一株链霉菌及其在生产具有抗菌作用的化合物中的应用

摘要

本发明公开了一株链霉菌及其在生产具有抗菌作用的化合物中的应用。本发明提供的菌株属于链霉菌（Streptomyces），命名为MS751，保藏号为CGMCC No.6299。本发明还保护链霉菌MS751在生产式（I）或式（II）所示化合物中的应用。式（I）中，R

说明书

技术领域

本发明涉及一株链霉菌及其在生产具有抗菌作用的化合物中的应用。 

背景技术

微生物是药物产生的重要来源，自从青霉素被发现以来，人类从微生物的次生代谢产物中获得了许多重要的天然产物，如红霉素、链霉素、利福霉素等等，为人类的健康事业做出了很大的贡献。 

目前市场上的药物中，超过120种重要药物来自于微生物，包括青霉素、环孢菌素A、阿霉素等，尤其是在抗感染和抗肿瘤药物中,微生物药物的比重超过50%。 

海洋是一个高盐、寡营养，甚至低温、高压、无光照的环境，这种生态环境的特殊性使得海洋微生物产生的次生代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地微生物相比有着巨大的差异，赋予了海洋微生物独特的代谢途径，导致一些新颖的专属于海洋的菌种以及化学结构奇特、新颖、生物活性多样性显著的海洋药物先导化合物的产生，为新药研究与开发提供了大量的菌种资源、模式结构和药物前体。因此，为了开辟新的药源，世界各国都在向“深蓝进军”，转向从海洋微生物中探索新的药物资源。 

发明内容

本发明的目的是提供一株链霉菌及其在生产具有抗菌作用的化合物中的应用。 

本发明提供的菌株属于链霉菌（Streptomyces），命名为MS751，已于2012年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6299。链霉菌（Streptomyces sp.）MS751CGMCC No.6299简称链霉菌MS751。 

本发明还保护链霉菌MS751在生产式（I）或式（II）所示化合物中的应用； 

式（I）中，R₁为-CH₃、-CH=CH₂、-C₂H₅、-CH₂OH、-C₂H₄OH、-CH(OH)CH₃或-CH₂COCH₃。 

本发明还保护一种制备化合物的方法，包括如下步骤：发酵链霉菌MS751，得到所述化合物。 

所述发酵的条件可为25-30℃（如28℃）振荡培养（可为140-220rpm振荡培养，具体可为200rpm振荡培养）7-14天（具体可为10天）。所述发酵采用的培养基的制备方法具体如下： 取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K₂HPO₄、0.5克MgSO₄·7H₂O和2克碳酸钙溶于水，调pH至7.0-7.5，用水定容至1L。 

所述链霉菌具体以种子液的形式接种至所述发酵培养基。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比可为（2-5）：100，具体可为5:100。所述种子液具体可为OD_600nm=1.2-1.4的种子液。所述种子液的制备方法具体如下：将所述链霉菌的斜面菌种挖块接种至种子培养基，25-30℃（如28℃）振荡培养（可为140-220rpm振荡培养，具体可为200rpm振荡培养）5-7天（具体可为5天）。所述种子培养基的制备方法具体如下：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L。 

当式（I）中，R₁为-CH₃时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集上清； 

（2）取步骤（1）得到的上清，用有机溶剂（如乙酸乙酯）进行萃取，收集有机相，减压蒸馏除去有机溶剂后得到粗品II； 

（3）将所述粗品II用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱；流动相为乙腈或乙腈和水的混合物；洗脱时间为10min，流速为3.5毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至100%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为8.09min的峰的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物A）。 

当式（I）中，R₁为-CH=CH₂时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集上清； 

（2）取步骤（1）得到的上清，用有机溶剂（如乙酸乙酯）进行萃取，收集有机相，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品II； 

（3）将所述粗品II用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱；流动相为乙腈或乙腈和水的混合物；洗脱时间为10min，流速为3.5毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至100%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为8.64min的峰的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物B）。 

式（I）中，R₁为-C₂H₅时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集上清； 

（2）取步骤（1）得到的上清，用有机溶剂（如乙酸乙酯）进行萃取，收集有机相，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品II； 

（3）将所述粗品II用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱；流动相为乙腈或乙腈和水的混合物；洗脱时间为10min，流速为3.5毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至100%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为9.08min的峰的洗脱液，减压蒸干得到所述化合物（化合物C）。 

式（I）中，R₁为-C₂H₄OH时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、 8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集沉淀； 

（2）取步骤（1）得到的沉淀，用有机溶剂（如丙酮）进行浸提（具体可室温浸提12小时-36小时；室温浸提36小时时，每12小时更换新的有机溶剂，最后将所有的浸提液合并），收集浸提液，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I； 

（3）将所述粗品I用甲醇溶解后使用YMC*Gel ODS-A C18树脂进行减压柱层析； 

减压柱层析的过程依次如下： 

①将5体积份甲醇和95体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

②然后将10体积份甲醇和90体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

③然后将20体积份甲醇和80体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

④然后将30体积份甲醇和70体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑤然后将40体积份甲醇和60体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂，得到馏分I-5； 

