优势，例如增加的和持续的生物活性、 增强的PK和PD性质、延长的循环半衰期、降低的毒性和增强的效力。