每种流动相洗脱50毫升； 

（4）将所述馏分I-5用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为18.5min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从20%线性上升至63%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为11.23min的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物E）。 

式（I）中，R₁为-CH(OH)CH₃时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集沉淀； 

（2）取步骤（1）得到的沉淀，用有机溶剂（如丙酮）进行浸提（具体可室温浸提12小时-36小时；室温浸提36小时时，每12小时更换新的有机溶剂，最后将所有的浸提液合并），收集浸提液，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I； 

（3）将所述粗品I用甲醇溶解后使用YMC*Gel ODS-A C18树脂进行减压柱层析； 

减压柱层析的过程依次如下： 

①将5体积份甲醇和95体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

②然后将10体积份甲醇和90体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

③然后将20体积份甲醇和80体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

④然后将30体积份甲醇和70体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑤然后将40体积份甲醇和60体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂，得到馏分I-5； 

每种流动相洗脱50毫升； 

（4）将所述馏分I-5用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为18.5min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从20%线性上升至63%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为12.46min的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物F）。 

式（I）中，R₁为-CH₂COCH₃时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、 8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集沉淀； 

（2）取步骤（1）得到的沉淀，用有机溶剂（如丙酮）进行浸提（具体可室温浸提12小时-36小时；室温浸提36小时时，每12小时更换新的有机溶剂，最后将所有的浸提液合并），收集浸提液，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I； 

（3）将所述粗品I用甲醇溶解后使用YMC*Gel ODS-A C18树脂进行减压柱层析； 

减压柱层析的过程依次如下： 

①将5体积份甲醇和95体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

②然后将10体积份甲醇和90体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

③然后将20体积份甲醇和80体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

④然后将30体积份甲醇和70体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑤然后将40体积份甲醇和60体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂，得到馏分I-5； 

每种流动相洗脱50毫升； 

（4）将所述馏分I-5用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为18.5min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从20%线性上升至63%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为14.16min的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物G）。 

式（II）所示化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集沉淀； 

（2）取步骤（1）得到的沉淀，用有机溶剂（如丙酮）进行浸提（具体可室温浸提12小时-36小时；室温浸提36小时时，每12小时更换新的有机溶剂，最后将所有的浸提液合并），收集浸提液，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I； 

（3）将所述粗品I用甲醇溶解后使用YMC*Gel ODS-A C18树脂进行减压柱层析； 

减压柱层析的过程依次如下： 

①将5体积份甲醇和95体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

②然后将10体积份甲醇和90体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

③然后将20体积份甲和80体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

④然后将30体积份甲醇和70体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑤然后将40体积份甲醇和60体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑥然后将50体积份甲醇和50体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑦然后将60体积份甲醇和40体积份水的混合液作为流动相洗脱； 

⑧然后将70体积份甲醇和30体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-1；然后将80体积份甲醇和20体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-2；然后将90体积份甲醇和10体积份水的混合液作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-3；然后将甲醇作为流动相洗脱，收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-4；合并所述馏分I-7-1、所述馏分I-7-2、所述馏分I-7-3和所述馏分I-7-4，得到馏分I-7； 

（4）将所述馏分I-7用甲醇溶解后进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为24min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至86%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为16.3min的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物J）。 

式（I）中，R₁为-CH₂OH时，所述化合物的制备方法依次包括如下步骤： 

（1）取所述发酵得到的链霉菌MS751的发酵物，离心（离心条件可为：4-25℃、8000-12000rpm、10-15分钟；离心条件具体可为：20℃、10000rpm、10分钟）收集沉淀； 

（2）取步骤（1）得到的沉淀，用有机溶剂（如丙酮）进行浸提（具体可室温浸提12小时-36小时；室温浸提36小时时，每12小时更换新的有机溶剂，最后将所有的浸提液合并），收集浸提液，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I； 

（3）将所述粗品I用水溶解后使用大孔吸附树脂HP20进行常压柱层析； 

常压柱层析的条件：流动相为丙酮或丙酮和水的混合物；洗脱时间为100分钟，流速为10毫升/分钟；洗脱过程中，丙酮在流动相中的体积比从0%线性上升至50%。收集丙酮在流动相中的体积比为30%-40%过程中的洗脱液，减压蒸干后溶于含体积比为10%二甲基亚砜的甲醇中并进行反向高效液相色谱； 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为28min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从10%线性上升至52%；检测波长为254纳米；收集峰值的保留时间为15.09min的洗脱液，减压蒸干后得到所述化合物（化合物D）。 

化合物（特别是化合物A、化合物B、化合物C和化合物J）具有很好的抗细菌和抗真菌的活性。链霉菌MS751具有很好的工业化潜力与应用前景。本发明对于人类的健康事业具有重大意义。 

附图说明

图1为菌株MS751在斜面培养基上28℃生长15天时的菌落照片。图2为菌株MS75110000×放大后观察的形态照片。图3为系统发育树。图4为实施例3中检测化合物抗细菌的活性时，37℃培养16小时后孔的照片。图5为步骤三制备得到的各个化合物的紫外光谱图。图6为化合物A的质谱图。图7为化合物B的质谱图。图8为化合物C的质谱图。图9为化合物D的质谱图。图10为化合物E的质谱图。图11为化合物F的质谱图。图12为化合物G的质谱图。图13为化合物J的质谱图。图14为化合物A溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图15为化合物B溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图16为化合物C溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图17为化合物D溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图18为化合物E溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图19为化合物F溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图20为化合物G溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图21为化合物J溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图。图22为化合物A溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图23为化合物B溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图24为化合物C溶于DMSO-d6中的 ¹³C-NMR谱图。图25为化合物D溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图26为化合物E溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图27为化合物F溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图28为化合物G溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。图29为化合物J溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规 生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：ATCC编号为6538；Strain Designations:FDA209。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：ATCC编号为6633；Strain Designations:NRS231。铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）：ATCC编号为15692；Strain Designations:1C[ATCC17503,ATCC25247,ATCC25375,CIP104116,PRS101,Stanier131]。肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）：ATCC编号为BAA-255；Strain Designations:R6。白色念珠菌（Candida albicans）：ATCC编号为MYA-2876；Designation：SC5314。大肠杆菌：（Escherichia coli）：ATCC编号为33312；Strain Designations:BR513。 

牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）：法国巴斯德研究所，保藏编号1173P2；Strain Designations:BCG。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）：ATCC编号为700084；Strain Designations:mc(2)155。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）：ATCC编号为27294；Strain Designations:TMC102[H37Rv]。 

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）：参考文献Shang JL,Guo H,Li ZS,Ren B,Li ZM,Dai HQ,Zhang LX,Wang JG.2013.Synthesis and evaluation of novel sulfenamides as novel anti Methicillin-resistant Staphylococcus aureus agents.Bioorg Med Chem Lett 23(3):724-727。 

实施例1、菌株MS751的分离与鉴定 

一、菌株MS751的分离 

取1g海泥样品（采集自中国南海海底沉积物），放入装有9ml无菌水的50ml离心管中，以20KHz、100W功率超声2min，200rpm振摇2小时；取1ml悬浊液，放入装有9ml无菌水的50ml离心管中，充分震荡混匀；取1ml悬浊液，放入装有9ml无菌水的50ml离心管中，充分震荡混匀；取1ml悬浊液，放入装有9ml无菌水的50ml离心管中，充分震荡混匀，置于60℃下1小时，取0.2ml涂布于菌株分离培养基上，获得一株菌，将其命名为菌株MS751。 

菌株分离培养基的成分如下（%均为质量百分比）：可溶性淀粉2%、L-天冬素0.05%、KNO₃0.1%、K₂HPO₄·H₂O0.05%、NaCl0.05%、MgSO₄·7H₂O0.05%、CaCO₃0.1%、Agar2%和水，pH7.2-7.5。 

二、菌株MS751的鉴定 

菌株MS751在斜面培养基上28℃生长15天时的菌落照片见图1，气生菌丝呈灰白色，基内菌丝呈棕色，有少量棕色色素产生。菌株MS751在扫描电子显微镜Quanta200中10000×放大后观察到的形态照片见图2。 

菌株MS751的16S rRNA的编码序列如序列表的序列1所示，将序列信息提交EZtaxon数据库（EzTaxon Server version2.1）进行序列比对。菌株MS751与模式菌株Streptomyces qinglanensis172205(T)的16S rRNA的编码序列的相似性为98.8%。利用CLSSTAL W序列分析软件对将获得的16S rRNA序列进行多序列比对，利用MEGA4.0软件中的邻接法生成系统发育树，见图3（步缺值设定为1000）。 

根据菌落形态及序列比对的结果，菌株MS751属于链霉菌（Streptomyces sp.）。菌株MS751已于2012年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6299。链霉菌（Streptomyces sp.）MS751CGMCC No.6299简称链霉菌MS751。 

实施例2、应用链霉菌MS751生产制备化合物 

一、种子液的制备 

1、将链霉菌MS751划线接种于斜面培养基上，28℃培养5天（使气生菌丝生长丰满），得到斜面菌种。 

斜面培养基的制备方法：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物、4克葡萄糖和20克琼脂粉溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。 

2、将种子培养基分装于500ml三角烧瓶中（100ml/瓶），将斜面菌种挖块接种至种子培养基，28℃、200rpm振荡培养5天，得到OD_600nm=1.2-1.4的种子液。 

种子培养基的制备方法：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。 

二、发酵 

将5ml步骤一制备得到的种子液加入100ml发酵培养基中，28℃、200rpm振荡培养10天。 

发酵培养基的制备方法：取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K₂HPO₄、0.5克MgSO₄·7H₂O和2克碳酸钙溶于水，调pH至7.0-7.5，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。 

三、分离纯化化合物 

1、取步骤二得到的发酵体系，20℃、10000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀。 

2、取步骤1得到的沉淀，用丙酮室温静置浸提12小时，20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清；将剩余的沉淀再次用丙酮室温浸提12小时，20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清；将剩余的沉淀再次用丙酮室温浸提12小时，20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清；合并三次浸提得到的上清，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品I。 

3、取步骤1得到的上清，用乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相再次用乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相再次用乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；合并三次萃取得到的乙酸乙酯相，减压蒸馏除去有机溶剂，得到粗品II。 

4、将粗品II用甲醇重新溶解，过滤去除不溶物后进行反向高效液相色谱。 

反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱（9.4×250mm）；流动相为乙腈或乙腈和水的混合物；洗脱时间为10min，流速为3.5毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至100%；检测波长为254纳米。 

收集峰值的保留时间为8.09min的峰的洗脱液，减压蒸干后得到化合物A。收集峰值的保留时间为8.64min的峰的洗脱液，减压蒸干后得到化合物B。收集峰值的保留时间为9.08min的峰的洗脱液，减压蒸干得到化合物C。 

5、将粗品I用甲醇重新溶解，过滤去除不溶物后使用5ml YMC*Gel ODS-A C18树脂进行减压柱层析。 

减压柱层析的过程依次如下（每种流动相洗脱50毫升，流速为5毫升/分钟）： 

（1）以甲醇:水=5:95（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-1。 

（2）然后以甲醇:水=10:90（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-2。 

（3）然后以甲醇:水=20:80（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-3。 

（4）然后以甲醇:水=30:70（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-4。 

（5）然后以甲醇:水=40:60（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-5。 

（6）然后以甲醇:水=50:50（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-6-1，然后以甲醇:水=60:40（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-6-2；合并馏分I-6-1和馏分I-6-2，得到馏分I-6。 

（7）然后以甲醇:水=70:30（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-1，然后以甲醇:水=80:20（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-2，然后以甲醇:水=90:10（体积比）为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-3，然后以甲醇为流动相洗脱后收集洗脱液并减压蒸馏除去有机溶剂得到馏分I-7-4；合并馏分I-7-1、馏分I-7-2、馏分I-7-3和馏分I-7-4，得到馏分I-7。 

将馏分I-5用甲醇重新溶解，过滤去除不溶物后进行反向高效液相色谱。反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱（9.4×250mm）；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为18.5min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从20%线性上升至63%；检测波长为254纳米。收集峰值的保留时间为11.23min的洗脱液，减压蒸干后得到化合物E。收集峰值的保留时间为12.46min的洗脱液，减压蒸干后得到化合物F。收集峰值的保留时间为14.16min的洗脱液，减压蒸干后得到化合物G。 

将馏分I-7用甲醇重新溶解，过滤去除不溶物后进行反向高效液相色谱。反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱（9.4×250mm）；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为24min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从30%线性上升至86%；检测波长为254纳米。收集峰值的保留时间为16.3min的洗脱液，减压蒸干后得到化合物J。 

6、将粗品I用水重新溶解后使用大孔吸附树脂HP20进行常压柱层析。常压柱层析的条件：柱长为20厘米，柱子内径为2.5厘米；流动相为丙酮或丙酮和水的混合物；洗脱时间为100分钟，流速为10毫升/分钟；洗脱过程中，丙酮在流动相中的体积比从0%线性上升至50%。收集丙酮在流动相中的体积比为30%-40%过程中的洗脱液，减压蒸干后溶于含10%（体积比）二甲基亚砜的甲醇中并进行反向高效液相色谱。反向高效液相色谱的条件：采用Agilent Eclipse XDB C-8反相色谱柱（9.4×250mm）；流动相为乙腈和水的混合物；洗脱时间为28min，流速为3毫升/分钟；洗脱过程中，乙腈在流动相中的体积百分比从10%线性上升至52%；检测波长为254纳米。收集峰值的保留时间为15.09min的洗脱液，减压蒸干后得到化合物D。 

每升步骤二得到的发酵体系中得到317.8毫克化合物A。每升步骤二得到的发酵体系中得到498.9毫克化合物B。每升步骤二得到的发酵体系中得到23.5毫克化合物C。每升步骤二得到的发酵体系中得到12.1毫克化合物D。每升步骤二得到的发酵体系中得到14.3毫克化合物E。每升步骤二得到的发酵体系中得到24毫克化合物F。每升步骤二得到的发酵体系中得到25.4毫克化合物G。每升步骤二得到的发酵体系中得到1毫克化合物J。 

四、化合物的表征 

1、外观 

步骤三制备得到的各个化合物均为无定形金黄色粉末状固体。 

2、溶解性 

步骤三制备得到的各个化合物均可溶于甲醇、丙酮和氯仿，微溶于水。 

3、紫外光谱 

步骤三制备得到的各个化合物的紫外光谱图见图5。化合物A的紫外光谱见图5A。化合物B的紫外光谱见图5B。化合物C的紫外光谱见图5C。化合物D的紫外光谱见图5D。化合物E的紫外光谱见图5E。化合物F的紫外光谱见图5F。化合物G的紫外光谱见图5G。化合物J的紫外光谱见图5H。 

4、质谱 

质谱测试采用高分辨电喷雾电离质谱HRESIMS，甲醇为质谱检测时化合物溶剂。 

化合物A的质谱图见图6，显示其[M+H]⁺峰为497.1802m/z。化合物B的质谱图见图7，显示其[M+H]⁺峰为509.1799m/z。化合物C的质谱图见图8，显示其[M+H]⁺峰为511.1966m/z。化合物D的质谱图见图9，显示其[M+H]⁺峰为513.1816m/z。化合物E的质谱图见图10，显示其[M+H]⁺峰为527.1920m/z。化合物F的质谱图见图11，显示其[M+H]⁺峰为527.1919m/z。化合物G的质谱图见图12，显示其[M+H]⁺峰为539.1913m/z。化合物J的质谱图见图13，显示其[M+H]⁺峰为1017.3531m/z。 

5、核磁共振谱 

化合物A溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图14。化合物B溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图15。化合物C溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图16。化合物D溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图17。化合物E溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图18。化合物F溶于DMSO-d6中的 ¹H-NMR谱图见图19。化合物G溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图20。化合物J溶于DMSO-d6中的¹H-NMR谱图见图21。 

化合物A溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图22。化合物B溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图23。化合物C溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图24。化合物D溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图25。化合物E溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图26。化合物F溶于DMSO-d6中的 ¹³C-NMR谱图见图27。化合物G溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图28。化合物J溶于DMSO-d6中的¹³C-NMR谱图见图29。 

对各个化合物的核磁共振谱进行研究并对¹³C信号进行归属。化合物A的归属情况见表1。化合物B的归属情况见表2。化合物C的归属情况见表3。化合物D的归属情况见表4。化合物E的归属情况见表5。化合物F的归属情况见表6。化合物G的归属情况见表7。化合物J的归属情况见表8。 

表1化合物A的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 111.8,CH 6.95,d(8.5) 1,4,12a 3 129.2,CH 7.83,d(8.5) 1,4a,1' 4 127.9,C     4a 125.2,C     4b 142.0,C     6 159.9,C     6a 121.5,C     7 121.1,CH 7.73,s 6,9,10a,1''

 

8 140.3,C     9 118.9,CH 7.41,s 8,1'',10,10a 10 156.9,C     10a 120.9,C     10b 113.3,C     11 101.5,CH 8.40,s 4b,10a,10b,12,12a 12 151.7,C     12a 115.0,C     1' 74.6,CH 6.02,d(9.5) 3,4,4a,2',5' 2' 72.5,CH 3.70,dd(9.5,8.5) 4,1',3'-CH3 3' 73.2,C     4' 75.8,CH 3.15,d(8.0) 3',4',5',3'-CH3 5' 70.7,CH 4.53,q(6.5) 1',4',6' 6' 17.1,CH3 1.01,d(6.5) 4',5' 1'' 21.1,CH3 2.47,s 7,8,9 2''a       2''b       3'-CH3 23.9,CH3 1.26,s 2',3',4' 10-OCH3 56.5,CH3 4.06,s 9,10 12-OCH3 56.2,CH3 4.08,s 11,12 1-OH   9.81,s 1,2,3,12a, 2'-OH   4.20,d(8.5) 1',2',3' 3'-OH   4.23,s 2',3',4' 4'-OH   461d(80) 3'4'5'

表2化合物B的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 112.1,CH 6.97,d(8.5) 1,4,12a 3 129.3,CH 7.84,d(8.5) 1,4a,1' 4 128.1,C     4a 125.2,C     4b 142.4,C     6 159.8,C     6a 122.0,C     7 119.1,CH 7.97,d(1.5) 6,9,10a,1'' 8 138.7,C     9 114.6,CH 7.69,d(1.5) 7,10,10a,1'' 10 157.4,C     10a 122.9,C     10b 113.2,C     11 101.4,CH 8.43,s 4b,10a,12,12a 12 151.8,C     12a 115.2,C     1' 74.6,CH 6.03,d(9.5) 4,4a,2' 2' 72.6,CH 3.69,dd(9.5,8.5) 4,1' 3' 73.2,C     4' 75.8,CH 3.16,d(7.5) 2',3',3'-CH3,6' 5' 70.7,CH 4.53,q(6.5) 4',6' 6' 17.1,CH3 1.03d(6.5) 4',5' 1'' 135.2,CH 6.91,dd(17.5,11.0) 7,8,9 2''a 117.2,CH2 6.13,d(17.5) 8,1'' 2''b   5.49,d(11.0) 8 3'-CH3 23.9,CH3 1.26,s 3',4' 10-OCH3 56.7,CH3 4.14,s 10 12-OCH3 56.2,CH3 4.09,s 12 1-OH   9.80,s 1,2,12a,

 

2'-OH   4.19,d(8.5) 1',2',3' 3'-OH   4.20,s 3',4' 4'-OH   4.59,d(7.5) 3',4',5'

表3化合物C的归属情况 

position δC,mult. δH(J in Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 111.9,CH 6.96,d(8.4) 1,4,12a 3 129.3,CH 7.83,d(8.4) 1,4a,1' 4 128.0,C     4a 125.2,C     4b 142.1,C     6 159.94,C     6a 121.8,C     7 119.9,CH 7.82,s 6,9,10a,1'' 8 146.5,C     9 118.1,CH 7.55,s 7,10,10a,1'' 10 157.1,C     10a 121.3,C     10b 113.4,C     11 101.6,CH 8.50,s 4b,10a,12,12a 12 151.8,C     12a 115.0,C     1' 74.6,CH 6.03,d(9.6) 3,4,2',5' 2' 72.6,CH 3.68,dd(9.6,8.4) 4,1' 3' 73.1,C     4' 75.8,CH 3.14,d(7.8) 2',3',5',6' 5' 70.7,CH 4.51,q(6.6) 1',4',6' 6' 17.1,CH3 1.01,d(6.6) 4',5' 1'' 28.1,CH2 2.82,q(7.2) 7,8,9,2'' 2'' 15.1,CH3 1.30,t(7.2) 8,1'' 3'-CH3 23.9,CH3 1.25,s 2',3',4' 10-OCH3 56.7,CH3 4.14,s 10 12-OCH3 56.4,CH3 4.13,s 12 1-OH   9.82,s 1,2,12a, 2'-OH   4.17,d(8.4) 1',2' 3'-OH   4.19,s 2',4' 4'-OH   4.57,d(7.8) 3',4',5' 1''-OH      

表4化合物D的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 112.0,CH 6.97,d(8.4) 1,4,12a 3 129.3,CH 7.84,d(8.4) 1,4a,1' 4 128.0,C     4a 125.2,C     4b 142.3,C     6 160.0,C     6a 121.7,C     7 118.4,CH 7.96,s 6,9,10a,1'' 8 145.4,C     9 115.8,CH 7.60,s 7,10,10a,1'' 10 157.1,C    

 

10a 121.9,C     10b 113.4,C     11 101.7,CH 8.52,s 4b,10a,12,12a 12 151.9,C     12a 115.1,C     1' 74.6,CH 6.03,d(9.6) 3,4,4a,2',5' 2' 72.5,CH 3.69,dd(9.6,8.4) 4,1',3'-CH3 3' 73.1,C     4' 75.8,CH 3.15,d(7.8) 2',3',5',3'-CH3 5' 70.7,CH 4.52,q(6.6)   6' 17.1,CH3 1.01,d(6.6) 4',5' 1'' 62.2,CH2 4.70,d(5.4) 7,8,9 2''       3'-CH3 23.9,CH3 1.26,s 2',3',4' 10-OCH3 56.6,CH3 4.13,s 10 12-OCH3 56.4,CH3 4.13,s 12 1-OH   9.83,s 1,2,12a, 2'-OH   4.17,d(8.4) 1',2' 3'-OH   4.20,s 2',3',4' 4'-OH   4.57,d(7.8) 3',4',5' 1''-OH   5.54,t(5.4)  

表5化合物E的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 111.9,CH 6.96,d(8.4) 1,4,12a 3 129.3,CH 7.83,d(8.4) 1,4a,1' 4 128.0,C     4a 125.2,C     4b 142.2,C     6 160.0,C     6a 121.5,C     7 121.4 7.84,s 6,9,10a,1'' 8 142.7,C     9 119.1 7.56,s 7,10,10a,1'' 10 156.9,C     10a 121.4,C     10b 113.4,C     11 101.7,CH 8.50,s 4b,10a,12,12a 12 151.8,C     12a 115.1,C     1' 74.6,CH 6.03,d(9.6) 3,4,2',5' 2' 72.6,CH 3.67,dd(9.6,8.4) 4,1' 3' 73.1,C     4' 75.8,CH 3.14,d(7.8) 3',3'-CH3 5' 70.7,CH 4.51,q(6.6)   6' 17.1,CH3 1.01,d(6.6) 4',5' 1'' 38.7,CH2 2.93,t(6.6) 7,8,9 2'' 61.5,CH2 3.75,td(6.6,5.4) 8 3'-CH3 23.9,CH3 1.25,s 2',3',4' 10-OCH3 56.7,CH3 4.13,s 10 12-OCH3 56.4,CH3 4.13,s 12 1-OH   9.82,s 1,2,12a, 2'-OH   4.17,d(8.4) 1',2' 3'-OH   4.19,s 2',3',4' 4'-OH   4.57,d(7.8) 3',4',5' 1''-OH      

 

2''-OH   4.74,t(5.4)  

表6化合物F的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.3,C     2 112.1,CH 6.96,d(8.4) 1,4,12a 3 129.4,CH 7.83,d(8.4) 1,4a,1' 4 128.1,C     4a 125.3,C     4b 142.4,C     6 160.2,C     6a 121.7,C     7 117.7,CH 7.95,d(1.8) 6,9,10a,1'' 8 150.1,C     9 115.4,CH 7.61,d,(1.8) 7,10,10a,1'' 10 157.2,C     10a 122.0,C     10b 113.5,C     11 101.8,CH 8.49,s 4b,10a,10b,12,12a 12 152.0,C     12a 115.2,C     1' 74.7,CH 6.02,d(9.6) 3,4,4a,2',5' 2' 72.6,CH 3.68,dd(9.6,8.4) 1' 3' 73.3,C     4' 75.9,CH 3.15,d(7.8) 2',3' 5' 70.8,CH 4.52,q(6.6)   6' 17.2,CH3 1.01,d(6.0) 4',5' 1'' 67.7,CH 4.92,qd(6.6) 7,9 2'' 25.7,CH3 1.43,d(6.6) 8,1'' 3'-CH3 24.0,CH3 1.25,s 2',3',4' 10-OCH3 56.8,CH3 4.13,s 10 12-OCH3 56.5,CH3 4.11,s 12 1-OH   9.82,s 1,2,12a, 2'-OH   4.20,d(8.4)   3'-OH   4.22,s 4' 4'-OH   4.63,d(7.8)   1''-OH   5.55,d(4.2)   2''-OH      

表7化合物G的归属情况 

position δC,mult. δH(Jin Hz) HMBC(¹H-¹³C)>1 153.2,C     2 112.0,CH 6.97,d(8.4) 1,4,12a 3 129.3,CH 7.84,d(8.4) 1,4a,1' 4 128.1,C     4a 125.2,C     4b 142.3,C     6 159.9,C     6a 121.6,C     7 122.4,CH 7.80,d(1.2) 6,9,1'' 8 137.6,C     9 119.7,CH 7.49,d(1.2) 7,10a,1'' 10 156.9,C     10a 121.9,C     10b 113.2,C     11 101.6,CH 8.48,s 4b,10a,10b,12,12a 12 151.8,C    

[0152] 

12a 115.1,C     1' 74.6,CH 6.03,d(9.6) 3,4,4a,2',5' 2' 72.6,CH 3.67,dd(9.6,8.4) 4,1' 3' 73.1,C     4' 75.8,CH 3.14,d(7.8) 2',3',3'-CH3 5' 70.7,CH 4.51,q(6.6) 1',4',6' 6' 17.1,CH3 1.02,d(6.6) 4',5' 1'' 49.0,CH2 4.04,s 7,8,9,2'' 2'' 205.3,C     3'' 29.8,CH3 2.23,s 1'',2'' 3'-CH3 23.9,CH3 1.26,s 2',3',4' 10-OCH3 56.7,CH3 4.10,s   12-OCH3 56.3,CH3 4.12,s   1-OH   9.82,s 1,2,12a 2'-OH   4.18,d(8.4)   3'-OH   4.20,s   4'-OH   4.58,d(7.8)  

表8化合物J的归属情况 

以上结果表明：化合物A的结构式如式（I）所示，R₁为-CH₃；化合物B的结构式如式（I）所示，R₁为-CH=CH₂；化合物C的结构式如式（I）所示，R₁为-C₂H₅；化合物D的结构式如式（I）所示，R₁为-CH₂OH；化合物E的结构式如式（I）所示，R₁为-C₂H₄OH；化合物F的结构式如式（I）所示，R₁为-CH(OH)CH₃；化合物G的结构式如式（I）所示，R₁为-CH₂COCH₃；化合物J的结构式如式（II）所示。 

6、旋光值 

化合物旋光值的测试仪器为Perkin-Elmer Model343polarimeter。采用钠光谱D线（589.3nm）测定，测定管长度1dm。步骤三制备得到的各个化合物的旋光值见表9。 

表9步骤三制备得到的各个化合物的旋光值 

化合物 溶剂 浓度（g/100ml） 比旋度 A 甲醇 0.16 -5.6° B 甲醇 0.045 -4.4° C 甲醇 0.05 -20.0° D 甲醇 0.06 -15.0° E 甲醇 0.025 0°

 

F 甲醇 0.025 -20.0° G 甲醇 0.025 +32.0° J 甲醇 0004 -425°

实施例3、检测化合物抗细菌的活性 

MHB培养基：称取24克Mueller-Hinton Broth干粉，溶解于1000毫升蒸馏水，调pH至7.2，121℃灭菌20分钟。Mueller-Hinton Broth：北京奥博星生物技术有限责任公司。万古霉素：美国Amresco公司。四环素：购自美国Amresco公司。环丙沙星：购自美国Amresco公司。氯霉素：购自美国Amresco公司。 

一、制备菌液 

通过血球计数板计数，用MHB培养基将细菌制备成（2-5）×10⁵个细胞/mL的菌液。分别采用以下几种细菌：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、大肠杆菌和肺炎链球菌。 

二、制备待测溶液 

以无菌DMSO为溶剂将化合物配制为4mg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的稀释液。分别采用以下化合物：化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G和化合物J。 

以无菌DMSO为溶剂将阳性对照药物配制为320μg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL的稀释液。分别采用以下阳性对照药物：万古霉素（在对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行检测时作为阳性对照药物）、四环素（在对枯草芽孢杆菌进行检测时作为阳性对照药物）、环丙沙星（在对铜绿假单孢菌和大肠杆菌进行检测时作为阳性对照药物）、氯霉素（在对肺炎链球菌进行检测时作为阳性对照药物）。 

三、测定化合物抑制细菌的最小抑菌浓度 

1、取无菌96孔细胞培养板，每孔加入40μL MHB培养基。 

2、取完成步骤1的96孔细胞培养板，分组处理如下： 

阳性对照组（每种阳性对照药物7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的7个稀释度的阳性对照药物稀释液； 

实验组（每种化合物7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的化合物稀释液； 

阴性对照组（7个孔）：分别加入2μL无菌DMSO。 

3、取完成步骤2的96孔细胞培养板，每孔加入40μL步骤一得到的菌液，37℃培养16小时后观察各孔中细菌的生长状况：如该孔中呈混浊状态（见图4A），说明相应浓度的化合物无抗细菌活性；如该孔中呈澄清状态（见图4B），说明相应浓度的化合物具有抗细菌活性。对于每个化合物，细菌生长被完全抑制的孔所对应的化合物终浓度（所加入的稀释液中的化合物浓度/40）即为该化合物对细菌的最低抑菌浓度，MIC值。 

化合物抗细菌的活性检测结果见表10。 

表10各个化合物的抗细菌活性检测结果（MIC值，μg/ml） 

实施例4、检测化合物抗分枝杆菌的活性 

7H9培养基培养基：取4.7gMiddlebrook 7H9Broth培养基粉末（美国BD公司）、2mL甘油、0.5mL Tween80、900mL水和100mL Middlebrook OADC Enrichment（美国BD公司），充分混合，经0.22um孔径无菌滤膜过滤灭菌。 

异烟肼：购自Sigma-Aldrich公司。利福平：购自Sigma-Aldrich公司。 

一、制备菌液 

将分枝杆菌接种至7H9培养基，37℃、60rpm振荡培养，直至OD_600nm为0.50-0.55。分别采用如下几种分枝杆菌：牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌。 

二、制备待测溶液 

以无菌DMSO为溶剂将化合物配制为4mg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的稀释液。分别采用以下化合物：化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G和化合物J。 

以无菌DMSO为溶剂将阳性对照药物配制为320μg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL的稀释液。分别采用以下阳性对照药物：异烟肼（在对牛分枝杆菌和耻垢分枝杆菌进行检测时作为阳性对照药物）、利福平（在对结核分枝杆菌进行检测时作为阳性对照药物）。 

三、测定化合物抑制分枝杆菌的最小抑菌浓度 

1、取96孔细胞培养板，每孔加入40μL 7H9培养基。 

2、取完成步骤1的96孔细胞培养板，分组处理如下： 

阳性对照组（每种阳性对照药物7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的7个稀释度的阳性对照药物稀释液； 

实验组（每种化合物7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的化合物稀释液； 

阴性对照组（7个孔）：分别加入2μL无菌DMSO。 

3、取完成步骤2的96孔细胞培养板，每孔加入40μL步骤一得到的菌液，37℃培养96小时后观察各孔中分枝杆菌的生长状况：如该孔中呈混浊状态，说明相应浓度的化合物无抗分枝杆菌活性；如该孔中呈澄清状态，说明相应浓度的化合物具有抗分枝杆菌活性。对于每个化合物，分枝杆菌生长被完全抑制的孔所对应的化合物终浓度（所加入的稀释液中的化合物溶液浓度/40）即为该化合物对分枝杆菌的最低抑菌浓度，MIC值。 

化合物抗分枝杆菌的活性检测结果见表11。 

表11各个化合物的抗分枝杆菌活性检测结果（MIC值，μg/ml） 

实施例5、检测化合物抗白色念珠菌的活性 

RPMI Media1640:美国Gibco公司。酮康唑:美国sigma公司。 

一、制备菌液 

通过血球计数板计数，用RPMI Media1640培养基将白色念珠菌制备成（2-5）×10⁵个细胞/mL的菌液。 

二、制备待测溶液 

以无菌DMSO为溶剂将化合物配制为4mg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的稀释液。分别采用以下化合物：化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G和化合物J。 

以无菌DMSO为溶剂将阳性对照药物配制为320μg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL的稀释液。采用以下阳性对照药物：酮康唑（在对白色念珠菌进行检测时作为阳性对照药物）。 

三、测定化合物抑制白色念珠菌的最小抑菌浓度 

1、取96孔细胞培养板，每孔加入40μL RPMI Media1640培养基。 

2、取完成步骤1的96孔细胞培养板，分组处理如下： 

阳性对照组（7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的7个稀释度的阳性对照药物稀释液； 

实验组（每种化合物7个孔）：分别加入2μL步骤二制备的化合物稀释液； 

阴性对照组（7个孔）：分别加入2μL无菌DMSO。 

3、取完成步骤2的96孔细胞培养板，每孔加入40μL步骤一得到的菌液，37℃培养16小时后观察各孔中白色念珠菌的生长状况：如果该孔中呈混浊状态，说明相应浓度的化合物无抗白色念珠菌活性；如果该孔中呈澄清状态，说明相应浓度的化合物具有抗白色念珠菌活性。对于每个化合物，白色念珠菌生长被完全抑制的孔所对应的化合物终浓度（所加入的稀释液中的化合物溶液浓度/40）即为该化合物对白色念珠菌的最低抑菌浓度，MIC值。 

化合物抗白色念珠菌的活性检测结果见表12。 

表12各个化合物的抗白色念珠菌活性检测结果（MIC值，μg/ml）